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rna聚合酶ⅲ在HeLa细胞核中转录位点的研究

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RNA聚合酶Ⅲ在HeLa细胞核中转录位点的研究

作者：尹江梅首都师范大学

学位级别：硕士

真核生物细胞核中有三种rna聚合酶，即rna聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，它们分别转录产生不同的rna，其中rna聚合酶Ⅰ(pol Ⅰ)转录合成45Srrna前体;聚合酶Ⅱ(pol Ⅱ)转录合成mrna前体及大多数sn rna;聚合酶Ⅲ(pol Ⅲ)转录合成5Srrna、trna和一些... 详细信息

真核生物细胞核中有三种rna聚合酶，即rna聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，它们分别转录产生不同的rna，其中rna聚合酶Ⅰ(pol Ⅰ)转录合成45Srrna前体;聚合酶Ⅱ(pol Ⅱ)转录合成mrna前体及大多数sn rna;聚合酶Ⅲ(pol Ⅲ)转录合成5Srrna、trna和一些小分子rna。自上个世纪八十年代初期，人们相继运用细胞化学染色、电镜放射自显影等进行研究的结果表明：rna聚合酶ⅲ的转录发生在核质中，但随着新的研究技术的发展和应用，人们却发现rna聚合酶ⅲ的转录可能发生在核仁中，从而对早期的研究结果提出了质疑。但迄今为止，还没有直接的证据支持这一结论。本实验以人的HeLa细胞为材料，运用电击转染、荧光原位杂交并结合激光共聚焦显微镜，从DNA、rna和DNA-rna三个水平对rna聚合酶ⅲ的转录位点及其转录子的分布进行研究。结果如下：DNA水平荧光原位杂交结果显示，81％的DNA位于核仁内部及其核仁周边区域，19％的位于核质中;rna水平荧光原位杂交结果表明，22％的rna位于核仁内，78％的位于核质及与核仁交界处;DNA-rna水平荧光原位杂交结果是，25％的DNA或rna位于核仁内，46％处于核仁周边，29％位于核质中。由此推测出，rna聚合酶ⅲ的转录主要发生在核仁及其周边区域。本实验为rna聚合酶ⅲ在真核生物细胞核中的转录位点提供了较为直接的证据，这对人们进一步了解rna聚合酶ⅲ的转录机制、加工和运输过程及三种rna聚合酶之间的结构与功能关系具有重要的意义。

关键词： rna聚合酶ⅲ 荧光原位杂交激光共聚焦显微镜转录位点 HeLa细胞核仁

酒精诱发乳腺癌过程中rna聚合酶ⅲ依赖基因转录与雌激素受体α表达的关系

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广东医学 2016年第1期37卷 66-68页

作者：张青松曹立赢钟烁温英武高建超王明君费乐学郑景珍王瑜开滦总医院普外科河北唐山063000 开滦总医院耳鼻喉科河北唐山063000 开滦总医院泌尿外科河北唐山063000

目的探讨酒精诱发乳腺癌的分子机制。方法采用RealtimePCR方法分析酒精对雌激素受体d（ERd）不同表达状况的乳腺细胞系、酒精联合雌激素MCF-7细胞系以及酒精对转染EROcsirna的MCF-7细胞系的rna聚合酶ⅲ依赖基因（trnas、5Srrna）的转录... 详细信息

目的探讨酒精诱发乳腺癌的分子机制。方法采用RealtimePCR方法分析酒精对雌激素受体d（ERd）不同表达状况的乳腺细胞系、酒精联合雌激素MCF-7细胞系以及酒精对转染EROcsirna的MCF-7细胞系的rna聚合酶ⅲ依赖基因（trnas、5Srrna）的转录水平。结果酒精对ER＋乳腺细胞系trnas、5Srrna上调水平（7～8倍）明显高于ER-乳腺细胞系（2～3倍）（P〈0．01）；酒精和雌激素联合处理对MCF-7细胞系tR-NAs、5Srrna的转录水平的上调作用（12-14倍）明显高于酒精（7～8倍）或雌激素（2—3倍）单独作用组（P〈0．01）；酒精对转柒ERdsirna组MCF-7细胞系（2～3倍）trnas、5Srrna的转录水平的上调作用明显低于未转染组（6～8倍）（P〈0．01）。结论酒精诱发乳腺癌过程中rna聚合酶ⅲ依赖基因转录水平的上调依赖于ERa的表达。

关键词：酒精乳腺癌 rna聚合酶ⅲ 雌激素受体

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Maf1:一种rna聚合酶ⅲ的负调节因子

生命的化学 2008年第5期28卷 553-555页

作者：郭晓强周强解放军白求恩军医学院生化教研室石家庄050081

Maf1是一种rna聚合酶ⅲ的负调节因子,在酵母雷帕霉素诱导的营养限制、DNA损伤和分泌通路缺陷反应过程中发挥重要作用。在不利生长条件下,Maf1被蛋白磷酸酶2A脱磷酸化而激活,被运输到细胞核发挥对rna聚合酶ⅲ的抑制作用。Maf1还可以被蛋... 详细信息

Maf1是一种rna聚合酶ⅲ的负调节因子,在酵母雷帕霉素诱导的营养限制、DNA损伤和分泌通路缺陷反应过程中发挥重要作用。在不利生长条件下,Maf1被蛋白磷酸酶2A脱磷酸化而激活,被运输到细胞核发挥对rna聚合酶ⅲ的抑制作用。Maf1还可以被蛋白激酶A磷酸化并在Msn5载体蛋白的协助下运出细胞核而解除抑制。Maf1在真核生物中高度保守,因此相关研究在理解哺乳动物rna聚合酶ⅲ转录抑制机理方面可能有重要意义。

关键词： Maf1 rna聚合酶ⅲ 负调节因子

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rna聚合酶ⅲ启动子的结构与功能

生命的化学 2000年第2期20卷 80-81页

作者：糜军汤宇澄陈诗书上海第二医科大学分子生物学实验室上海200025

rna聚合酶ⅲ(polⅢ)是真核生物催化合成trna和5S rrna及一些核小rna和胞质rna必需的酶.rna聚合酶ⅲ能够识别trna基因中一些高度保守的特征性DNA序列而启动下游DNA的转录,这些序列称为rna聚合酶ⅲ启动子.

关键词： rna聚合酶ⅲ 启动子结构功能

rna聚合酶ⅲ基因转录起始因子的相互作用与调节

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RNA聚合酶Ⅲ基因转录起始因子的相互作用与调节

rna聚合酶ⅲ在高等动物细胞核中转录位点的研究

中国科协第五届青年学术年会

作者：廖燕玲爱因斯坦医学院生物化学系

成长细胞中大于80%的基因转录都用于生成与蛋白质合成相关的rna,如rna聚合酶ⅲ合成的trna和5Srrna,rna聚合酶Ⅰ合成的其他rrna,以及核糖体蛋白质rna。由于tR-

关键词： rna聚合酶ⅲ TFⅢB TPR

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RNA聚合酶Ⅲ在高等动物细胞核中转录位点的研究

HMGB1在rna聚合酶ⅲ识别poly（dA-dT）中的作用及机制

中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会

作者：张飞雄韩玉波尹江梅首都师范大学生物系

真核细胞的细胞核中具有三种不同的rna聚合酶,分别是rna聚合酶Ⅰ、rna聚合酶Ⅱ和rna聚合酶ⅲ。在细胞中它们的功能各不相同:rna聚合酶Ⅰ负责催化生成5.8S、18S和28S rrna,rna聚合酶Ⅱ负责mrna的转录合成,而rna聚合酶ⅲ则负责催化5S rrna... 详细信息

真核细胞的细胞核中具有三种不同的rna聚合酶,分别是rna聚合酶Ⅰ、rna聚合酶Ⅱ和rna聚合酶ⅲ。在细胞中它们的功能各不相同:rna聚合酶Ⅰ负责催化生成5.8S、18S和28S rrna,rna聚合酶Ⅱ负责mrna的转录合成,而rna聚合酶ⅲ则负责催化5S rrna、trna、多数的Sn rna以及某些病毒基因(如VA基因)的转录。早在80年代初期人们即对这三种rna聚合酶在细胞核中的转录位点进行了研究。当时的研究结果显示:rna聚合酶Ⅰ的转录发生在核仁内,rna聚合酶Ⅱ和rna聚合酶ⅲ位于核质中。目前有关rna聚合酶Ⅰ和rna聚合酶Ⅱ的转录位点已经研究得较为透彻并且也得

关键词： rna聚合酶ⅲ 荧光原位杂交转录位点核仁激光共聚焦显微镜

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HMGB1在RNA聚合酶Ⅲ识别poly（dA-dT）中的作用及机制

作者：范兴娟苏州大学

学位级别：硕士

研究发现，外源及自身DNA可通过胞内DNA感受器启动固有免疫应答[1]，近年来对新型DNA感受器的鉴定及其功能调控迅速成为免疫学领域的新兴方向和重要学术关注。在本研究中，为了探讨HMGB1在新型DNA感受器Pol Ⅲ识别外源DNA中的作用... 详细信息

研究发现，外源及自身DNA可通过胞内DNA感受器启动固有免疫应答[1]，近年来对新型DNA感受器的鉴定及其功能调控迅速成为免疫学领域的新兴方向和重要学术关注。在本研究中，为了探讨HMGB1在新型DNA感受器Pol Ⅲ识别外源DNA中的作用机制，我们首先通过Real-time PCR检测poly（dA-dT）刺激后细胞内HMGB1在mrna水平上的表达情况。结果显示，HMGB1在293T细胞内上调达40倍，在Raw264.7细胞中上调约7倍。接下来，我们分析了HMGB1在Pol Ⅲ识别poly（dA-dT）产生IFN-β中的作用。当使用ML60218抑制剂特异性阻断Pol Ⅲ的活性后，IFN-β的表达水平显著下降，且呈现明显的剂量依赖性;当ML60218使用浓度为10μM时，IFN-β的表达相比未抑制组下调5倍左右，表明DNA感受器中Pol Ⅲ对IFN-β的产生发挥关键性作用。随后，我们通过调控细胞内HMGB1的表达量来探讨其在PolⅢ-RIG-I通路中作用。在HMGB1上调表达过程中，因HMGB1的本底表达水平较高，我们未观察到HMGB1对IFN-β产生的影响;在HMGB1下调表达过程中，我们以携带特异性shrna的慢病毒载体稳定下调HMGB1表达后发现，poly（dA-dT）刺激细胞产生IFN-β的能力大幅下降，约8倍左右，表明HMGB1参与了Pol Ⅲ对外源DNA的识别过程。为了进一步研究HMGB1和Pol Ⅲ在细胞内可能存在的相互作用，我们运用了免疫共沉淀技术和荧光共定位分析。免疫共沉淀实验中，我们以HMGB1为诱饵蛋白，检测免疫沉淀复合物中带有Flag标签Pol Ⅲ亚基POLR-3D的表达。结果显示，HMGB1与Pol Ⅲ不存在直接相互作用。但在荧光共定位实验中，我们发现带有不同荧光蛋白标签的Pol Ⅲ亚基POLR-3D和HMGB1，在293T和Raw264.7细胞内存在共定位，这一现象提示HMGB1可能通过间接结合方式调控了Pol Ⅲ对外源DNA的识别及下游I型干扰素的分泌过程。本研究着重探讨胞质DNA感受器识别外源DNA的调控机制，对于该机制的阐明不仅有助于我们发现胞质DNA启动下游固有免疫应答的关键节点，更有望为由DNA异常聚集诱导的自身免疫性疾病SLE的新型防治策略提供可能治疗靶点，因此具有重要的理论和实际应用价值。

关键词： HMGB1 型干扰素 rna聚合酶ⅲ Poly(dA-dT)

拟南芥中rna聚合酶ⅲ转录的AtR18非编码rna研究

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拟南芥中RNA聚合酶Ⅲ转录的AtR18非编码RNA研究

作者：杨贺东北林业大学

学位级别：硕士

非编码rna（non-coding rna,ncrna）是指生物基因组内不编码蛋白质的rna,曾被认为是与基因表达无关的“基因垃圾”。研究表明,大部分植物基因组被转录成非编码rna,它们通过与蛋白分子等相互结合,在转录、转录后及翻译水平开启或关闭基因... 详细信息

非编码rna（non-coding rna,ncrna）是指生物基因组内不编码蛋白质的rna,曾被认为是与基因表达无关的“基因垃圾”。研究表明,大部分植物基因组被转录成非编码rna,它们通过与蛋白分子等相互结合,在转录、转录后及翻译水平开启或关闭基因,实现调控靶基因表达的关键作用,影响植物萌发、花粉形成、新陈代谢等生理过程,并响应多种生物及非生物胁迫。AtR18 ncrna（151nt）是2012年在拟南芥（Arabidopsis thalina）中发现的由rna聚合酶ⅲ转录的非编码rna,目前尚未被报道。对拟南芥中AtR18ncrna进行研究,获得结果如下:*** blot法以及整体原位杂交法,AtR18 ncrna在拟南芥种子萌发阶段伸出胚轴尖端大量表达,并响应ABA、Mannitol等多种应激环境。2.构建AtR18 ncrna过表达拟南芥植物,统计了 ABA及Mannitol应激条件下,野生型拟南芥（Wt）及AtR18 ncrna过表达拟南芥（AtR18-1#、AtR18-3#）种子萌发率,发现AtR18ncrna过表达提高了拟南芥种子对ABA应激的敏感性,降低了拟南芥种子对干旱应激的敏感性。3.分析了 AtR18 ncrna3’端侧翼AtMYC1基因。AtMYC1基因在种子萌发期大量表达,并响应ABA、Mannitol等多种应激环境,统计了ABA及Mannitol应激条件下,野生型拟南芥（Wt）及atmyc1缺失突变体拟南芥（salk-15、cs-5）种子萌发率,发现atmyc1缺失突变体提高了拟南芥种子对ABA应激的敏感性,降低了拟南芥种子对干旱应激的敏感性。***18 ncrna可能抑制种子萌发,AtMYC1基因可能诱导种子萌发。AtMYC1基因通过影响了SnRK2.2、ABI3、EM1和EM6等ABA信号径路重要基因表达,响应ABA应激。AtR18 ncrna响应ABA及干旱胁迫的详细作用机制,以及二者是否具有转录干涉作用尚不明确,有待继续进行深入研究。

关键词： AtR18 ncrna 种子萌发 rna聚合酶ⅲ AtMYC1

RPS6KA2介导的rna聚合酶ⅲ指导的基因转录调节机制的研究

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RPS6KA2介导的RNA聚合酶Ⅲ指导的基因转录调节机制的研究

作者：张悦武汉科技大学

学位级别：硕士

背景真核生物的rna聚合酶ⅲ(Pol Ⅲ)负责合成细胞中的trna、5S rrna、7SLrna、U6 Snrna以及其它非编码rna。Pol Ⅲ产物在核糖体组装、蛋白质合成与运输、基因转录调节、代谢和细胞生长等过程中发挥着重要作用。Pol Ⅲ指导的基因转录的... 详细信息

背景真核生物的rna聚合酶ⅲ(Pol Ⅲ)负责合成细胞中的trna、5S rrna、7SLrna、U6 Snrna以及其它非编码rna。Pol Ⅲ产物在核糖体组装、蛋白质合成与运输、基因转录调节、代谢和细胞生长等过程中发挥着重要作用。Pol Ⅲ指导的基因转录的失调与肿瘤的发生和细胞增殖密切相关。核糖体蛋白S6激酶A2(RPS6KA2,别名RSK3)是丝氨酸/苏氨酸激酶RSK(核糖体S6激酶)家族的成员。该激酶包含两个不相同的激酶催化结构域,并通过磷酸化不同底物参与调节细胞生长和分化等多种生理生化活动。本实验室以前的研究结果表明,RPS6KA2促进Pol Ⅲ所指导的基因转录,但其中的调节机制还不清楚。本课题利用各种分子和生物学手段研究并揭示RPS6KA2介导的Pol Ⅲ基因转录调节机制。方法利用已构建的RPS6KA2 shrna、RPS6KA2-m Cherry慢病毒表达载体和包装质粒p H1和p H2转染293T细胞并包装病毒;随后利用获得的慢病毒转导He La和Hep G2细胞建立RPS6KA2敲低和过表达稳定细胞系。利用Western blot和RT-q PCR分别检测稳定细胞系中RPS6KA2和Pol Ⅲ产物的表达。细胞计数、Ed U、克隆形成实验和裸鼠成瘤实验分析RPS6KA2表达改变对细胞增殖活性的影响。染色质免疫沉淀(Ch IP),Western blot和RPS6KA2与p21双敲低实验探究RPS6KA2介导的Pol Ⅲ基因转录调节机制。结果RPS6KA2敲低抑制Pol Ⅲ指导的基因转录,RPS6KA2过表达则促进Pol Ⅲ产物的表达;说明RPS6KA充当Pol Ⅲ转录的激活子。增殖实验和成瘤实验结果表明,RPS6KA2在体内、体外促进肿瘤细胞增殖。利用RPS6KA2过表达的细胞系施加Pol Ⅲ抑制剂,结果显示,RPS6KA2介导的细胞增殖激活受Pol Ⅲ转录水平的影响。Ch IP-q PCR结果表明,RPS6KA2敲低降低Pol Ⅲ转录机械因子在Pol Ⅲ靶基因位点上的结合。Western blot结果显示,RPS6KA2能够抑制周期蛋白激酶抑制子p21的表达,而对大多数Pol Ⅲ转录调节相关的其它蛋白的表达无显著影响,或者差异调节某些所检测的蛋白。通过建立RPS6KA2和p21双敲细胞系和p21沉默细胞系敲低,RT-q PCR分析Pol Ⅲ产物显示,p21不仅参与调节RPS6KA2介导的Pol Ⅲ转录,也能独立调节Pol Ⅲ的转录。转染靶向p21 mrna的mirna模拟物可降低p21的表达和增加Pol Ⅲ产物的表达。rna免疫沉淀和RT-q PCR提示,RPS6KA2能够与细胞质中的mi R-95-3p互作。结论RPS6KA2能够与细胞质中的mi R-95-3p结合并影响mi R-95-3p的表达或稳定性;mi R-95-3p表达升高抑制p21的表达。p21表达抑制导致TBP、GTF3C2的表达增加从而促进Pol Ⅲ指导的基因转录。因此,RPS6KA2通过调节mi R-95-3p-p21-TBP/GTF3C2通路激活Pol Ⅲ指导的转录。这些发现为了解Pol Ⅲ指导的基因转录机制提供了新视角。

关键词： rna聚合酶ⅲ 基因转录 RPS6KA2 细胞增殖 p21