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结核分枝杆菌rd12区和rd5区特异性抗原的生物信息学分析及免疫原性初步评估

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结核分枝杆菌RD12区和RD5区特异性抗原的生物信息学分析及免疫原...

作者：叶娟河南中医学院

学位级别：硕士

目的：中医对结核病(Tuberculosis，TB)在唐朝就形成了“痨虫”之说，1882年罗伯特·科赫发现了结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)，证明了“痨虫”即为MTB是TB的发病原因。为了进一步发展中医对TB的认识，我们采用现代技... 详细信息

目的：中医对结核病(Tuberculosis，TB)在唐朝就形成了“痨虫”之说，1882年罗伯特·科赫发现了结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)，证明了“痨虫”即为MTB是TB的发病原因。为了进一步发展中医对TB的认识，我们采用现代技术和方法对MTB进行深入研究;本论文采用生物信息学和免疫学对MTB的rd12和rd5区抗原进行评估，从而为中西医结合在肺痨方面的发展提供实验室研究依据。方法：在NCBI数据库上查询并获得各个抗原的氨基酸序列，用Blast分析其与MTB复合群及人类蛋白的同源性。利用SYFPEITHI、NETCTL、BIMAS和NetMHC数据库预测并分析MTB的rd12区和rd5区抗原CD8+T细胞表位的分布情况;利用NetMHC数据库预测并分析MTB的rd12区和rd5区抗原的CD4+T细胞表位的分布情况。然后，综合CD4+T和CD8+T表位预测，筛选出优势表位肽段。用pET32a载体和pET28b载体分别与rd5区抗原Rv3117和rd12区抗原Rv2074构建重组载体，用原核表达出结核特异性抗原，通过Ni-NTA柱纯化蛋白，利用Triton X-114在4℃能与水混溶，而在37℃能与水形成水相与去污相的特点，用相分离法去除Rv3117和Rv2074蛋白中的内毒素，然后分别用显色基质鲎试剂法和BCA法测定目的蛋白的内毒素含量和蛋白质浓度。收集临床结核病患者和健康对照者的血清，用ELISA检测血清中抗结核特异性抗原Rv3117和抗Rv2074的体液免疫反应，筛选出特异性和敏感性较高的特异性优势抗原Rv3117。用纯化并去除内毒素的蛋白Rv3117免疫C57BL/6小鼠，Westernblotting检测小鼠血清中抗结核分枝杆菌Rv3117的IgG抗体;用酶联免疫斑点试验检测Rv3117诱导C57BL/6小鼠脾脏淋巴细胞产生特异性IFN-γ的斑点形成细胞数(SpotForming Cells, SFC);进一步收集临床活动性结核患者和健康对照的全血，并分离外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononμclear Cell, PBMCs)，用ELISPOT试验检测Rv3117分别刺激结核病患者和健康对照PBMCs产生特异性IFN-γ的SFC。结果：通过预测与分析，并综合CD4+T和CD8+T预测结果，初步筛选出MTB rd12区4个抗原的13个优势表位肽段;rd5区5个抗原的23个优势表位肽段。本文选择结核分枝杆菌rd12区特异性抗原Rv2074和rd5区特异性抗原Rv3117以及公认的具有较强免疫原性的抗原CFP-10和ESAT-6，分别对65例结核病(Tuberculosis, TB)患者的血清和59例健康对照患者的血清进行抗结核抗体检测，结果显示rd5区抗原Rv3117能够引起65例TB患者血清IgG水平提高，与59例健康对照者相比，具有显著性差异(prd12区抗原2074不能引起TB患者和健康对照者的显著性差异(p>0.05)。酶联免疫斑点试验结果显示0.10μg/mL、1.00μg/mL和10.00μg/mL的Rv3117均能引起小鼠脾脏淋巴细胞产生较高水平的Rv3117抗原特异性IFN-γ，与对照组CFP-10免疫的小鼠脾脏淋巴细胞相比，二者具有统计学差异(p区分TB患者组和健康对照组PBMCs产生的抗原特异性IFN-γ水平之间无统计学意义(p>0.05)。采用不同浓度的Rv3117刺激TB患者(n=17)PBMCs释放抗原特异性IFN-γ水平实验显示，1.000.00μg/mL的重组Rv3117不能刺激TB患者产生IFN-γ(p>0.05)。结论：借助现代技术和方法对中医关于结核病的“痨虫”假说进行深入探讨是发展中医进一步认识“痨病”和“痨虫”本质的必要手段。本课题采用生物信息学和免疫学对MTB的rd12和rd5区抗原进行评估，初步评估出了结核特异性抗原Rv3117，虽然Rv3117不能作为抗结核诊断的免疫学指标，但其作为仅存在于MTB致病菌株H37Rv中的抗原，对其抗原免疫学功能的进一步研究有助于结核新型疫苗的研究和抗结核药物的开发，并对探索结核的致病机制具有十分重要的意义，为中西医结合预防、诊断及治疗结核病提供研究

关键词：结核分枝杆菌痨虫 RD区内毒素体液免疫细胞免疫

结核分枝杆菌RD区蛋白CD4+T细胞表位筛选及功能研究

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结核分枝杆菌RD区蛋白CD4+T细胞表位筛选及功能研究

作者：姚翠梅吉林大学

学位级别：硕士

结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）感染导致的重要的传染病。它具有较高的传染率和死亡率，严重危害人类健康。我国结核新发病例占全世界的16%，是结核病感染人数仅次于印度的国家。尽管这两年我国结核病... 详细信息

结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）感染导致的重要的传染病。它具有较高的传染率和死亡率，严重危害人类健康。我国结核新发病例占全世界的16%，是结核病感染人数仅次于印度的国家。尽管这两年我国结核病人的人数呈下降趋势，但是人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）与结核分枝杆菌共感染以及广泛耐药性结核分枝杆菌的出现为结核病的治疗提出了一大难题。结核病检测的时效性问题以及卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin, BCG）的免疫效力的下降的问题，使人们对结核新型疫苗的需求迫切。研究已经证实CD4+T细胞免疫在抵抗结核感染过程中发挥着重要的作用。特别是结核分枝杆菌与BCG疫苗株差异（Region of difference, rd）区编码蛋白成为研究者们关注的重点，并且此区域表达的很多蛋白，表现出较强的免疫原性，能够引发较强T细胞免疫反应。因此，本研究将RD区蛋白CD4+T细胞抗原表位的筛选及其功能研究作为本研究的研究目标。本研究通过NCBI网站查询结核分枝杆菌RD区编码蛋白的氨基酸序列。借助NetMHCII和ProPred在线T细胞表位预测软件进行T细胞抗原表位预测。以中国地区人群结核HLA-Ⅱ类易感基因HLA-DRB1*0803、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1401、 HLA-DRB1*1501HLA-DRB1*1502、 HLA-DRB1*1601为限定条件，获得表现良好的18个候选抗原表位。提取10个健康志愿者和30个结核病人（20个为痰检阴性患者，10个为痰检阳性患者）的外周血单个核细胞，借助细胞增殖实验以及ELISPOT技术，ELISA技术和流式细胞技术，检测了18个表位多肽所诱发的细胞免疫原性。最后，通过体外诱导树突状细胞的技术，鉴定了树突状细胞在抗原多肽应用中的作用。痰检阴性结核病患者外周血单核细胞增殖试验中，多肽P3(ESAT-6(69-77))、P6(CFP10(76-84))、P15(RV3876(aa556-564))、P18(RV0222（149-157）)表现出刺激外周血单核细胞增殖能力，并且增殖细胞主要为CD4+T细胞。ELISPOT结果显示P3、P6、P15、P18分别能够增强7/25、6/25、8/25、4/25的结核病人的外周血单个核细胞IFN-γ分泌，P3、P15分别能够调低4/25、3/25的结核病人的外周血单个核细胞IL-10的分泌。ELISA结果显示，P3、P6、P15、P18能够增强4/15、2/15、3/15、4/15的痰检阴性结核病人的外周血单个核细胞IFN-γ分泌。痰检阴性结核病人、痰检阳性结核病人与健康人群的血清中TNF-α含量差异显著，可以指导结核病病程。T细胞抗原表位与树突状细胞共同作用的结果显示，树突状细胞与多肽表位共同作用后淋巴细胞增殖程度与分泌IFN-γ能力都明显增强。 CD4+T细胞特别是Th1型细胞在抵抗结核分枝杆菌感染的过程中发挥着重要作用，IFN-γ与TNF-α是重要的Th1型炎性细胞因子，同时也是结核病疫苗免疫效力的评价标准。本研究筛选出的4个T细胞抗原表位能够明显增强T细胞分泌IFN-γ、TNF-α的能力，特别是在树突状细胞的参与下。因此，本研究所筛选出的4个T细胞抗原表位是结核病疫苗和新型检测试剂的非常有前途的候选抗原表位。

关键词：结核病 RD区 CD4+T细胞抗原表位树突状细胞

结核分支杆菌RD区在结核病诊断及疫苗研究中的应用价值概述

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结核分支杆菌RD区在结核病诊断及疫苗研究中的应用价值概述

结核分枝杆菌Rv1773c促进细菌侵入巨噬细胞的研究

第七届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛

作者：罗微天津医科大学总医院检验科

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）感染引起的结核病（Tuberculosis,TB）是人类健康的主要威胁之一,近年来的流行呈明显的上升趋势,给结核病的防治工作带来了严峻挑战。目前的结核诊断及预防工作虽已取得一定进展,但仍存... 详细信息

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）感染引起的结核病（Tuberculosis,TB）是人类健康的主要威胁之一,近年来的流行呈明显的上升趋势,给结核病的防治工作带来了严峻挑战。目前的结核诊断及预防工作虽已取得一定进展,但仍存在许多不足。BCG（Bacillus Calmette Guerin）基因组中的某些片段相对于牛型结核分枝杆菌或结核分枝杆菌H37Rv来说发生缺失,这些缺失片段被定义为RD区（Region of Differences,rd）。近年来许多研究显示,部分RD区蛋白拥有较强的抗原性及免疫原性,可作为结核病诊断及疫苗研发的潜在靶标;本文就近年来此类报道作一综述。

关键词：结核分枝杆菌 RD区诊断疫苗综述

来源： cnki会议评论

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中国病原生物学杂志 2018年第4期13卷 330-335页

作者：刘伟香章晓联武汉大学基础医学院免疫学系病毒学国家重点实验室湖北省过敏及免疫相关疾病重点实验室和医学研究院湖北武汉430071

目的筛选出能促进分枝杆菌对巨噬细胞侵入的功能性结核基因并进行验证。方法将H37Rv rd10-16区的18个结核分枝杆菌(MTB)基因构建到pMV261载体上,然后将重组pMV261质粒电转至耻垢分枝杆菌M.smegmatis(Ms)中,并将各重组菌株命名为rMs::Rv... 详细信息

目的筛选出能促进分枝杆菌对巨噬细胞侵入的功能性结核基因并进行验证。方法将H37Rv rd10-16区的18个结核分枝杆菌(MTB)基因构建到pMV261载体上,然后将重组pMV261质粒电转至耻垢分枝杆菌M.smegmatis(Ms)中,并将各重组菌株命名为rMs::Rvs。运用菌落计数法筛选功能性基因;采用流式细胞术Flow cytometry(FCM),动物实验验证该基因的功能。结果菌落计数显示rMs::Rv1773c组菌落数最多,与对照组相比差异有统计学意义(Prd14区功能性结核基因Rv1773c可能作为结核菌毒力因子,具备促进分枝杆菌入侵巨噬细胞的功能。

关键词：结核分枝杆菌入侵巨噬细胞 RD区菌落计数实验 Rv1773c

Rv1508c调节和促进分枝杆菌对链霉素药物敏感性的研究

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中国病原生物学杂志 2018年第6期13卷 562-566页

作者：左睿琪章晓联武汉大学基础医学院免疫学系病毒学国家重点实验室湖北省过敏及免疫相关疾病重点实验室和医学研究院湖北武汉430071

目的通过检测抗结核药物-利福平、异烟肼以及链霉素对结核分枝杆菌RD区(Region of Differences,rd)基因的IC50(half maximal inhibitory concentration,IC50)值,筛选对3种抗结核药物敏感或耐药的毒性结核分枝杆菌RD区基因。方法将结核... 详细信息

目的通过检测抗结核药物-利福平、异烟肼以及链霉素对结核分枝杆菌RD区(Region of Differences,rd)基因的IC50(half maximal inhibitory concentration,IC50)值,筛选对3种抗结核药物敏感或耐药的毒性结核分枝杆菌RD区基因。方法将结核分枝杆菌rd6、rd9和rd15区基因与穿梭质粒pMV261连接,连接产物电转化耻垢分枝杆菌中。分别将对数生长期的耻垢分枝杆菌以及重组耻垢分枝杆菌中加入浓度倍比稀释的异烟肼(0.031 25~4μg/ml)、利福平(0.031 25~4μg/ml)和链霉素(0.031 25~4μg/ml)100μl,37℃培养2d后,用酶标仪测A600值。用Graphpad Prism5计算IC50值并进行统计学分析。结果成功构建rd6、rd9和rd15区基因重组质粒,电转化入耻垢分枝杆菌后通过检测利福平、异烟肼以及链霉素对以上RD区基因的IC50值,成功筛选出对链霉素敏感的rd6区基因Rv1508c。同时对Rv1508c在分枝杆菌(毒性结核分枝杆菌H37Rv、减毒结核分枝杆菌H37Ra、BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌以及海洋分枝杆菌)中的分布做了鉴定,确定其只存在于H37Rv和H37Ra中。结论结核分枝杆菌rd6区基因Rv1508c能促进分枝杆菌对链霉素的敏感,使链霉素杀伤分枝杆菌作用增强,Rv1508c作为链霉素一个靶点,在今后研究中,Rv1508c可作为抗结核药物增敏剂的应用。

关键词：结核分枝杆菌(H37Rv) RD区链霉素

结核病皮肤试验的高效蛋白组分及其免疫机制研究

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结核病皮肤试验的高效蛋白组分及其免疫机制研究

作者：段惠娟北京市结核病胸部肿瘤研究所

学位级别：硕士

目的:目前,用于结核病筛查的方法主要是基于结核菌素纯蛋白衍生物(Purified Protein Derivative,PPD)的皮肤试验,但其缺乏特异性,敏感性也有待提高。RD区(Region of Different)是经全基因组比较发现的结核分枝杆菌复合群中不同菌种(如... 详细信息

目的:目前,用于结核病筛查的方法主要是基于结核菌素纯蛋白衍生物(Purified Protein Derivative,PPD)的皮肤试验,但其缺乏特异性,敏感性也有待提高。RD区(Region of Different)是经全基因组比较发现的结核分枝杆菌复合群中不同菌种(如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)或卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG))基因组中存在的缺失片段。由于BCG接种的普遍性,利用BCG没有的RD区所编码蛋白作为抗原能够显著提高皮试特异性。本研究首先采用原核表达方法克隆表达具有刺激T细胞免疫应答的12种MTB基因组蛋白(ESAT6-CFP10、Rv0222、Rv1985c、MPT64、Rv3117、Rv3872、Rv1738、Rv3425、Rv2626c、Rv3619c、Rv3120和Rv2346c),其主要为RD区蛋白。在细胞和动物水平上筛选出其中具有较强T细胞反应的蛋白,比较与重组结核杆菌融合蛋白(EC)、临床使用的传统PPD在引起迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity,DTH)方面的异同,同时对EC和PPD引起的DTH细胞类群进行鉴定。本研究期望通过上述几方面的研究以指导如何提高结核潜伏感染(Latent tuberculosis Infection,LTBI)诊断效果。方法:1.通过大肠杆菌原核表达12种MTB基因组蛋白(EC、Rv0222、Rv1985c、MPT64、Rv3117、Rv3872、Rv1738、Rv3425、Rv2626c、Rv3619c、Rv3120和Rv2346c),为后续细胞和动物实验奠定一定的基础。2.为确定用于豚鼠皮肤试验抗原的最佳皮试剂量,采用MTB标准株(H37Rv,ATCC27294)致敏豚鼠,致敏成功后豚鼠背部去毛皮内注射植物血凝素(PHA-L)、结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)、EC和11种MTB抗原(包括重组抗原 Rv3872、MPT64、Rv1985c、Rv0222、Rv3117、Rv3120、Rv2346c、Rv3619c、Rv3425、Rv1738 和 Rv2626c),各 0.1ml。分别于注射后24h和48h观察皮肤试验反应,测量硬结平均直径[(横径+纵径)/2],以硬结平均直径≥5mm为阳性。分析11种MTB抗原皮肤试验反应与TB-PPD和EC的差异。3.为确定优势抗原刺激淋巴细胞增殖的效果,采用MTB标准株(H37Rv,ATCC27294)致敏小鼠,获取单个脾淋巴细胞,加入不同抗原刺激一定数量的脾淋巴细胞增殖,在72h后检测OD450的吸光度,在测定前4h每孔加入10μl CCK-8试剂;同时于72h后在显微镜下观察细胞增殖效果。4.为确定TB-PPD和EC皮肤试验硬结的细胞类群,采用MTB标准株(H37Rv,ATCC27294)致敏豚鼠,致敏成功后豚鼠背部注射TB-PPD和EC各0.1ml,于24h剪下硬结处理,用流式细胞技术和单细胞测序技术两种方法确定细胞类群。结果:1.构建了上述抗原的原核表达质粒,进一步采用IPTG诱导蛋白的大量表达,发现Rv3117、Rv3872、Rv1738和Rv2626c均在上清中表达,分离纯化得到纯度较高的蛋白,浓度分别为2mg/ml、1.1mg/ml、1.5mg/ml和2mg/ml。而EC、MPT64、Rv1985c、Rv0222、Rv3425、Rv3619c、Rv3120和 Rv2346c 均在沉淀中,因此用洗涤的方法洗涤后再纯化蛋白,并对包涵体透析复性得到纯度较高的蛋白,浓度分别为 1.3mg/ml、0.8mg/ml、1.4mg/ml、1mg/ml、1.8mg/ml、1.1mg/ml 和 1.1mg/ml。2.MTB抗原注射24 h后,剂量为5μg时Rv3120、Rv3619c的皮肤试验反应阳性率分别为9/9,8/9;剂量为0.5μg时EC、MPT64的皮肤试验反应均为阳性。TB-PPD(5 IU)及 EC(0.5μg剂量)、MPT64(0.5μg剂量)、Rv3120(5μg剂量)和Rv3619c(5μg剂量)皮肤试验反应24h硬结平均直径[M(Q1,Q3)]均大于反应48 h[硬结平均直径分别为:9.00(7.00,11.00)mm vs.6.50(5.50,8.25)mm、13.00(12.75,14.25)mm vs.9.00(8.00,9.75)mm、9.50(8.50,12.50)mm vs.8.50(5.50,9.50)mm、8.50(6.25,9.25)mm vs.5.00(0.00,5.50)mm、6.50(5.50,8.25)mm vs.3.50(1.50,4.75)mm],差异均有统计学意义(Z值分别为-2.494、-2.6

关键词：结核分枝杆菌 RD区抗原皮肤试验单细胞测序

结核分枝杆菌Rv0309蛋白抑制宿主天然免疫反应的分子机制研究

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结核分枝杆菌Rv0309蛋白抑制宿主天然免疫反应的分子机制研究

作者：彭永崇华中农业大学

学位级别：硕士

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是导致人类结核病（Tuberculosis,TB）的主要病原菌,是全球十大致死性疾病之一。结核分枝杆菌能够不被机体有效清除,很大程度上得益于结核分枝杆菌能够调节宿主的免疫应答反应。在结核分枝... 详细信息

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是导致人类结核病（Tuberculosis,TB）的主要病原菌,是全球十大致死性疾病之一。结核分枝杆菌能够不被机体有效清除,很大程度上得益于结核分枝杆菌能够调节宿主的免疫应答反应。在结核分枝杆菌复合群中,结核分枝杆菌和牛分枝杆菌可以致病,而减毒的BCG却是一种抗结核的疫苗。rd（Region of difference）区是强弱毒株之间的差异区域,研究这些细菌基因组之间的差异,可以为揭示强弱毒株致病性之间的差异提供思路。本研究利用本实验室构建的RD区蛋白表达文库和巨噬细胞模型,对影响宿主免疫反应的蛋白进行筛选,进一步研究了其生物学意义以及调控的细胞信号通路,为揭示结核分枝杆菌的免疫机理和致病机制奠定基础。本实验将原核表达的Rv0309蛋白作用于LPS刺激下的RAW264.7细胞,ELISA检测细胞培养上清中的IL-6含量,与对照组相比,Rv0309能够抑制LPS诱导的IL-6的分泌,并且呈剂量依赖性。本研究成功构建过表达Rv0309蛋白的重组耻垢分枝杆菌和重组BCG菌株,并利用Western blot验证Rv0309蛋白成功在重组菌株中表达。将Rv0309重组菌株和空载菌株以MOI为10:1感染RAW264.7细胞,收取RNA样品、蛋白样品和细胞上清。利用实时荧光定量RT-PCR和ELISA检测发现,与对照组相比,重组菌株能够抑制巨噬细胞炎性细胞因子表达和产生,统计学差异显著。Western blot检测发现,与对照组相比,重组菌株能够抑制TLR2的表达和MAPKs信号分子ERK、p38的磷酸化。将Rv0309重组菌株和空载菌株以MOI为10:1来感染RAW264.7细胞,在37℃条件下测定重组菌株的抗吞噬能力和胞内存活能力,结果证明Rv0309能够显著增强重组菌株的抗吞噬能力和胞内存活能力。在4℃条件下测定重组菌株的黏附能力,结果证明Rv0309能够显著增强重组菌株的黏附能力。本研究构建了包含Rv0309上下游同源臂的等位交换质粒,并将该质粒与含有分枝杆菌温敏型噬菌体元件的载体phAE159连接,含有敲除同源臂的重组质粒经噬菌体转导进入待敲除BCG菌株中。利用抗性平板筛选阳性克隆子并进行鉴定,结果表明Rv0309基因BCG敲除株构建成功。

关键词：结核分枝杆菌 RD区炎症反应基因敲除胞内存活

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结核分枝杆菌抗原蛋白研究的新进展

吉林畜牧兽医 2020年第2期41卷 11-14页

作者：王烁程任清丹(指导) 陶晨璐孙旭吉林农业大学生命科学学院吉林长春130118 吉林省畜牧总站吉林长春130051

结核病是结核分枝杆菌引起的人畜共患传染病。目前在结核病的检测方法中,血清学检测方法越来越受到重视,通过寻找具有血清学诊断价值的结核分枝杆菌特异性抗原蛋白,提高血清学诊断的准确性势在必行,本文对目前研究尚未完全深入的结核分... 详细信息

结核病是结核分枝杆菌引起的人畜共患传染病。目前在结核病的检测方法中,血清学检测方法越来越受到重视,通过寻找具有血清学诊断价值的结核分枝杆菌特异性抗原蛋白,提高血清学诊断的准确性势在必行,本文对目前研究尚未完全深入的结核分枝杆菌抗原蛋白进行综述,以期为相关研究提供参考。

关键词：结合分枝杆菌抗原蛋白 RD区

结核分枝杆菌MPT64-Rv1985c融合蛋白的诊断作用及其重组卡介苗构建的研究

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结核分枝杆菌MPT64-Rv1985c融合蛋白的诊断作用及其重组卡介苗构...

作者：丁志鑫吉林农业大学

学位级别：硕士

目的：构建pET32a（+）-MPT64-Rv1985c重组蛋白表达载体,并在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中表达,通过血清和胸腔积液样本研究目的蛋白诊断特性;构建PUV15-MPT64-Rv1985c穿梭载体,并电转入卡介苗构建重组卡介苗,为验证融合蛋白保护特性提供... 详细信息

目的：构建pET32a（+）-MPT64-Rv1985c重组蛋白表达载体,并在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中表达,通过血清和胸腔积液样本研究目的蛋白诊断特性;构建PUV15-MPT64-Rv1985c穿梭载体,并电转入卡介苗构建重组卡介苗,为验证融合蛋白保护特性提供准备。方法：通过PCR反应以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组为模板分别获取MPT64和Rv1985c基因片段后,通过重组PCR技术将两基因融合成为MPT64-Rv1985c重组基因,将目的基因经EcoRI和HindⅢ双酶切连入pET32a（+）载体中,经1mM IPTG,37℃过夜诱导,目的蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达;应用镍柱纯化目的蛋白,并通过梯度尿素复性。分别以PPD阴性血清和非结核胸腔积液样本的OD450平均值加2倍的标准差作为各自临界值,运用ELISA方法检测211例血清和182例胸腔积液样本中IgG抗体应答水平判断融合蛋白诊断特性。随后将目的基因片段经SphI和NheⅠ双酶切连入PUV15穿梭载体中,并通过电击转化入卡介苗中构建重组卡介苗,经RT-PCR扩增和Western blot对重组卡介苗进行鉴定。结果：成功构建pET32a（+）-MPT64, pET32a（+）-Rv1985c, pET32a（+）-MPT64-Rv1985c重组载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中目的蛋白均以包涵体形式表达,经镍柱纯化并通过梯度尿素成功获得大小为42kDa,52kDa,76kDa天然结构目的蛋白;通过ELISA方法检测211例血清中IgG抗体应答水平研究显示,融合蛋白检测活动性结核和PPD阴性对照组的敏感性和特异性分别为50%和93%。较MPT64蛋白和Rv1985c蛋白的敏感性32.9%和35.5%分别增加了17.1%和14.5%。MPT64-Rv1985c蛋白运用ELISA方法检测IgG抗体检测肺结核、肺外结核、活动性结核组及PPD阳性组中的敏感性为41.9%、55.6%、50%和15.4%,特异性为93%。在一定程度上,能有效区分肺结核和肺外结核样本（P=0.014）,在肺结核和PPD阳性组以及肺外结核和PPD阳性组别均有显著的差异,证实融合蛋白在区分PPD阳性组别中具有很好的诊断效果;同时验证MPT64蛋白可以在一定程度上区分PPD阳性组别和活动性结核患者,但在区分肺结核和肺外结核患者,PPD阳性组和PPD阴性组时,没有显著的差异;Rv1985c蛋白的血清学检测显示,Rv1985c可显著区分肺结核与PPD阳性及PPD阴性组,是诊断肺结核的一个优选抗原。通过182例胸腔积液样本的IgG抗体应答研究显示,MPT64-Rv1985c蛋白在结核组和非结核组胸腔积液样本检测的敏感性和特异性分别为54.9%和91.2%,比较MPT64蛋白的敏感性和特异性26.3%,95.6%和Rv1985c蛋白检测结核组的敏感性和特异性48.3%和93.4%,敏感性分别增加了28.6%和6.6%,但特异性下降了4.4%和2.2%。统计学分析融合蛋白可以显著区分结核组和非结核组胸腔积液样本（P＜0.001）;受试工作者特征曲线分析显示出MPT64-Rv1985c融合蛋白的诊断效果要优越于单一抗原。成功构建PUV15-MPT64, PUV15-Rv1985c, PUV15-MPT64-Rv1985c穿梭载体,经电击转化入卡介苗,获得PUV15空载体、MPT64和MPT64-Rv1985c重组卡介苗菌株,但未获得Rv1985c重组卡介苗。经RT-PCR和Western blot验证在27kDa,51kDa,85kDa处有蛋白条带产生,分析确定MPT64蛋白和MPT64-Rv1985c融合蛋白能在卡介苗中表达。结论：MPT64-Rv1985c融合蛋白能提高单一抗原体液免疫诊断特性,具有作为新型结核病诊断试剂的潜能。成功获得重组MPT64-Rv1985c-BCG菌株,为验证融合蛋白保护原性提供准备。

关键词：结核分枝杆菌 RD区重组卡介苗抗原诊断