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戊型肝炎病毒rdrp基因真核表达质粒的构建及表达

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中国生物制品学杂志 2012年第3期25卷 290-293页

作者：黄芬禹文海马天武井申荣曾韦锟华修国昆明理工大学生命科学与技术学院昆明650224 中国医学科学院医学生物学研究所实验动物部昆明650118 上海交通大学农业与生物学院上海200240

目的构建戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)rdrp基因真核表达质粒,并检测其在PLC/PRF/5、A549和HepG2 3种细胞中的表达,为后续rdrp的研究提供实验依据。方法利用RT-nPCR法从阳性HEV粪便中扩增rdrp基因片段,插入pcDNA3.0真核表达载体... 详细信息

目的构建戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)rdrp基因真核表达质粒,并检测其在PLC/PRF/5、A549和HepG2 3种细胞中的表达,为后续rdrp的研究提供实验依据。方法利用RT-nPCR法从阳性HEV粪便中扩增rdrp基因片段,插入pcDNA3.0真核表达载体中,并在其3′端插入EGFP报告基因,构建融合表达质粒pcDNA3.0-rdrp-EGFP,脂质体法转染PLC/PRF/5、A549和HepG2细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达,RT-nPCR检测rdrp基因mRNA的转录情况,Westernblot检测rdrp蛋白的表达。结果重组表达质粒经酶切鉴定和测序证实构建正确;rdrp基因和蛋白在A549和HepG2细胞中可高效、特异性表达。结论成功构建了rdrp基因真核表达质粒,并在A549和HepG2培养细胞中大量表达,为进一步研究rdrp在HEV复制过程中的功能奠定了基础。

关键词：戊型肝炎病毒属 rdrp基因真核细胞基因表达

家蚕质型多角体病毒rdrp基因的序列测定及同源性分析

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蚕业科学 2005年第1期31卷 53-58页

作者：孙京臣杨艺峰戴伟君谭玉蓉张勤奋张景强徐兴耀华南农业大学动物科学学院广州510642 中山大学生命科学院生物防治国家重点实验室广州510275

应用分段RTPCR方法和分子克隆技术从家蚕质型多角体病毒(Bombyxmoricytoplasmicpolyhedrosisvirus,BmCPV)中国株的dsRNA中成功地分3段克隆了rdrp基因(RNAdependentRNApolymerase),大小分别为1442、827、1675bp,进行了基因全序列拼接,获得37kb的全长rdrp基因(GenBank序列号为AY496445)。通过在线blast分析,与BmCPV1、DpCPV1、LdCPV1、LdCPV14、TnCPV15核苷酸同源性分别为89%、81%、81%、541%和509%,氨基酸同源性分别为965%、931%、929%、411%和335%。根据核苷酸同源性与氨基酸同源性构建的进化树具有较好的一致性。通过ClustalX软件分析,定位了该病毒rdrp基因的3个保守区域(酸性区,核苷酸结合的核心区和催化功能核心区)。

关键词：家蚕质型多角体病毒 dsRNA rdrp基因同源性

猪繁殖与呼吸综合征病毒rdrp基因的克隆与原核表达

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动物医学进展 2009年第2期30卷 16-18页

作者：蔡汝健宋长绪郝永清杨鼎何锦玲广东省农业科学院兽医研究所广东省兽医公共卫生实验室广东广州510460 内蒙古农业大学动物科技学院内蒙古呼和浩特010018 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(rdrp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒rdrp的功能奠定基础。以rdrp基因cDNA为模板,用PCR扩增出rdrp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段... 详细信息

将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(rdrp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒rdrp的功能奠定基础。以rdrp基因cDNA为模板,用PCR扩增出rdrp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达。PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白。成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒rdrp基因。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 rdrp基因克隆原核表达

粘团专化型尖孢镰刀菌中rdrp基因功能研究

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粘团专化型尖孢镰刀菌中Rdrp基因功能研究

作者：薛瑞婷山西师范大学

学位级别：硕士

rdrp蛋白是通过RNA为模板形成互补RNA的聚合酶,是RNAi中重要的扩增信号分子。在植物病原真菌中,rdrp蛋白既能够正向调控有性产孢也能够反向调控无性产孢,同时也能调节代谢物的变化。甘蓝枯萎病是由粘团专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxyspo... 详细信息

rdrp蛋白是通过RNA为模板形成互补RNA的聚合酶,是RNAi中重要的扩增信号分子。在植物病原真菌中,rdrp蛋白既能够正向调控有性产孢也能够反向调控无性产孢,同时也能调节代谢物的变化。甘蓝枯萎病是由粘团专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum ***)引起的严重危害甘蓝产业的新型果蔬病害。本实验室前期初步研究发现rdrp蛋白与尖孢镰刀菌的生长发育及致病力相关,为了进一步探究rdrp基因在尖孢镰刀菌中的作用机制,本文对rdrp基因进行生物信息学分析的基础上,以粘团专化型尖孢镰刀菌生理1号小种野生型(FOX-A8-Wild)和其rdrp1、rdrp2缺失突变体(FOX-A8-△rdrp1、FOX-A8-△rdrp2)为材料,进行生长发育比较、代谢组分析以及对甘蓝的致病性及抗性比较,为深入解析rdrp蛋白在粘团专化型尖孢镰刀菌中的功能奠定理论基础。本文主要从以下内容展开研究:1.尖孢镰刀菌rdrp1蛋白中α螺旋最多,且α螺旋之间由短回环或者β折叠股连接,rdrp2及rdrp3中β折叠最多,形成β螺旋桨结构;功能表现上均为非跨膜亲水蛋白,有多个磷酸化位点,亚细胞定位在细胞内膜上,可能具有信号转导功能或参与相关的信号转导途径;对尖孢镰刀菌与其它30种真菌的rdrp蛋白序列进行进化分析,结果表明rdrp蛋白序列相似度高,高达87.08%,在进化上也存在一定的分化,说明它们在尖孢镰刀菌中执行的功能具有差异性。2.在PDA培养基上,rdrp1缺失突变体菌株菌丝生长速率变慢,菌落边缘整齐且致密,菌丝分支较多、延伸生长减慢;在PDB培养液中,rdrp缺失突变体菌株分生孢子形态变小,且由短棒状变为近似球状。rdrp1缺失突变体菌株的菌丝生长较少,且培养皿中菌液有聚集现象,rdrp2缺失突变体菌株的菌丝相比PDA中断裂更多;在VBC培养基上,相比于FOX-A8-Wild,rdrp2缺失突变体菌株色素产生较少,且颜色为浅黄色;在不含有HO的培养基上,FOX-A8-Wild与rdrp1缺失突变体菌株被完全抑制而rdrp2缺失突变体菌株则生长缓慢。3.对FOX-A8-Wild及rdrp缺失突变体菌株进行代谢组比较,结果显示,正离子模式下B v A、C v A和B v C筛选得到的的差异代谢物分别为139、131和137种,发现与野生型rdrp相比,能够引起尖孢镰刀菌野生型与突变体菌株大量代谢物数目、种类及含量发生变化。筛选得到的差异代谢物中有机酸、氨基酸、酯类物质、糖类代谢物、醇类物质、磷酸盐和脂类物质和胺类代谢物等受rdrp基因调控,其中有机酸和氨基酸类代谢物对尖孢镰刀菌产孢起重要作用;涉及到的差异代谢物显著在富集有机酸类代谢、氨基酸类代谢、酯类代谢、糖类代谢、醇类代谢、磷酸盐类代谢通路。已有研究证实有机酸和氨基酸类代谢物与尖孢镰刀菌的产孢密切相关,这与2中结果相一致。4.以中甘11号甘蓝为材料,对FOX-A8-Wild及rdrp缺失突变体菌株代谢物溶液及病原菌处理后的甘蓝进行致病性及抗性比较,结果显示,与对照组相比,各处理第9～12 d全部发生整株性萎蔫直至死亡。病原菌处理下的的甘蓝植株形态建成和物质积累量均显著低于对照组,而代谢物处理后甘蓝植株形态建成和物质积累量较菌悬液处理显著减少,均呈现出先上升后下降的变化趋势;各处理组的渗透性调节物质呈现先升高后降低变化趋势,尤其在侵染后期,甘蓝中的可溶性蛋白含量显著下降。抗逆性指标均显著高于对照,而代谢物处理后3种抗氧化酶活性较菌悬液处理显著减少,均呈现出先升高后降低的变化趋势。综上所述,我们认为rdrp蛋白可能通过小RNA对有机酸和氨基酸类代谢物及其参与的有机酸类代谢、氨基酸类代谢通路进行调控,从而影响尖孢镰刀菌的分生孢子形态及产孢方式,并对毒素类代谢物及其参与的代谢通路进行调控,进而影响尖孢镰刀菌的致病力。

关键词：尖孢镰刀菌 rdrp基因生物信息学生长发育代谢组致病性及抗性

家蚕质多角体病毒rdrp基因的克隆、表达及定位

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农业生物技术学报 2005年第2期13卷 202-206页

作者：孙京臣戴伟君谭玉蓉杨艺峰张勤奋徐兴耀张景强华南农业大学动物科学学院广州510642 广州510275 广州510275 广州510275 广州510275 广州510642 广州510275 中山大学生命科学院生物防治国家重点实验室中山大学生命科学院生物防治国家重点实验室中山大学生命科学院生物防治国家重点实验室中山大学生命科学院生物防治国家重点实验室中山大学生命科学院生物防治国家重点实验室华南农业大学动物科学学院中山大学生命科学院生物防治国家重点实验室广州510275

应用分段RT-PCR的方法从家蚕质多角体病毒(Bombyxmoricytoplasmicpolyhedrosisvirus,BmCPV)中国株的dsR-NA中成功地克隆了rdrp基因(RNA-dependentRNApolymerase),基因序列全长3691bp,并登录GenBank,序列号为AY496445。利用质粒载体pET-28b成功地构建了表达质粒pET28b-rdrp,并用IPTG诱导的方法在大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中获得表达,分子量约为138kD。以重组蛋白的兔抗为一抗,15nm山羊抗兔IgG-胶体金为二抗,进行免疫标记,电镜定位,结果显示在病蚕中肠的柱状细胞的游离病毒粒子和多角体内的病毒粒子上均能结合胶体金颗粒,标记率为35%左右,证明BmCPV病毒的rdrp复合物确实位于病毒衣壳上。

关键词：家蚕质多角体病毒 rdrp基因表达免疫电镜

基于恒温隔绝式荧光RT-PCR技术现场检测牛纽布病毒方法的建立及应用

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畜牧兽医学报 2022年第4期53卷 1310-1316页

作者：崔雨晨岳华汤承西南民族大学畜牧兽医学院成都610041

纽布病毒(nebovirus,NeV)是引起犊牛腹泻的新发病原,本试验旨在建立基于恒温隔绝式RT-PCR(insulated isothermal RT-PCR,iiRT-PCR)技术现场检测NeV的方法。根据NeV的rdrp基因的保守区域,设计并合成引物和探针,优化检测体系和检测试剂预... 详细信息

纽布病毒(nebovirus,NeV)是引起犊牛腹泻的新发病原,本试验旨在建立基于恒温隔绝式RT-PCR(insulated isothermal RT-PCR,iiRT-PCR)技术现场检测NeV的方法。根据NeV的rdrp基因的保守区域,设计并合成引物和探针,优化检测体系和检测试剂预混方法,建立检测NeV的iiRT-PCR方法。结果显示,成功建立了检测NeV的iiRT-PCR方法,该方法只特异性检出NeV,对牛冠状病毒、牛诺如病毒、A群牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛凸隆病毒、牛大肠杆菌、牛沙门菌、牛瑞氏隐孢子虫和牛艾美尔球虫等无关病原不检出,批间变异系数为3.07%~3.12%,批内变异系数为2.45%~3.01%,检测下限为5.38 copies·μL^(-1)。应用此方法对2020—2021年采集自红原县、若尔盖县、凉山彝族自治州西昌市和阆中市的101份犊牛腹泻样本进行检测,NeV的检出率为64.36%。本研究成功建立了检测NeV的iiRT-PCR方法,具有特异性强、稳定性好和灵敏度高的特点,检测试剂预混后配合使用PetNAD核酸萃取试剂盒,可实现NeV的现场检测,从核酸提取到报告检测结果仅需1 h,操作方便,为NeV的快速诊断提供了有力的工具。

关键词：纽布病毒牛 rdrp基因恒温隔绝PCR 现场检测

家蚕质多角体病毒中国株RNA聚合酶基因序列测定、表达及定位

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家蚕质多角体病毒中国株RNA聚合酶基因序列测定、表达及定位

犬诺如病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

中国蚕学会第四届青年学术研讨会

作者：孙京臣戴伟君谭佩婵谭玉蓉张景强徐兴耀华南农业大学动物科学学院中山大学生命科学院生物防治国家重点实验室华南农业大学动物科学学院中山大学生命科学院生物防治国家重点实验室中山大学生命科学院生物防治国家重点实验室华南农业大学动物科学学院

应用分段RT-PCR 的方法从家蚕质多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic Polyhedrosis Virus,BmCPV）中国株的dsRNA 中成功地克隆了rdrp 基因（RNA-dependent RNA polymerase）,基因序列全长3691bp,并登录GenBank,序列号为AY496445。利用质粒载体pET-28b 成功构建了表达质粒pET28b-rdrp,并用IPTG 诱导的方法在大肠杆菌BL21（DE3）中获得表达,分子量约为138kDa。以重组蛋白的兔抗为一抗,15nm 山羊抗兔IgG-胶体金为二抗,进行免疫标记,电镜定位,结果显示在病蚕中肠的柱状细胞的游离病毒粒子和多角体内的病毒粒子上均能结合胶体金颗粒,标记率为30%,左右.证明BmCPV 病毒的rdrp 复合物确实位于病毒衣壳上。

关键词：家蚕质多角体病毒 rdrp基因表达免疫电镜

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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中国预防兽医学报 2021年第6期43卷 626-632页

作者：马会强岳华汤承西南民族大学畜牧兽医学院四川成都610041

犬诺如病毒(CNV)是一种致犬腹泻的病原,目前中国大陆尚无关于CNV的报道,为建立特异灵敏的检测CNV的RT-PCR方法,本研究选择CNV rdrp基因作为靶基因,设计引物,并通过对反应体系及条件的优化,建立了检测CNV的RT-PCR方法。利用该方法同时检... 详细信息

犬诺如病毒(CNV)是一种致犬腹泻的病原,目前中国大陆尚无关于CNV的报道,为建立特异灵敏的检测CNV的RT-PCR方法,本研究选择CNV rdrp基因作为靶基因,设计引物,并通过对反应体系及条件的优化,建立了检测CNV的RT-PCR方法。利用该方法同时检测CNV、犬瘟热病毒、犬冠状病毒、犬轮状病毒、犬星状病毒、犬库布病毒、犬细小病毒2型、犬腺病毒2型、犬微小病毒、犬圆环病毒和犬源大肠杆菌、犬源沙门氏菌等致犬腹泻的病原,结果显示该方法仅对CNV检测为阳性,而对其他病原检测均为阴性,特异性较强;将pMD-rdrp标准品10倍倍比稀释后利用该方法检测,结果显示对pMD-rdrp标准品的检测下限为4.64×10^(3)拷贝/μL,敏感性较高;批内、批间重复性试验结果一致,重复性较好。利用该方法和国外文献报道的3种RT-PCR方法同时对107份犬腹泻样品进行检测,结果显示该方法对CNV的检出率为4.67%(5/107),其他3种方法的检出率分别为0(0/107)、0.93%(1/107)、0.93%(1/107)。从5份CNV阳性样品中扩增了4条完整的rdrp基因,测序并且比对结果显示,4个完整rdrp基因序列聚为2个大支,表明中国大陆流行的CNV至少有2种不同的rdrp基因型。本实验建立了检测CNV的RT-PCR方法,并首次证明CNV在中国大陆存在,为国内犬腹泻的防控提供了重要参考。

关键词：犬诺如病毒 RT-PCR rdrp基因

鸡Ⅱ型星状病毒绝对定量real-time PCR的建立及应用

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中国家禽 2020年第12期42卷 30-35页

作者：赵伟武宗仪秦爱建钱琨扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室江苏扬州225009 扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室江苏扬州225009 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 扬州大学比较医学研究院江苏扬州225009

研究旨在建立一种检测鸡Ⅱ型星状病毒(CAstV)绝对定量的检测方法。采用PCR方法扩增Ⅱ型CAstV保守区域基因rdrp部分基因,将其克隆至pGEM-T载体作为阳性标准质粒,并根据获得的rdrp基因设计合成一对133 bp引物,成功建立了Ⅱ型CAstV的绝对定... 详细信息

研究旨在建立一种检测鸡Ⅱ型星状病毒(CAstV)绝对定量的检测方法。采用PCR方法扩增Ⅱ型CAstV保守区域基因rdrp部分基因,将其克隆至pGEM-T载体作为阳性标准质粒,并根据获得的rdrp基因设计合成一对133 bp引物,成功建立了Ⅱ型CAstV的绝对定量real-time PCR的检测方法。结果显示:研究构建的检测方法线性关系良好,检测灵敏度为10copies/μL,且对常见的禽源病毒均无非特异性扩增,特异性好。应用建立的绝对定量real-time PCR检测了病毒感染1日龄雏鸡不同组织样品,掌握了鸡Ⅱ型星状病毒在鸡体内不同组织内的分布及增殖情况。试验成功建立了Ⅱ型CAstV绝对定量real-time PCR检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为进一步深入研究Ⅱ型CAstV的生物学特性提供了检测手段。

关键词：鸡Ⅱ型星状病毒 rdrp基因绝对定量 real-time PCR