检索结果-南通市图书馆

作者：赵希仑四川农业大学

学位级别：硕士

兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease, RHD),俗称兔瘟,是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, rhdv)引起的兔的一种急性、高度致死性传染病。RHD以呼吸系统出血,实质器官淤血、肿大、出血和肝脏坏死为主要病变特征... 详细信息

兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease, RHD),俗称兔瘟,是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, rhdv)引起的兔的一种急性、高度致死性传染病。RHD以呼吸系统出血,实质器官淤血、肿大、出血和肝脏坏死为主要病变特征,主要危害2月龄以上的养殖和野生的多个穴兔品种,死亡率达80%-100%。RHD于1984年被我国首次报道后,在世界很多国家出现发病和流行的报道,严重威胁着世界养兔业的健康发展,被国际动物卫生组织列为法定通过动物疫病。2010年在法国出现了由rhdv新种即兔出血症病毒2型(rabbit hemorrhagic disease virus 2, rhdv2)引起的能感染致死30日龄以内的兔r和传统rhdv毒株灭活苗的免疫过的兔子的新型兔病毒性出血症(new rabbit hemorrhagic disease, nRHD),也称为兔病毒性出血症2型(rabbit hemorrhagic disease type 2, RHD2)近年来RHD2已扩散至意大利、西班牙、德国、葡萄牙、英国、挪威等多数西欧国家和亚速尔群岛等国。我国目前尚无该病发生及其相关的研究报道,为此本研究在对rhdv2和rhdv基因序列分析基础上对其RT-PCR检测技术进行了初步研究,具体如下：为建立用于兔出血症病毒2型(rhdv2)的快速检测方法。根据GenBank已公布的rhdv和rhdv2 VP60基因,设计合成2对特异性引物和10条搭桥引物,通过搭桥PCR人工合成rhdv2 VP60基因中保守区片段,构建重组质粒,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和35份样品检测应用,初步建立rhdv2 RT-PCR检测方法。结果表明成功合成rhdv2 VP60基因的435 bp保守片段和构建了pMD-19T-rhdv2重组质粒以及pMD-19T-rhdv441,初步建立的rhdv2 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,rhdv2的检测限度可达到230个拷贝的靶基因片段,检测rhdv、pGM-T-EBHSV(已构建)、兔源巴氏杆菌、兔源大肠杆菌和兔源沙门氏菌均无特异性扩增。样品检测结果显示样品中rhdv2核酸阴性。为建立用于兔出血症病毒(rhdv)与兔出血症病毒2型(rhdv2)鉴别诊断的检测方法,根据GenBank已公布的rhdv和rhdv2的VP60基因,在上面研究的基础上又设计合成1对特异性引物,采用RT-PCR和搭桥PCR技术分别获取rhdv和rhdv2的VP60基因中保守区片段,构建重组质粒pMD-19T-rhdv2、 pMD-19T-rhdv441(上面已构建)和pMD-19T-rhdv294,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验,以及人工感染rhdv样品和临床样品的应用,对rhdv与rhdv2的复合RT-PCR检测方法进行了初步研究。结果显示建立的rhdv与rhdv2复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增山rhdv和rhdv2的VP60保守区基因片段大小为294 bp和435 bp, rhdv与rhdv2的检测限度分别为160和230个拷贝的靶基因片段,而pGM-T-EBHSV(已构建)、兔源巴氏杆菌、兔源大肠杆菌和兔源沙门氏菌等病原的检测结果均为阴性。样品检测结果显示人工感染样品的rhdv检出率为100%(5/5),30份临床检样rhdv和rhdv2检测结果均为阴性。本研究为我国进行rhdv2的防控提供了一种技术储备和奠定了基础,同时为rhdv和rhdv2的鉴别与流行病学调查提供了科学方法和科学参考。

关键词：兔病毒性出血症 rhdv rhdv2 RT-PCR 搭桥PCR

用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法检测rhdv、rhdv2的初步研究

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用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法检测RHDV、RHDV2的初步研...

作者：王波四川农业大学

学位级别：硕士

兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)对养兔业来说是一种威胁很大的的烈性传染性疾病,由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, rhdv)引起,主要侵害2月龄以上的青壮年兔,造成的发病率和病死率都非常高,让家兔养... 详细信息

兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)对养兔业来说是一种威胁很大的的烈性传染性疾病,由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, rhdv)引起,主要侵害2月龄以上的青壮年兔,造成的发病率和病死率都非常高,让家兔养殖行业的经济效益大幅降低。从2010年开始,欧洲地区出现了兔出血症病毒变异型,又称兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus tape 2, rhdv2),可造成30日龄以下幼兔和免疫兔瘟家兔的死亡,这一情况引起了养兔业的广泛关注。鉴于兔出血症病毒出现的变异情况及新的流行趋势,本试验通过对比分析rhdv,rhdv2的结构蛋白基因VP60,分别对rhdv, rhdv2的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法进行了研究,以期为RHD的快速检测诊断和分子流行病学调查提供科学技术工具。根据NCBI上登录的rhdv2 VP60基因序列设计6对引物,人工合成靶基因。将靶基因纯化回收,通过连接、转化构建重组质粒pMD19-T-rhdv2。根据靶基因序列设计1对简并引物,以阳性质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立关于rhdv2的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并优化反应体系,进行特异性试验、重复性试验和灵敏性试验。用建立的方法对实验室人工感染样品(7份)和临床采集样品(15份)进行检测。试验结果显示建立的rhdv2检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好。该方法可检测的重组质粒pMD19-T-rhdv2的最低拷贝数为68个拷贝,该方法只能特异性的扩增rhdv2,对rhdv、兔巴氏杆菌、兔沙门氏菌、兔大肠杆菌和兔健康组织RNA的扩增结果均呈阴性,以阳性质粒为模板进行扩增得到的Ct值组内变异系数均小于0.8%,而该方法对rhdv人工感染样品和15份临床采集样品的检测结果均为阴性。通过比较分析NCBI上已登录的兔出血症病毒VP60基因序列,选择保守区设计一对特异性引物。提取rhdv阳性病料总RNA进行RT-PCR扩增,扩增出979bp大小的rhdv基因片段,并克隆到pMD19-T载体,构建重组质粒pMD19-T-rhdv。同时在扩增区内设计1对简并荧光定量PCR引物,目的片段大小为165 bp,以pMD19-T-rhdv为标准品进行荧光定量PCR扩增反应条件的优化和特异性试验、敏感性试验、重复性试验,建立了rhdv的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。再利用建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法对rhdv人工感染家兔(7只)进行检测并分析各组织器官的病毒含量,同时参照文献中的RT-PCR方法进行平行检测。试验结果表明建立的rhdv检测方法最低可检测的重组质粒pMD19-T-rhdv的拷贝数为81个拷贝,灵敏度优于RT-PCR方法。该方法只能特异性扩增rhdv, pMD19-T-rhdv2、兔巴氏杆菌、兔沙门氏菌、兔大肠杆菌和兔健康组织RNA的扩增均为阴性;以阳性质粒为模板进行扩增得到的Ct值在组内的变异系数均小于1.12%,说明该方法的敏感性高,特异性强,重复性好。对人工感染家兔各个脏器的检测结果表明脾脏的病毒含量最多,阳性检出率达100%,且可以根据各样品的Ct值计算出各脏器具体的含毒量,达到准确定量的效果。普通RT-PCR检测结果显示脾脏的条带最清晰,含毒量最多,与荧光定量PCR的检测结果基本相一致。

关键词：兔出血症病毒 rhdv2 RT-PCR 人工合成 SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR

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兔出血症病毒2型分离鉴定及感染试验

兔出血症病毒2型分离鉴定及感染试验

作者：涂藤四川农业大学

学位级别：硕士

兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,rhdv)属于嵌杯病毒科(Caliciviridae),兔病毒属(Lagovirus)。rhdv引起兔的一种急性、败血性、高度致死性的传染病,该病毒于1984年在我国江苏无锡等地被首次报道。rhdv2是兔出血症病毒的... 详细信息

兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,rhdv)属于嵌杯病毒科(Caliciviridae),兔病毒属(Lagovirus)。rhdv引起兔的一种急性、败血性、高度致死性的传染病,该病毒于1984年在我国江苏无锡等地被首次报道。rhdv2是兔出血症病毒的一种亚型,与经典rhdv不同,在自然条件下,rhdv2既能感染野兔,也可感染家兔,而且家兔更为易感,尤其是幼兔与亚成年兔。本研究从四川省某规模化兔场送检病死兔中分离鉴定出2株rhdv2毒株,构建系统进化树,分析分离毒株发生的重组事件和氨基酸突变热点。并根据所获得毒株VP60序列建立rhdv2 SYBR Green I RT-q PCR方法,通过RT-q PCR方法对比不同日龄家兔在分别感染rhdv2和rhdv后的排毒动态及内脏病毒载量的差异。1.两株rhdv2毒株分离鉴定及遗传进化分析从四川省某规模化兔场病死兔中检测到rhdv2,设计引物分段扩增rhdv2全基因序列,连接p MD19-T(simple)载体并测序,并经过NCBI比对证明两株分离株均为rhdv2,将分离株分别命名为SCCN03、rhdv2/C/2021。本研究分离株SCCN03和rhdv2/C/2021分别与德国株Bremerhaven-17和中国株SC2020/0401一致性最高,分别为99.21%、99.54%。将两分离株与52株兔病毒属参考株绘制全基因、主要结构蛋白VP60、毒力蛋白p16的系统发育进化树.结果显示,本研究的分离株SCCN03、rhdv2/C/2021在全基因进化树上与欧洲株的亲缘关系最接近;在主要结构蛋白VP60进化树中,本研究两分离株之间亲缘关系最近;在毒力蛋白p16进化树上,分离株SCCN03与欧洲株的亲缘关系更近,而rhdv2/C/2021则与中国株SC2020/0401的亲缘关系更近。分析分离株氨基酸序列,它们的氨基酸序列突变热点主要集中在p16蛋白和VP10蛋白。rhdv2全基因重组分析结果表明,分离株SCCN03、rhdv2/C/2021发生了相同的重组事件,它们的重组断点99%置信区间位于5148～5674 nt,它们的主要亲本为2007年德国rhdva分离株Erfurt。2.rhdv2 SYBR GreenⅠRT-q PCR检测方法的建立根据本研究分离株SCCN03的VP60基因序列设计1对引物,以阳性质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立rhdv2 SYBR Green I RT-q PCR检测方法,并优化反应体系,绘制rhdv2 RT-q PCR标准曲线,进行特异性试验、重复性试验和灵敏性试验。结果显示,本研究建立的rhdv2检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好。该方法可检测重组质粒p MD19-T-VP60的最低拷贝数为2.67copies/μL,且特异性好。以阳性质粒为模板进行扩增得到的Ct值组内变异系数均小于1%。用本研究建立的rhdv2 SYBR Green I RT-q PCR方法与6种国内外rhdv2 SYBRⅠRT-q PCR方法分别检测23份临床样品,结果表明本研究所建立的方法与国内外建立的RT-q PCR方法临床样品检测结果一致,阳性样品检出率为100%,可准确适用于rhdv2诊断。3.rhdv2/rhdv感染家兔试验为探究rhdv2/rhdv感染家兔致病性差异,对30日龄、90日龄、180日龄家兔分别进行rhdv2和rhdv攻毒试验,对比家兔在感染rhdv2和rhdv后通过唾液、粪便的排毒动态,并通过相对定量方法检测不同日龄家兔体内的病毒载量分布情况。rhdv2攻毒试验表明,rhdv2对所有日龄家兔均有100%致死率,其中幼兔感染rhdv2病程更短。攻毒后所有家兔血液病毒拷贝数在死亡前均呈上升趋势,在死亡时病毒拷贝数最高;所有家兔在攻毒后6 h时粪便和唾液种病毒拷贝数达到动态平衡,此后粪便、唾液中持续带毒。病理切片结果表明rhdv2的靶器官为肝脏;其他内脏rhdv2病毒载量与家兔日龄有关:幼兔的心脏病毒载量比其他两组要高且病理损伤更严重,成年兔组脾脏和肺脏病毒载量比其他两组要高且病理损伤更严重,肾脏未见发生病变。rhdv攻毒试验表明,rhdv对亚成年兔和成年兔有100%致死率,但对幼兔致死率为0。成年兔感染rhdv后的24 h内均出现死亡。攻毒后亚成年兔、成年兔血液病毒拷贝数在死亡前均上升,死亡时达到最高,同时亚成年兔、成年兔粪便和唾液的病毒拷贝数均是先上升后趋于平稳;幼兔在攻毒6 h后,粪便持续带毒,但该组家兔血液、唾液中病毒拷贝数变化趋势为先上升在下降,在72 h处死时,在幼兔唾液几乎检测不到rhdv。结合病理切片结果表明rhdv的靶器官为肝脏,对肝脏的损伤也最严重;对比不同日龄各组家兔其他内脏rhdv载量,结果发现成年兔的脾脏、肺脏组织病毒载量也高于其他两组家兔,病理损伤也更严重;所有家兔心脏均未

关键词： rhdv2 分离鉴定 SYBR Green I RT-qPCR 排毒动态病毒载量

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兔出血症病毒2型单克隆抗体的制备

兔出血症病毒2型单克隆抗体的制备

作者：曾红梅四川农业大学

学位级别：硕士

兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)又称兔瘟,是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,rhdv)感染引起的兔急性出血性传染病。经典兔瘟(也称RHD1)感染的rhdv为GI.1型毒株(也称rhdv1),主要致死成年家兔。1984年,我国首次报道发现经典兔瘟,因注射疫苗相关综合措施实施得到良好防控。2010年法国报道发现兔瘟2型(Rabbit hemorrhagic disease type2,RHD2),其感染的rhdv毒株为GI.2型毒株(也称rhdv2),幼龄兔和免疫过兔瘟1型疫苗的成年兔均可感染发病。2020年5月我国爆发RHD2疫情,因我国尚无商品化疫苗上市,养兔业的发展受到严重威胁。为探索RHD2与RHD1的免疫学鉴别诊断技术,本研究在rhdv1 Sch04株与rhdv2 SCCN03株毒株VP60基因的克隆分析基础上,构建原核表达载体pET-32a-R1VP60和pET-32a-R2VP60,诱导表达和纯化rhdv1 VP60 蛋白(rR1 VP60 蛋白)和 rhdv2 VP60 蛋白(rR2VP60 蛋白)。以rR2VP60 蛋白免疫BALB/c小鼠,并分别以rR1VP60和rR2VP60蛋白为包被原建立特异性的rhdv2单克隆抗体筛选的间接ELISA方法,采用常规杂交瘤细胞融合技术,进行了rhdv2的单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb)的试制。主要结果如下:1.通过针对rhdv1 Sch04株与rhdv2 SCCN03株毒株的VP60基因设计带酶切位点的引物,成功对两种VP60基因进行克隆,并成功构建重组质粒pMD-19T-R1VP60与pMD-19T-R2VP60。经过分析,两株VP60基因的核苷酸序列相似性为80.75%(1405/1740),有335个不同的核苷酸位点;氨基酸序列相似性为87.74%(508/579),有71个不同的氨基酸位点;核苷酸序列与氨基酸序列的同源性分别为80.7%与88.7%。SCCN03株与大部分rhdv2毒株具有高同源性,最高可达99.8%。蛋白特性分析结果显示SCCN03株VP60蛋白为稳定的亲水性蛋白,该蛋白有6个α螺旋结构、34个β折叠结构,其余部分则为无规则卷曲。保守域包括一个杯状病毒衣壳蛋白结构和一个疱疹病毒的主要外包膜糖蛋白结构。2.通过以pET-32a质粒为表达载体,经过酶切、连接、转化,成功构建了两种基因型的rhdvVP60基因原核表达载体pET-32a-R1VP60与pET-32a-R2VP60。通过IPTG诱导表达,镍柱亲和层析、Western blot试验和ELISA试验,成功表达并纯化出反应原性良好的两种重组蛋白,分别命名为rR1VP60蛋白和rR2VP60蛋白。通过诱导条件优化,确定了两种重组蛋白rR1VP60和rR2VP60的最佳诱导温度分别为30℃和37℃,最佳IPTG浓度分别为1.2 mmol/L和0.8 mmol/L,最佳诱导时间均为4 h,为后续特异性rhdv2单克隆抗体的制备奠定基础。3.通过常规杂交瘤细胞融合技术,采用ELISA、亚克隆、腹水制备与纯化、Western blot分析、染色体数目分析、单克隆抗体亚型鉴定和血凝-血凝抑制试验成功筛选出一株抗rhdv2的杂交瘤细胞株,命名为2A1。结果显示,2A1融合细胞的染色体约为100条,产生IgG3亚型McAb,轻链kappa型;杂交瘤2A1的抗体分泌稳定,腹水纯化McAb效价高,特异性良好,其间接ELISA效价高达1:128000。Western blot结果显示McAb 2A1仅与rhdv2病毒粒子和rR2VP60蛋白反应,与rhdv1病毒粒子和rR1VP60蛋白反应阴性。本研究制备的rhdv2特异性McAb 2A1,为rhdv2特异快速的血清学诊断方法相关研究奠定了基础和提供了科学材料。

关键词：兔病毒性出血症 rhdv2 VP60蛋白基因序列分析单克隆抗体