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鸡马立克氏病病毒流行毒株高代次细胞毒株Meq、rlorf4、rlorf12及132bpr基因变异分析

病毒学报 2009年第5期25卷 368-375页

作者：刘爱玲刘长军张艳萍李晶梅施维松闫福海张锋程志伟中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

根据鸡马立克氏病病毒（Marek′s disease virus,MDV）GA株的全基因组序列,设计合成了用于扩增MDVMeq、rlorf4、rlorf12及132bpr基因的引物,分别扩增4株MDV流行强毒株的高代次细胞毒株（L-SYp85C、L-MSp75C、L-CZp75C、L-ZYp75C）及相应亲本毒株（L-SY、L-MS、L-CZ、L-ZY）、MDV强毒J-1株、814疫苗株等10个毒株的Meq、rlorf4、rlorf12和132bpr基因。经克隆测序后,分析4个高代次细胞毒株中相应基因的变异,并与MDV强毒J-1株、814疫苗株及GenBank中已发表MDV毒株的相应序列进行比较。序列比对分析发现,L-CZp75C株Meq基因的第625位存在碱基C插入突变;L-ZYp75C株Meq基因第529位存在碱基C插入,且第602位缺失碱基T,从而致使Meq基因推导的相应氨基酸序列在第177~200位发生移码突变。L-SYp85C株rlorf4基因在第215~265位缺失51bp,致使该基因推导的氨基酸序列相应缺失17个氨基酸残基。分析rlorf12基因序列,发现L-MSp75C株在第67位存在碱基T缺失,814疫苗株在第18~86位缺失69 bp,缺失位置均位于复制起点（Origin of replication,,Ori）内;而L-ZYp75C毒株在rlorf12基因第168~174位存在独特的TGTTGGG碱基缺失。4个细胞高代次毒株的132 bpr基因的扩增结果表明,该基因在病毒基因组中的拷贝数明显增加,可达到10个拷贝以上。上述分析结果提示,4株MDV流行强毒株经体外连续传代后,MDV致瘤相关基因Meq、rlorf4、rlorf12和132bpr基因等发生了缺失突变或插入突变。

关键词：马立克氏病病毒 Meq rlorf4 rlorf12 132bpr

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马立克病毒流行毒株致弱及主要致瘤相关基因变异分析

马立克病毒流行毒株致弱及主要致瘤相关基因变异分析

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作者：刘爱玲中国农业科学院

学位级别：硕士

马立克氏病(Marek's Disease,MD)是鸡的一种高度传染性、淋巴细胞增生性疾病。其致病因子为血清1型的马立克氏病毒(Marek's Disease Virus,MDV)。MD的控制以疫苗免疫为主。近年来由于MDV毒力的增强,疫苗免疫失败的现象越来越多,因此,新... 详细信息

马立克氏病(Marek's Disease,MD)是鸡的一种高度传染性、淋巴细胞增生性疾病。其致病因子为血清1型的马立克氏病毒(Marek's Disease Virus,MDV)。MD的控制以疫苗免疫为主。近年来由于MDV毒力的增强,疫苗免疫失败的现象越来越多,因此,新型有效的MD疫苗的研究成为重点。传代致弱获得新型MD疫苗仍是一种重要方法,传代过程中MDV基因组中一些基因片段的改变与病毒毒力变化存在一定关系,这些基因的变异研究有助于毒株的毒力分析及疫苗株的筛选。本研究选用国内2006-2007年从东北、四川两地区免疫发病鸡群中分离的4株MDV流行强毒株,分别命名为L-SY、L-MS、L-CZ、L-ZY,经克隆纯化后,在鸡胚成纤维细胞(Chicken EmbryoFibroblast,CEF)传代培养至75-85代,获得了4株MDV高代次细胞毒株,即L-SYp85C、L-MSp75C、L-CZp75C、L-ZYp75C。在此基础上,研究了L-SYp85C、L-MSp75C毒株的体外生长特性、对SPF鸡的致病性和在羽髓中病毒载量的动态变化规律。同时对4株高代次细胞毒株的Meq、rlorf4、rlorf12及132bpr基因进行了变异分析。意在研究传代致弱对强毒株生物学特性及基因变异特性的影响,为新型而有效MD疫苗的研究提供理论依据。研究结果表明:1.L-SYp85C、L-MSp75C毒株在CEF上的适应性明显提升,表现为细胞病变面积增大,细胞之间有融合现象,细胞病变的形成时间缩短。L-SYp85C和L-MSp75C毒株以亲本毒株10倍剂量感染SPF鸡,感染12周后,无肿瘤形成;体重均值与对照组比较分析,差异不显著;AGP试验检测感染鸡只羽髓中抗原,结果均为阴性;TaqMan探针双重荧光定量PCR(fluorescentquantitative polymerase-chain reaction,FQ-PCR)方法检测感染鸡只羽髓中病毒载量均低于10～6 copies/10～6 cell,显著低于亲本毒株感染鸡羽髓中的病毒载量。说明这两个毒株经传代培养后毒株毒力已经弱化。2.4个高代次细胞毒株的Meq、rlorf4、rlorf12及132bpr基因等与毒株毒力相关基因序列的变异分析发现,L-CZp75C株Meq基因第625位有碱基C插入突变,使Meq基因在内的3个重叠基因(Meq、rlorf6和23KD)发生移码突变;L-ZYp75C株Meq基因第529位存在碱基C插入,且602位缺失碱基T,从而使Meq基因推导的氨基酸在177-200位发生移码突变;L-SYp85C株rlorf4基因215-265位存在51bp缺失,其推导氨基酸缺失17个;rlorf12基因序列分析发现,L-MSp75C株第67位有碱基T缺失和814疫苗株18-86位69个碱基的缺失,缺失位置位于复制原点(Origin of replication,Ori)内,而L-ZYp75C毒株在ORF的168-174位具有独特的“TGTTGGG”缺失;4个细胞高代次毒株132bpr的扩增结果表明,其在基因组中的拷贝数明显增加,可达到10个拷贝以上。研究表明,4株MDV流行强毒株经传代培养后,Meq、rlorf4、rlorf12和132bpr基因发生了不同程度的缺失或插入突变。本实验传代获得了4株MDV流行强毒株的高代次细胞毒株,对其弱化特性及与弱化相关的基因片段进行了系统研究,为MDV1的致病机制、流行变异、诊断和MD新疫苗的研制和筛选提供了实验和理论依据。

关键词：马立克病毒高代次细胞毒株 Meq rlorf4 rlorf12 132bpr 变异分析

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