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生物化学与生物物理进展 2009年第10期36卷 1260-1266页

作者：李浩徐俊杰陈薇军事医学科学院微生物流行病研究所、病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

rd-1(region of difference-1)被认为在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的致病机理中起着关键的作用.rd-1基因全长9.5kb,开放读码框从Rv3871～Rv3879c,分别编码9种不同的蛋白质.rd-1区在卡介苗(bacillusCalmette-Guerin,BCG)中是缺失的.研究结果显示,rd-1区是结核分枝杆菌的主要毒力因素之一,同时rd-1区参与了一种新的分泌系统ESX-1,这种分泌系统能够促进某些特定蛋白的分泌.ESX-1分泌的两种主要蛋白质CFP-10(culture filtrateprotein of10ku)和ESAT-6(early secreted antigenic target of6ku)能够形成牢固的1∶1的复合体,这两种蛋白质能够协同分泌而且能够引起T细胞反应,并可能作为理想的靶抗原在结核的预防和诊断中发挥作用.

关键词：结核分枝杆菌(MTB) rd-1区 CFP-10 ESAT-6

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分枝杆菌rd-1区部分基因重组卡介苗的构建及其免疫活性的研究

分枝杆菌RD-1区部分基因重组卡介苗的构建及其免疫活性的研究

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作者：孟凡爽吉林农业大学

学位级别：硕士

肺结核是由结核分枝杆菌引起的一类人畜共患慢性传染疾病,严重威胁人类及患病动物的健康。目前,卡介苗仍然是世界范围内公认的肺结核疫苗,但是由于地域、年限的差异导致卡介苗的保护效力不断的下降,这可能是由于传代过程中某些功能基因... 详细信息

肺结核是由结核分枝杆菌引起的一类人畜共患慢性传染疾病,严重威胁人类及患病动物的健康。目前,卡介苗仍然是世界范围内公认的肺结核疫苗,但是由于地域、年限的差异导致卡介苗的保护效力不断的下降,这可能是由于传代过程中某些功能基因的缺失,因此人们积极寻求卡介苗的改良方法以期提高其保护力。结核分枝杆菌的rd-1区(Region of difference,1)是卡介苗同致病性分枝杆菌相比缺失的区域,由Rv3871-Rv3879c 9个基因构成,rd-1区编码的蛋白在结核分枝杆菌侵染机体的过程中发挥巨大的作用。随着结核分枝杆菌基因组测序工作的完成,对结核分枝杆菌的研究进入分子水平,将rd-1区基因重组载体导入卡介苗表达蛋白或为肺结核疫苗的改良提供新的思路。本实验首先运用分子生物学技术获得大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261-rd-1区基因重组质粒6个,利用电穿孔法将构建成功的部分重组质粒转化至卡介苗中,构建重组卡介苗,经培养得到重组卡介苗菌株。利用培养的重组卡介苗免疫动物,分别在免疫后的第6周和第12周对样品进行检测,通过检测实验动物脾淋巴细胞增殖情况,抗体水平变化情况以及小鼠脾淋巴细胞培养上清中的细胞因子IFN-γ、NO含量来观察小鼠体内免疫情况并对数据进行分析,实验结果如下所示:1、本实验利用分子生物学技术获得6个rd-1区重组穿梭质粒即pMV-261-Rv3872、pMV-261-Rv3873、pMV-261-Rv3874、pMV-261-Rv3875、pMV-261-Rv3876、pMV261-Rv3877。2、利用电转化技术成功获得3个重组卡介苗即rBCG:ESAT-6、rBCG:EspI、rBCG:Snm4,重组卡介苗的生长曲线同卡介苗相比未发生明显的变化,可以用于后续免疫实验。3、免疫后每周称量实验动物的体重,发现注射卡介苗、重组卡介苗的小鼠同注射PBS组的小鼠相比,体重未发生明显变化,注射的重组卡介苗没有影响动物的生长。4、抗体效价检测结果:免疫6周后,各实验组组血清中IgG水平同PBS组相比均极显著上升(P1),免疫12周后,抗体效价有所降低,BCG组及rBCG:ESAT-6组血清中IgG水平同PBS组相比显著上升(P1)的刺激脾淋巴细胞增殖;免疫12周后,PPD刺激后rBCG:ESAT-6组SI(实验组与对照组吸光度的比值,比值大于1则为阳性)极为显著(P1),BCG组差异显著(P12周后,同PBS组相比较,各实验组小鼠脾细胞上清中IFN-γ的产量均显著增加(P1)。7、NO检测结果表明:免疫6周后,各实验组的脾淋巴细胞受到PPD刺激时,NO的表达水平同PBS组相比均极为显著(P1);免疫12周后,BCG组及rBCG:ESAT-6组的脾细胞受到PPD刺激时,NO的表达水平同PBS组相比均极为显著(P1),rBCG:EspI、rBCG:Snm4组NO生成量差异显著(P<0.05)。

关键词： rd-1区 pMV261 重组BCG 细胞免疫体液免疫

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重组卡介苗rBCG-Rv3874与rBCG-Rv3875对RAW264.7细胞的侵染及代谢组学分析

重组卡介苗rBCG-Rv3874与rBCG-Rv3875对RAW264.7细胞的侵染及代谢...

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作者：刘满宇吉林农业大学

学位级别：硕士

卡介苗(BCG)是一种预防结核病的减毒活疫苗,由于其安全性和成本优势,自诞生几十年来得到了广泛的应用。但随着时间的推移,BCG也暴露出免疫效力低、其保护性存在地区差异与年龄限制等众多缺点。而改良现有的BCG以增强其免疫效力是目前一... 详细信息

卡介苗(BCG)是一种预防结核病的减毒活疫苗,由于其安全性和成本优势,自诞生几十年来得到了广泛的应用。但随着时间的推移,BCG也暴露出免疫效力低、其保护性存在地区差异与年龄限制等众多缺点。而改良现有的BCG以增强其免疫效力是目前一个重要的研究方向。与结核分枝杆菌相比,BCG丢失了一段被称作rd区的基因序列,这段序列共分为16个区(rd1-rd16),包含的部分基因与结核分枝杆菌的毒力和免疫原性有关。通过将免疫原性相关基因转化进BCG中,进而提高BCG的免疫效力,被认为是一种行之有效的策略。本研究以结核分枝杆菌H37Rv菌株中的rd-1区基因为模板扩增目的基因,构建重组pMV-261穿梭载体,利用电转化方法将重组载体导入感受态卡介苗中,纯化后共得到8种重组卡介苗。使用其中的rBCG-Rv3874、rBCG-Rv3875两种重组BCG与正常BCG分别侵染小鼠RAW264.7巨噬细胞,观察细胞活性的变化及细胞中炎症相关因子的表达。然后利用LC-MS法分别检测BCG、rBCG-Rv3874、rBCG-Rv3875侵染的巨噬细胞与正常巨噬细胞中的脂类成分,并进行初步的代谢组学分析。在本研究中得到的结果如下:1.成功构建pMV261-Rv3871、pMV261-Rv3872、pMV261-Rv3873、pMV261-Rv3874、pMV261-Rv3875、pMV261-Rv3877、pMV261-Rv3878与pMV261-Rv3879c共8种重组质粒。2.通过电转化方法,将重组质粒转化进感受态卡介苗菌株中。成功构建出rBCG-Rv3871、rBCG-Rv3872、rBCG-Rv3873、rBCG-Rv3874、rBCG-Rv3875、rBCG-Rv3877、rBCG-Rv3878与rBCG-Rv3879c共8种重组卡介苗。并绘制其生长曲线,确定对数生长期与此时的活性细菌数量。***、rBCG-Rv3874与rBCG-Rv3875对RAW264,7巨噬细胞的侵染能够抑制细胞的生长。rBCG-Rv3874、rBCG-Rv3875两种卡介苗对RAW264.7巨噬细胞的侵染能够上调细胞中促炎细胞因子的表达,提高细胞的凋亡水平,但其促炎作用低于卡介苗,而IFN-γ的表达则均呈下调趋势。4.提取BCG、rBCG-Rv3874与rBCG-Rv3875侵染的RAW264,7巨噬细胞中的总脂质,利用LC-MS方法共检测出1450种成分。与未受侵染的RAW264.7细胞相比,BCG、rBCG-Rv3874与rBCG-Rv3875对巨噬细胞的侵染分别导致213、357、372种脂类成分出现显著变化。并进行初步的代谢组学分析,发现其中绝大部分物质为磷脂酰胆碱(PC)类成分,也有许多其他种类脂质成分发生变化。本研究表明,与卡介苗相比,重组卡介苗rBCG-Rv3874与rBCG-Rv3875的侵染会对RAW264.7巨噬细胞产生更强烈的代谢变化,这些变化与Rv3874与Rv3875基因的导入有关。其中,rBCG-Rv3875侵染细胞所造成的变化要多于rBCG-Rv3874,说明RAW264.7巨噬细胞对Rv3875基因有着更强的应答。这对于研究结核分枝杆菌rd-1区基因的功能及重组卡介苗的筛选具有重要意义。

关键词：重组卡介苗 rd-1区 LC-MS 代谢组学

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