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反义及小干扰rna对大鼠肝星状细胞金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的抑制作用

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中华肝脏病杂志 2006年第10期14卷 742-747页

作者：丛敏王萍刘天会徐雍卢炎唐淑珍刘晓明王宝恩贾继东尤红首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心北京100050

目的观察以腺相关病毒(AAV)为载体,含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1的反义rna及小干扰rna(sirna)的重组AAV(rAAV/ANTI-TIMP-1/neo及rAAV/sirna-TIMP-1/neo)感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6后,TIMP-1表达的受抑制情况。方法经聚合酶链反应(PCR)扩增及酶切后连接,将针对TIMP-1的反义rna片段及sirna片段分别构建于AAV载体中并测序鉴定,将其包装成重组病毒后感染大鼠肝星状细胞系HSC- T6,同时设空白对照组。经G418以400μg/ml的浓度筛选30d后,分别应用荧光定量PCR技术及Western blot检测重组病毒感染组及空白对照组HSC-T6 TIMP-1的基因转录及蛋白质表达水平。结果经PCR、酶切及序列测定证实,两种重组AAV载体质粒(pd16-95/ANTI-TIMP-1/neo和pd16-95/sirna-TIMP—1/neo)克隆成功。将重组质粒包装成病毒感染HSC-T6细胞30 d后,通过荧光定量PCR技术及Western blot分析显示,重组病毒rAAV/sirna-TIMP- 1/neo组与对照组细胞相比,HSC-T6中的TIMP-1基因的转录被抑制(P＜0．01),且表达水平与对照组相比约下降60%；而rAAV/ANTI-TIMP-1/neo组及空载体组与对照组相比TIMP-1基因的转录及表达水平差异无统计学意义(P＞0．05)。结论通过AAV载体技术重组病毒rAAV/sirna-TIMP-1/neo可有效地抑制TIMP-1基因的表达,而针对TIMP-1基因全长的重组病毒rAAV/ANTI-TIMP-1/neo对体外培养的HSC-T6细胞TIMP-1基因的转录与表达无明显抑制作用。

关键词：金属蛋白酶组织抑制因子-1 rna,反义小干扰rna 腺相关病毒肝星状细胞

磷酸受纳蛋白反义rna转染减轻心肌梗死后心室重塑和心力衰竭的发生

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中华医学杂志 2010年第20期90卷 1389-1394页

作者：汪国忠吕树铮柳景华郭成军周渊苑飞宋现涛郭长江金泽宁首都医科大学附属北京安贞医院心内科北京市心肺血管疾病研究所 100029

目的探讨磷酸受纳蛋白反义rna真核表达质粒转染心肌对心肌梗死后心脏功能及病理性心室重塑的影响.方法 Wistar大鼠70只,分为生理盐水组（28只）,假手术组（13只）,冠状动脉结扎制备大鼠心肌梗死后心力衰竭模型,直接心肌注射转染磷酸受... 详细信息

目的探讨磷酸受纳蛋白反义rna真核表达质粒转染心肌对心肌梗死后心脏功能及病理性心室重塑的影响.方法 Wistar大鼠70只,分为生理盐水组（28只）,假手术组（13只）,冠状动脉结扎制备大鼠心肌梗死后心力衰竭模型,直接心肌注射转染磷酸受纳蛋白反义rna真核表达质粒（PcDNA4-asPLB组,29只）,评价假手术组、生理盐水组及PcDNA4-asPLB组心脏舒缩功能及血流动力学改变.检测各组大鼠心肌磷酸受纳蛋白（PLB）、肌浆网Ca^2＋ATP酶（SERCA2a）蛋白表达水平及心房尿钠肽（ANP）及脑型尿钠肽（BNP）mrna表达;病理检查分析各组大鼠心肌梗死面积、前壁变薄比、心肌细胞横径及纤维沉积状况.结果超声心动图及血流动力学检测发现心肌梗死后PcDNA4-asPLB组大鼠心脏舒缩功能及血流动力学明显优于生理盐水组,尤以心肌梗死后第4周更为明显[左室射血分数（39.4±7.8）%比（30.9±7.4）%,P〈0.05;压力变化的最大值（1545±127）mm Hg·s^-1比（1172±91）mm Hg·s^-1,P〈0.05].PcDNA4-asPLB组PLB表达明显受抑,仅为生理盐水组的50%（PLB/β-肌动蛋白比值,0.28±0.07比0.57±0.11,P〈0.05）,SERCA2a表达较生理盐水组增强[（1.47±0.21）μmol·min^-1·g^-1蛋白比（0.34±0.13）μmol·min^-1·g^-1蛋白,P〈0.05].生理盐水组前壁变薄比、心肌细胞横径、纤维沉积及胚胎基因表达等心室重塑改变较PcDNA4-asPLB组明显.结论 PcDNA4-asPLB转染抑制PLB表达,减轻和逆转心肌梗死后心室重塑,延缓心肌梗死后心力衰竭的发生.

关键词：心肌梗死心力衰竭,充血性 rna,反义磷酸受纳蛋白

脑源性神经营养因子-反义长链非编码rna过表达可抑制肝癌细胞的增殖和侵袭

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肿瘤 2017年第8期37卷 817-823,845页

作者：郭大伟赵旭鹏初晨江宏伟周勇中国医科大学附属第四医院普外四科辽宁沈阳110032

目的:探讨脑源性神经营养因子-反义长链非编码rna(brain-derived neurotrophic factor-antisense long non-coding rna,BDNF-AS)对人肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:将携带BDNF-AS基因的重组慢病毒分别感染肝癌细胞系HepG2和97-H后,采用RT-PCR法检测肝癌细胞中BDNF-AS和BDNF mrna的表达水平变化。分别采用EdU掺入实验、AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染和Transwell小室法检测BDNF-AS过表达对HepG2和97-H细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。结果:感染携带BDNF-AS基因的重组慢病毒后,肝癌HepG2和97-H细胞中BDNF-AS的表达水平均明显升高(P值均rna的表达水平明显降低(P0.05),但细胞增殖率明显降低(P<0.05,P=0.001),侵袭细胞数明显减少(P值均<0.000 1)。结论:BDNF-AS过表达可能对肝癌细胞的生长和侵袭具有重要的负调控作用。

关键词：癌,肝细胞脑源性神经营养因子 rna,长链非编码 rna,反义细胞增殖细胞侵袭

重组腺病毒介导MRP反义rna逆转人肝癌细胞多药耐药表型的体外实验研究

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中华医学杂志 2005年第38期85卷 2719-2723页

作者：陈琳严律南苟兴华李德华韩蕾南京医科大学第一附属医院普外科 210029 四川大学华西医院普外科成都地奥制药集团有限公司基因工程药物研究室

目的探讨重组腺病毒介导的多药耐药相关蛋白(MRP)反义rna对阿霉素诱导的人肝癌耐药细胞株SMMC-7721/ADM多药耐药表型的体外逆转作用。方法应用自行构建的携带反义MRP的重组腺病毒(Ad-Asm rp),在体外转染人肝癌耐药细胞,测定转染后细胞... 详细信息

目的探讨重组腺病毒介导的多药耐药相关蛋白(MRP)反义rna对阿霉素诱导的人肝癌耐药细胞株SMMC-7721/ADM多药耐药表型的体外逆转作用。方法应用自行构建的携带反义MRP的重组腺病毒(Ad-Asm rp),在体外转染人肝癌耐药细胞,测定转染后细胞对阿霉素(ADM)及柔红霉素(DNR)的半数致死量(IC50)并计算耐药倍数(RF值);在转染后不同时间点用流式细胞仪动态测定细胞对DNR摄取的变化及细胞膜表面P190表达、并用RT-PCR反映细胞MRP之mrna水平的变化。结果携带MRP反义rna的重组腺病毒转染后的人肝癌耐药细胞对ADM、DNR的IC50分别为0.487μg/m l、0.328μg/m l,RF值分别为97.4、109.3,RF值分别下降36.8和35.4。在转染后24 h,MRP mrna水平开始下降并呈持续下降趋势(P反义rna可有效封闭MRP基因表达,在体外实验中能增加人肝癌耐药细胞株对化疗药物的敏感性,对肝癌耐药细胞的MDR表型有较好的逆转作用。

关键词：抗药性,多药 rna,反义肝肿瘤重组腺病毒 MRP基因表达多药耐药相关蛋白重组腺病毒介导人肝癌细胞体外实验研究反义rna

草酸铂、5-氟尿嘧啶联合多药耐药基因反义rna对耐药直肠癌细胞杀伤作用的研究

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中华外科杂志 2006年第11期44卷 770-773页

作者：陈纲李世拥于波安平蔡慧芸北京军区总医院普通外科 100700

目的应用基因克隆技术,将多药耐药基因(multidrugresistancegene,MDR1)反义rna转染入对氟尿嘧啶(5-FU)耐药直肠癌细胞(8348R)中,封闭正义MDR1的转录和表达,联合应用草酸铂及5-FU共同作用于8348R,观察其联合杀伤作用。方法构建含MDR1反义... 详细信息

目的应用基因克隆技术,将多药耐药基因(multidrugresistancegene,MDR1)反义rna转染入对氟尿嘧啶(5-FU)耐药直肠癌细胞(8348R)中,封闭正义MDR1的转录和表达,联合应用草酸铂及5-FU共同作用于8348R,观察其联合杀伤作用。方法构建含MDR1反义rna的真核表达质粒PC-MDR1;以绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)基因作为报告基因,观察在草酸铂作用下GFP基因对8348R细胞的转染效率,用克隆形成试验观察草酸铂对PC-MDR1质粒转染8348R细胞的影响;用MTT试验检测草酸铂联合5-FU及MDR1反义rna对8348R细胞的杀伤效率。结果转染PC-MDR1质粒后,8348R细胞在5-FU作用下较转染前活性明显下降,转染后细胞出现明显的S期和G2/M期阻滞,细胞凋亡比例显著升高;草酸铂将PC-MDR1质粒对直肠癌细胞的转染效率提高18倍,IC50剂量草酸铂、5-FU联合MDR1反义rna可大大提高对8348R细胞的杀伤效率,总体杀伤效率可达到75%。结论应用草酸铂、5-FU联合MDR1反义rna对直肠癌耐药细胞的协同杀伤作用,可望成为治疗对5-FU耐药的直肠癌的有效方法。

关键词：直肠肿瘤双月安环己烷草酸铂氟尿嘧啶 rna,反义多药耐药

转染反义微小rna-155对人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431生长的影响

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中华皮肤科杂志 2018年第3期51卷 194-198页

作者：时磊魏明师广勇刘佳龚艳杰陈河涛梁颖红涂玲郑州大学第五附属医院药学部 450052 郑州大学第五附属医院检验科 450052

目的观察转染反义微小rna？155（mirna-155）对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株增殖、凋亡以及细胞迁移和侵袭的影响。方法 A431细胞分为3组，采用脂质体介导法转染无义序列mirna-155（无义序列组）、反义序列 mirna-155（反义序列组）或... 详细信息

目的观察转染反义微小rna？155（mirna-155）对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株增殖、凋亡以及细胞迁移和侵袭的影响。方法 A431细胞分为3组，采用脂质体介导法转染无义序列mirna-155（无义序列组）、反义序列 mirna-155（反义序列组）或仅用含Lipofectamine 2000的DMEM（空白对照组）处理。实时定量聚合酶链反应检测转染后各组A431细胞mirna-155的表达水平，噻唑蓝法检测转染后24、36、72、96、120 h细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞周期变化和凋亡情况，Transwell法检测细胞迁移与侵袭力。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。结果转染后，无义序列组、反义序列组与空白对照组中A431细胞mirna-155相对表达量分别为0.98 ± 0.02、0.28 ± 0.18、1.00 ± 0.01，3组差异有统计学意义（F = 634.57，P 〈 0.001），反义序列组低于空白对照组和无义序列组，均P 〈 0.05。孵育72、96、120 h时，3组细胞存活率差异均有统计学意义（均P 〈 0.05），反义序列组细胞存活率在3个时间点均低于空白对照组和无义序列组（均P 〈 0.05）；3组细胞G0/G1期细胞比例、S期细胞比例、细胞增殖指数差异均有统计学意义（F = 23.46、36.81、19.35，P 〈 0.01）。反义序列组G0/G1期细胞比例（74.63% ± 2.13%）高于空白对照组（62.92% ± 2.56%）和无义序列组（63.75% ± 3.06%），均P 〈 0.05；S期细胞比例及细胞增殖指数（9.88% ± 1.83%、25.36 ± 2.13）低于空白对照组（18.86% ± 2.78%、37.08 ± 2.56）和无义序列组（18.33% ± 3.72%、36.25 ± 3.06），均P 〈 0.05；反义序列组迁移细胞数和侵袭细胞数低于空白对照组和无义序列组（均P 〈 0.05）。结论皮肤鳞状细胞癌A431细胞转染反义mirna-155可减少mirna-155的表达，有效抑制A431细胞增殖、迁移、侵袭，促进其凋亡。

关键词：癌,鳞状细胞微rnas rna,反义细胞增殖细胞凋亡

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中国病理生理杂志 2010年第A10期26卷 1928-1930,1939页

作者：李江胡申江浙江大学医学院附属第一医院急救中心浙江杭州310003 浙江大学医学院附属第一医院心血管内科浙江杭州310003

目的:构建磷酸受纳蛋白(PLB)反义rna腺相关病毒载体(rAAV-asPLB),建立糖尿病(DM)大鼠模型。直接心肌注射rAAV-asPLB,观察其对DM大鼠心肌PLB基因转录和蛋白表达的影响,以及对心肌肌浆网Ca2+-ATPase活性的作用。方法:利用质粒辅助重组腺... 详细信息

目的:构建磷酸受纳蛋白(PLB)反义rna腺相关病毒载体(rAAV-asPLB),建立糖尿病(DM)大鼠模型。直接心肌注射rAAV-asPLB,观察其对DM大鼠心肌PLB基因转录和蛋白表达的影响,以及对心肌肌浆网Ca2+-ATPase活性的作用。方法:利用质粒辅助重组腺相关病毒系统试剂盒构建rAAV-asPLB。腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导DM大鼠模型,将实验动物分为4组:正常组、DM组、盐水组和rAAV-asPLB组。盐水或rAAV-asPLB注射后6周,RT-PCR检测心肌PLBmrna转录;Westernblotting检测PLB蛋白表达水平;检测心肌肌浆网Ca2+-ATPase活性。结果:(1)成功构建rAAV-asPLB,诱导出DM大鼠模型。(2)DM组和盐水组PLBmrna水平均高于正常组;rAAV-asPLB组PLBmrna水平较DM组和盐水组明显降低。(3)DM组和盐水组PLB蛋白水平均高于正常组;rAAV-asPLB组PLB蛋白水平较DM组和盐水组明显降低。(4)肌浆网Ca2+-ATPase活性在DM组和盐水组中较正常组明显降低,而rAAV-asPLB组较DM组和盐水组升高。结论:rAAV-asPLB抑制DM大鼠心肌PLB表达,增强Ca2+-ATPase活性。

关键词：糖尿病磷酸受纳蛋白 rna,反义肌浆网Ca2+-ATPase

超声破裂载基因微泡增强心肌细胞受磷蛋白反义rna转染

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中华超声影像学杂志 2010年第10期19卷 897-900页

作者：汪国忠柳景华吕树铮郭成军张英川苑飞宋现涛周渊葛长江首都医科大学附属北京安贞医院心内科北京心肺血管病研究所北京100029

目的探讨超声破裂载基因微泡增强心肌细胞反义rna转染与表达的效应.方法构建受磷蛋白（phospholamban,PLB）反义rna真核表达质粒PcDNA 4.1-asPLB,采用磷酸钙共沉淀、超声辐照及超声破裂载基因微泡等方法介导反义rna转染.采用RT-PCR及W... 详细信息

目的探讨超声破裂载基因微泡增强心肌细胞反义rna转染与表达的效应.方法构建受磷蛋白（phospholamban,PLB）反义rna真核表达质粒PcDNA 4.1-asPLB,采用磷酸钙共沉淀、超声辐照及超声破裂载基因微泡等方法介导反义rna转染.采用RT-PCR及Western blot检测心肌细胞PLB、肌浆网钙ATP酶（sarcoplasmic retculum Ca2＋ATPase,SERCA2a）mrna和蛋白表达水平,观察不同方法介导PLB反义rna转染对心肌细胞PLB及SERCA2a表达的影响.结果与空载体PcDNA4.1比较,PcDNA4.1-asPLB能特异地抑制心肌细胞PLB表达（P＜0.05）.超声破裂载基因微泡明显增强反义rna转染与表达,与其他转染组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）.PcDNA4.1-asPLB对SERCA2a表达无明显影响,但降低PLB/SERCA2a比值.结论超声破裂载基因微泡是一种高效的反义rna转染方法,其介导PcDNA4.1-asPLB转染能明显抑制心肌细胞PLB表达.

关键词：超声检查微气泡 rna,反义转染受磷蛋白

表达载体介导的反义rna抑制人巨噬细胞移动抑制因子的表达

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中国病理生理杂志 2006年第7期22卷 1263-1267页

作者：单志新林秋雄余细勇邓春玉杨敏符永恒谭虹虹郑猛林曙光广东省人民医院医学研究中心

目的:研究表达载体介导的反义rna对人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)表达的抑制作用。方法:用亚克隆技术构建可转录MIF反义rna的真核表达载体pcDNA3-antiMIF。用lipofectamine2000分别将pcDNA3、pcDNA3-antiMIF转染可表达MIF的HEK293(293-M... 详细信息

目的:研究表达载体介导的反义rna对人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)表达的抑制作用。方法:用亚克隆技术构建可转录MIF反义rna的真核表达载体pcDNA3-antiMIF。用lipofectamine2000分别将pcDNA3、pcDNA3-antiMIF转染可表达MIF的HEK293(293-MIF)细胞,用Real-time定量PCR鉴定MIFmrna表达水平。将pcDNA3-antiMIF转化人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),建立可表达MIF反义rna的HUVECs(HUVECs-antiMIF)细胞。将MIF的真核表达载体pSecTag-MIF转染HUVECs-antiMIF,用Real-time定量PCR鉴定MIFmrna的表达水平。结果:正确构建了MIF反义rna的表达载体pcDNA3-antiMIF。MIF反义rna对293-MIF细胞中MIF表达的抑制水平达32%(P反义rna的HUVECs-antiMIF细胞株。HUVECs-antiMIF中MIF的表达受到抑制,表达水平降低40%(P反义rna能有效地抑制MIF的表达,建立了稳定表达MIF反义rna的HUVECs。

关键词：巨噬细胞游走抑制因子 rna,反义人脐静脉血管内皮细胞脂质体