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rgd-fasl Induces Apoptosis in Hepatocellular Carcinoma

Cellular & Molecular Immunology 2009年第4期6卷 285-293页

作者： Zhongchen Liu Juan Wang Ping Yin Jinhua Qiu Ruizhen Liu Wenzhu Li Xin Fan Xiaofeng Cheng Caixia Chen Jiakai Zhang Guohong Zhuang Anti-Cancer Research Center Medical College Xiamen University 422Siming South Road Xiamen 361005 China School of Life Science Xiamen University 422 Siming South RoadXiamen 361005 China Zhongshan Hospital Xiamen University Lakeside South 201-209 Xiamen361004 China These authors contributed equally to this work Anti-Cancer Research Center Medical College Xiamen University 422 Siming South Road Xiamen 361005 China

Despite impressive results obtained in animal models, the clinical use of Fas ligand （fasl） as an anticancer drug is limited by severe toxicity. Systemic toxicity of death ligands may be prevented by using genes encoding membrane-bound death ligands and by targeted transgene expression through either targeted transduction or targeted transcription. Selective induction of tumor cell death is a promising anticancer strategy. A fusion protein is created by fusing the extracellular domain of Fas ligand （fasl） to the peptide arginine-glycine-aspartic acid （rgd） that selectively targets avβ-integrins on tumor endothelial cells. The purpose of this study is to evaluate the effects of rgd-fasl on tumor growth and survival in a murine hepatocellular carcinoma （HCC） tumor model. Treatment with rgd-fasl displaying an obvious suppressive effect on the HCC tumor model as compared to that with fasl （p 〈 0.05） and resulted in a more additive effect on tumor growth delay in this model. rgd-fasl treatment significantly enhanced mouse survival and caused no toxic effect, such as weight loss, organ failure, or other treatment-related toxicities. Apoptosis was detected by flow cytometric analysis and TUNEL assays; those results also showed that rgd-fasl is a more potent inducer of cell apoptosis for H22 and H9101 cell lines than fasl （p 〈 0.05）. In conclusion, rgd-fasl appears to be a low-toxicity selective inducer of tumor cell death, which merits further investigation in preclinical and clinical studies. Furthermore, this approach offers a versatile technology for complexing target ligands with therapeutic recombinant proteins. To distinguish the anti-tumor effects of fasl in vivo, tumor and liver tissues were harvested to examine for evidence of necrotic cells, tumor cells, or apoptotic cells by Hematoxylin and eosin （H＆E） staining.

关键词： fasl rgd-fasl apoptosis tumor targeting

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rgd-fasl Induces Apoptosis of Pituitary Adenoma Cells

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Cellular & Molecular Immunology 2008年第1期5卷 61-68页

作者： Lukui Chen Guohong Zhuang Wenzhu Li Yunsheng Liu Junqing Zhang Xinhua Tian Department of Neurosurgery Zhongshan Hospital Xiamen University Xiamen Fujian 361004 China Cancer Research Center Medical College Xiamen University Xiamen Fujian 361000 China School of Life Science Xiamen University Xiamen Fujian 361000 China Department of Neurosurgery Xiangya Hospital Zhongnan University Changsha Hunan China

This study was to investigate the cytotoxic effects on pituitary adenoma cell lines GH3/MMQ/AtT20 induced by rgd-fasl and the underlying mechanism. Fas/DcR3 mRNAs were detected by RT-PCR and their surface expressions were measured by flow cytometry. Cytotoxicity exerted by rgd-fasl on tumor cells was measured with MTT assay and the induced apoptosis was determined by agarose gel electrophoresis. The cell cycle and apoptosis was assessed by flow cytometry with PI staining. The expressions of caspase8/9/3, Bcl-2, RANKL and JNK2 were detected by Western blotting. Approximately 13.7% of GH3 cells, 25.5% of MMQ cells, 22.2% of AtT20 cells express Fas, while 23.9% of GH3 cells, 24.1% of MMQ cells, 4.6% of AtT20 cells express DcR3. The cytotoxic effects of fasl/rgd-fasl on tumor cells were all taken in a dose-dependent manner. Cell lines MMQ/AtT20 showed the same sensitivity to rgd-fasl as to fasl, while cell line GH3 was less sensitive to rgd-fasl. The cell cycle analysis indicated that rgd-fasl could inhibit cells in G0/G1 phase and G2/M phase. In MMQ and AtT20 cells treated with rgd-fasl, the AI was not significantly different from that treated with fasl, while in GH3 cells treated with rgd-fasl, the AI was lower than that treated with fasl. The expressions of caspase-8/9/3, RANKL and JNK2 were increased while that of Bcl-2 was decreased after treatment with rgd-fasl, suggesting that rgd-fasl induces apoptosis through caspase activation. We concluded that rgd-fasl could possibly be considered as a novel therapeutical candidate for the treatment of pituitary adenomas. Cellular ＆ Molecular Immunology.

关键词： rgd-fasl pituitary adenoma apoptosis

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rgd-fasl的基因构建、表达、纯化及功能分析

RGD-FasL的基因构建、表达、纯化及功能分析

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作者：王娟厦门大学

学位级别：硕士

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的头号杀手,手术、放疗和化疗是治疗肿瘤的常用方法。放疗、化疗因同时杀伤肿瘤细胞和正常细胞,副作用大,因此寻找特异、高效的肿瘤治疗方法一直是肿瘤研究的热点。肝癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤,肝... 详细信息

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的头号杀手,手术、放疗和化疗是治疗肿瘤的常用方法。放疗、化疗因同时杀伤肿瘤细胞和正常细胞,副作用大,因此寻找特异、高效的肿瘤治疗方法一直是肿瘤研究的热点。肝癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤,肝癌是所有肿瘤中的第二位致死因素,肝癌的治疗方法及效果对肝癌防治致关重要,近年来,随着肝癌的发病机理和治疗研究的进展,人们认识到细胞凋亡机制的异常在肝癌发生和抗肿瘤治疗中起重要作用,研究发现很多抗肿瘤治疗方法是通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用,因此,寻找能够诱导肝癌细胞凋亡的活性物质,通过激发肝癌细胞的凋亡途径,达到治疗肝癌的目的是肝癌防治的有效方法之一。由于fasl具有抗肿瘤作用和多种免疫调节功能,fasl疗法的临床研究已在许多国家开展。动物实验和临床实验均表明,fasl对某些肿瘤具有明显的抑制作用;但是由于副作用较大,为fasl的临床应用造成困难。患者常因不能耐受其毒副作用而终止用药。为了降低fasl的副作用,临床多采用局部用药、联合用药、温热疗法等。尽可能降低fasl用药量,增强疗效而不损伤正常细胞,然而,欲从根本上解决fasl的疗效问题还需要对fasl进行遗传改造以获得高特异性、低毒性的新一代fasl,有关这方面的工作,目前主要集中在以下两个方面:一是根据fasl结构与功能的关系研究结果,通过遗传操作,获得fasl突变体,降低其毒副作用;二是将fasl与其它蛋白共同构建双功能的融合蛋白,实现肿瘤靶向治疗。肿瘤靶向治疗是利用特异性的载体或导向系统,将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位,而不影响正常细胞、组织或器官的功能,从而提高疗效、减少毒副作用。肿瘤靶向治疗中治疗靶点、靶向载体和效应分子的选择是关键。整合素是一类膜受体家族,由α和β两个亚单位组成。在部分肿瘤细胞或者肿瘤新生血管内皮细胞中,常特异性地高表达某些整合素,如αvβ3,而正常细胞不表达或表达量很低。整合素αvβ3在肿瘤新生血管形成、肿瘤生长和转移过程中发挥重要作用,可以作为一类新的肿瘤治疗靶点;rgd肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（Arg-Gly-Asp）的短肽,细胞外基质（ECM）和血液中的粘附蛋白是人体中最常见的含rgd序列的蛋白。研究发现,大部分整合素与其配体的结合过程,是通过识别配体中所含的rgd序列来完成的。目前,利用噬菌体表面展示技术,已经筛选出与一类与整合素αvβ3特异性结合的rgd肽,即ACDCrgdCFCG（rgd-4C）,这类rgd肽可以作为肿瘤靶向载体,特异性地引导抗肿瘤药物到达肿瘤部位,杀灭肿瘤细胞。本研究以整合素αvβ3为靶点,rgd肽为靶向载体,fasl蛋白为抗肿瘤效应分子,构建双靶向性抗肿瘤融合蛋白rgd-fasl,并检测其生物学活性,为深入探讨rgd-fasl的体内靶向抑瘤活性及肿瘤治疗应用前景奠定基础。同时丰富了fasl在肿瘤治疗中的应用形式,为肿瘤靶向治疗提供了新思路。我们获得rgd-fasl基因,构建到表达载体pGEX-5X-1,通过酶切、测序鉴定阳性重组载体。含重组质粒pGEX-5X-1/rgd-fasl的*** BL21DE（3）经IPTG诱导表达后,通过不同的诱导时间和诱导剂浓度对重组菌进行诱导表达,确定其最适表达条件为IPTG终浓度为0.5mmol/L、30℃诱导12 h。目的蛋白主要存在包涵体裂解液上清中,表达量占菌体总蛋白的30%以上,过GST Resin柱纯化。经SDS-PAGE分析在Mr 62 000附近有一特异条带,符合目的蛋白理论推算值（Mr约62 700）,扫描分析显示其纯度达95%以上,透析和稀释复性制备正确折叠的融合蛋白。通过流式细胞仪检测肝癌分子表面Fas,CD61的表达,通过体外粘附实验证实rgd-fasl具有靶向性,从而为进一步实验提供了有力基础。MTT比色实验证实,rgd-fasl能抑制小鼠肝癌细胞H22和人肝癌H9101细胞生长,对正常小鼠肝细胞生长没有影响;通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量分析技术和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）方法分析证实rgd-fasl诱导H22和H9101细胞凋亡能力;体内实验显示rgd-fasl融合蛋白能有效抑制鼠源性肝癌的生长。在H22小鼠模型中,当rgd-fasl剂量为200mg/kg时,rgd-fasl的抑瘤率为62.5%,优于相同剂量的fasl的抑瘤率（51.3%）:免疫组化及HE染色组织学观察发现rgd-fasl能选择性作用于肿瘤组织,诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常组织及肝组织没有毒副作用。本研究表明:融合蛋白rgd-fasl具有诱导肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞生长的能力。同时rgd-fasl能够特异性

关键词： fasl rgd-fasl 肿瘤靶向性

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重组人rgd-fasl对胶质瘤细胞U138/U343/U373的体外抗肿瘤的活性分析

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免疫学杂志 2009年第6期25卷 680-684页

作者：罗芳洪李文珠丘劲华苏金华庄国洪厦门大学医学院抗癌研究中心厦门大学生命科学学院

目的研究重组人rgd-fasl对3株胶质瘤细胞U138/U343/U373的杀伤作用及机制。方法采用RT-PCR方法、MTT比色法、DNA倍体分析、流式细胞术检测融合蛋白对3株胶质瘤细胞的杀伤作用;利用Western blot法探讨其作用机制。结果FasmRNA在U138和U34... 详细信息

目的研究重组人rgd-fasl对3株胶质瘤细胞U138/U343/U373的杀伤作用及机制。方法采用RT-PCR方法、MTT比色法、DNA倍体分析、流式细胞术检测融合蛋白对3株胶质瘤细胞的杀伤作用;利用Western blot法探讨其作用机制。结果FasmRNA在U138和U343细胞中有表达,在U373细胞中未有可见表达;DcR3mRNA在3株细胞中均有表达,在U373细胞中强表达。采用流式细胞术检测肿瘤细胞表面两种受体的表达情况,结果与RT-PCR相符。U138细胞株对rgd-fasl敏感并呈剂量依赖性;U343细胞株对rgd-fasl相对敏感;U373细胞对rgd-fasl不敏感。用PI检测细胞周期与凋亡表明rgd-fasl能使U138/U343细胞停留在G1期,推迟进入S期,抑制细胞生长并诱导细胞发生凋亡。Western blot实验表明rgd-fasl作用细胞后caspase-8/3/9的表达升高,Bcl-2的表达降低。结论重组人rgd-fasl可以不同程度的诱导胶质瘤细胞凋亡,其机制与其受体的表达和caspase-8/3/9、Bcl-2的表达有关。

关键词： rgd-fasl 胶质瘤靶向治疗凋亡

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