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蛋白激酶riok2对呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞毒性的调控作用及机制分析

蛋白激酶RIOK2对呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞毒性的调控作用及机...

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作者：郜重丞扬州大学

学位级别：硕士

霉菌毒素是霉菌在一定条件下产生的有害次级代谢产物,其中有300多种可对人类健康和畜禽养殖造成严重威胁。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是由镰刀菌属产生的一种霉菌毒素,猪是对DON最敏感的农场动物,食入含有DON的饲料可导致... 详细信息

霉菌毒素是霉菌在一定条件下产生的有害次级代谢产物,其中有300多种可对人类健康和畜禽养殖造成严重威胁。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是由镰刀菌属产生的一种霉菌毒素,猪是对DON最敏感的农场动物,食入含有DON的饲料可导致猪的厌食、呕吐、腹泻甚至死亡。现阶段通过物理、化学、生物等处理方式进行DON降解的方法已被证实具有诸多的局限性,因此,从遗传学角度提高猪对DON的抗性,筛选及鉴定与DON毒性调控相关的功能基因及有效分子标记,对于DON污染的防控具有重要意义。右开放阅读框激酶2(Right open reading frame kinase 2,riok2)是一种非典型蛋白激酶,在核糖体成熟和细胞周期进程中发挥着关键作用。前期研究表明,riok2基因在DON处理后的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中的表达水平显著提高,提示其在DON诱导的细胞毒性调控过程中的潜在生物学作用,然而其具体的调控作用和分子机制仍有待阐明。因此,本研究以IPEC-J2细胞为研究模型,首先检测riok2基因在DON处理IPEC-J2细胞中的表达水平变化,然后通过siRNA下调riok2基因的表达,探讨其对细胞增殖、凋亡、周期、活性氧以及氧化应激指标的影响,进一步分析riok2基因的功能及其对DON诱导的IPEC-J2细胞毒性的调控作用;其次,利用RNA-seq技术分析DON暴露riok2干扰细胞中的基因表达模式变化,揭示riok2基因调控DON细胞毒性相关信号通路和关键基因;最后,从SNP和DNA甲基化两个角度,探究启动子区变异对riok2基因表达的影响,揭示其表达调控的分子机制。主要结果如下:1.利用qPCR分析riok2基因在DON处理IPEC-J2细胞后的表达水平,发现DON处理48 h时,其表达量极显著上调(Priok2基因的表达,比较该基因干扰对DON处理后IPEC-J2细胞的增殖、凋亡、周期、活性氧以及氧化应激指标的影响。结果表明,riok2基因干扰后,IPEC-J2细胞活性极显著下调(P2细胞比例极显著增加(P2.选取riok2干扰细胞以及DON暴露riok2干扰细胞进行转录组测序,采用WGCNA方法进行数据分析,共筛选到803个核心基因,包括729个上调表达基因以及74个下调表达基因。这些差异基因主要富集到细胞分化、RNA代谢和核酸模板转录过程等功能条目中;主要参与丝裂原活化蛋白激酶、细胞周期和细胞凋亡等信号通路中。结合生物学功能,从差异表达基因中选择10个基因(BCL2L1、MICU2、HERC3、WDR74、RRP9、NGDN、GRWD1、DDX56、FTSJ3、DDX28)进行 qPCR 验证,发现其表达趋势与转录组测序结果一致。此外,KEGG富集分析结合Western Blot试验结果显示,R1OK2基因的低表达促进了 MAPK信号通路的激活。3.运用生物信息学软件预测猪riok2基因的核心启动子区,结合DNA混池测序鉴定位于该区域的SNPs位点,利用双荧光素酶报告基因试验检测SNPs对启动子活性的影响,结果发现该基因存在1个可能的核心启动子区域,且位于riok2基因启动子区上游663bp处(Chr2:103824333,Sscrofa11.1)的C/T突变极显著增加了riok2基因启动子的活性(Priok2基因的表达水平极显著降低(Priok2基因启动子区的DNA甲基化与基因的表达水平无显著相关性。综上所述,本研究分析了riok2基因在DON诱导IPEC-J2细胞损伤过程中的生物学功能及分子调控机制,riok2基因的高表达可能有利于提高IPEC-J2细胞对DON的抗性,转录组分析鉴定了riok2基因可能调控的DON细胞毒性相关重要通路和关键基因。此外,该基因启动子区的1处SNP突变对其表达水平具有潜在的调控作用。研究结果揭示了riok2基因对DON诱导的IPEC-J2细胞毒性的表达调控机制,同时为鉴定DON毒性相关分子标记以及制定相应的防控策略提供一定的理论依据。

关键词：猪 riok2 呕吐毒素细胞毒性 SNP

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磷酸激酶riok2是APC/C复合物中的新成员

磷酸激酶RIOK2是APC/C复合物中的新成员

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作者：焦延延中国协和医科大学

学位级别：硕士

细胞周期的调控是当前国际上生命科学研究的重要内容和热点问题,细胞周期研究不仅是理解生命现象的重要途径,也是治疗癌症和肿瘤等疾病的必由之路。APC/C(anaphase promoting complex/closome),即胞周期后期促进复合物是广泛存在的调控... 详细信息

细胞周期的调控是当前国际上生命科学研究的重要内容和热点问题,细胞周期研究不仅是理解生命现象的重要途径,也是治疗癌症和肿瘤等疾病的必由之路。APC/C(anaphase promoting complex/closome),即胞周期后期促进复合物是广泛存在的调控细胞周期的E3泛素连接酶。APC/C在细胞的有丝分裂期后期激活,调控细胞完成有丝分裂。在哺乳动物细胞中APC/C是一个1.5MD的包含超过11个亚基的分子复合物,其中Apc2和Apc11发挥了催化核心的作用,Apc10有着介导底物识别的功能。我们在酵母双杂交实验中发现了与Apc10结合的一个激酶,由于它与酵母中的Rio kinase2有着很高的同源性,所以称其为riok2。我们通过免疫共沉淀实验和GST-pulldown实验证明了riok2在真核细胞中通过氨基端的激酶区与Apc10结合,并发现它与Apc11结合。我们通过表达纯化riok2的羧基端部分,免疫新西兰大白兔制作了具有高灵敏度和特异性的抗体,为下一步实验打下了基础。由于APC/C是调控细胞周期的主要复合物,我们在293T细胞中过表达riok2并结合细胞同步化技术,最后通过流式细胞术检测其对周期影响,发现riok2有将细胞滞留在G/M期的作用,需要进一步实验证实。

关键词：磷酸激酶 riok2 APC/CC复合物 E3泛素连接酶细胞周期调控酵母双杂交实验

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