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北京师范大学学报（自然科学版） 2014年第3期50卷 282-286页

作者：时晓雨赵艳娥孙越骆静北京师范大学生命科学学院北京市基因工程药物及生物技术重点实验室北京100875

本实验以ICR小鼠为实验材料,通过脑组织总mRNA提取、RT-PCR的方法分别扩增目的片段rcan2-L和rcan2-S,并将其构建到pEGFP-C1质粒中,获得序列正确的、用于真核细胞表达的重组质粒pEGFP-C1/rcan2-L和pEGFP-C1/rcan2-S,为进一步深入研究rcan... 详细信息

本实验以ICR小鼠为实验材料,通过脑组织总mRNA提取、RT-PCR的方法分别扩增目的片段rcan2-L和rcan2-S,并将其构建到pEGFP-C1质粒中,获得序列正确的、用于真核细胞表达的重组质粒pEGFP-C1/rcan2-L和pEGFP-C1/rcan2-S,为进一步深入研究rcan2的功能奠定了基础.

关键词：钙调神经磷酸酶 rcan2 pEGFP-C1载体克隆

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rcan2两种剪切变体的表达分布及其在体重调节中作用的研究

Rcan2两种剪切变体的表达分布及其在体重调节中作用的研究

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作者：公倩倩山东大学

学位级别：硕士

近几十年,全球整体生活水平提高,体力活动减少而高能量食物摄入增多,全球超重和肥胖人口猛增。肥胖大大增加了糖尿病、心血管疾病等的发病几率,严重危害人类健康,因此阐明体重调节机制和肥胖发生机理为控制"肥胖疫情"提供指导,成为当前... 详细信息

近几十年,全球整体生活水平提高,体力活动减少而高能量食物摄入增多,全球超重和肥胖人口猛增。肥胖大大增加了糖尿病、心血管疾病等的发病几率,严重危害人类健康,因此阐明体重调节机制和肥胖发生机理为控制"肥胖疫情"提供指导,成为当前生命科学研究的一个重要任务。现在研究认为体重受到"能量稳态"机制的调控——脂肪细胞分泌的信号分子瘦素通过作用于下丘脑相关的信号通路双向调控体重,肥胖是稳态机制失调的结果,但该假说备受争议。流行病学研究表明,体重受遗传因素与环境因素的共同影响,食物过剩及高能量食物盛行是引发肥胖的主要环境因素。近年研究发现,rcan2基因以一种与瘦素无关的机制增加摄食、促进体重增长,当rcan2与高脂肪食物共存时引起小鼠体重加速增长,这一发现可为解释肥胖和高能量食物的关系、揭示肥胖爆发的成因提供一定的科学证据。rcan2编码两种转录起始位点不同的剪切变体rcan2-1、rcan2-3,之前的研究利用同源重组的方法,将LacZ元件替换二者共用的4号外显子,制作了rcan2敲除(rcan2-/-)小鼠,一方面该小鼠用于基因功能的研究,另一方面,插入的LacZ元件可与rcan2-1、rcan2-3各自转录起始位点所在的外显子一起转录翻译成具有β-半乳糖苷酶活性的rcan2-1-LacZ、rcan2-3-LacZ融合蛋白,利用X-Gal染色即可原位检测rcan2的表达分布情况。然而两种剪切变体各自在体重调节中发挥何种作用以及表达分布情况尚不明确,而这正是本论文要解决的核心问题。在本研究中,我们利用CRISPR/Cas9技术制作了rcan2-敲除小鼠(rcan2-1-/-,2号外显子上ATG后缺失1个脱氧核苷酸T导致rcan2-1移码突变)、rcan2-3敲除小鼠(rcan2-3-/-,3号外显子上ATG后缺失2个脱氧核苷酸AG导致rcan2-3的移码突变),经传代和杂合小鼠雌雄交配得到了纯合敲除小鼠。4周龄起,将同窝的野生型小鼠分别与两种纯合敲除小鼠组合进行为期16周的体重监测实验。结果发现,在高脂肪食物喂养下,rcan2-3-/-小鼠体重较野生型小鼠稍轻,至20周龄时,二者的脂肪、肝脏等组织重量没有统计学差异,脂肪等的组织形态学相似且均具有肥胖特征;而rcan2-1-/-与野生型小鼠组中,4周龄至5周龄,二者体重曲线基本吻合,从6周龄开始二者体重逐渐拉开差距,野生型小鼠的体重增长明显加快,20周龄时二者体重差接近7g,野生型小鼠的脂肪等的组织形态呈现肥胖特征,而敲除小鼠相关组织的形态没有异常。上述结果表明在体重调节中起主要作用的可能是rcan2-1。我们将特异性靶向rcan2-1、rcan2-3的CRISPR/Cas9打靶载体分别注射到rcan2杂合敲除(rcan2+/-)受精卵中,当rcan2-3 靶点处的无义突变发生于带LacZ的染色体DNA上时,rcan2-3-LacZ融合蛋白失活,这样得到了仅保留rcan2-1-LacZ融合蛋白的小鼠,该小鼠的X-Gal染色结果原位显示了 rcan2-1的表达分布位置,同理可得rcan2-1-LacZ缺失而仅能检测rcan2-3表达分布情况的小鼠。实验结果表明,rcan2-3在胚胎和成体中的表达部位与rcan2--小鼠的结果基本重合,在胚胎期9.5(E9.5)天时rcan2-3已表达,E11.5至E12.5天时rcan2-3主要分布于端脑泡、中后脑交界处、后脑、延髓、脊髓,E13.5天时其分布范围扩展至中脑、间脑,随着发育进行rcan2-3在胚胎中枢神经系统的表达范围逐渐扩大,在成体中rcan2-3集中分布于脑、脊髓且在PVN等神经核团有突出表达;而rcan2-1表达较晚、表达量较少,胚胎E15.5天时检测到前脑区有微弱表达,在成体脑中仅丘脑、大脑皮层部分区域有一定分布。此外,为了进一步证明rcan2-1、rcan2-3在肥胖发生中的功能,我们拟利用Tol2转座子系统制作带有FLAG标签的转基因过表达rcan2-1FLAG小鼠和rcan2-3FLAG小鼠。F0代得到了随机插入rcan2-1-FLAG、rcan2-3-FLAG片段且能够稳定传代的转基因小鼠,然而Westernblot实验结果显示,上述小鼠的脑等组织中均未检测到FLAG目的蛋白,推测可能与转基因位置效应等因素有关。本研究利用CRISPR/Cas9技术制作了rcan2-1、rcan2-3分别敲除的小鼠模型,体重监测实验显示,rcan2-1而非rcan2-3的缺失明显地减弱了高脂肪食物引发的肥胖,由此确定了rcan2-1在体重调节中的主要作用,并首次利用组织化学方法直观地展示了蛋白水平上rcan2两种剪切变体在小鼠胚胎和成体中枢神经系统的表达分布情况。本研究为进一步阐明rcan2调控体重的机制提供了新的依据。

关键词：肥胖体重调节 rcan2 CRISPR/Cas9 基因敲除转基因

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rcan2在结直肠癌诊断中的应用

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中外医疗 2017年第22期36卷 5-7页

作者：陈苗生邱晓明福建医科大学附属龙岩市第一医院病理科福建龙岩364000

目的探讨rcan2在结直肠癌组织中的表达及与临床病理的相互关系。方法方便收集该院2012年1月—2017年1月期间诊治的炎症性肠病20例、增生性息肉20例、腺瘤40例、结直肠癌及其癌旁正常组织80例,获取标本总RNA,q PCR测定rcan2 m RNA表达水... 详细信息

目的探讨rcan2在结直肠癌组织中的表达及与临床病理的相互关系。方法方便收集该院2012年1月—2017年1月期间诊治的炎症性肠病20例、增生性息肉20例、腺瘤40例、结直肠癌及其癌旁正常组织80例,获取标本总RNA,q PCR测定rcan2 m RNA表达水平,对rcan2 m RNA的差异表达与结直肠癌患者临床病理信息进行相关性分析。体外转染rcan2基因于结直肠癌colo320DM细胞,MTT实验观察rcan2过表达对肿瘤细胞增殖的影响。体外转染kras突变基因(G12V)于人结直肠癌细胞中,观察rcan2基因的表达情况。结果结直肠癌组织中rcan2 m RNA表达量(2.98±0.21)明显高于其他各组。rcan2 m RNA的表达量与肿瘤大小密切相关(Prcan2-pcdna3.1转染的细胞增长速度慢,OD值从10上升到14,而pcdna3.1转染的细胞增长速度快,OD值从12上升到18,过表达kras(G12V)抑制rcan2基因表达。rcan2相对表达量从2.8下降到1.1。结论这些发现提示rcan2是一个潜在的结直肠癌诊断指标。

关键词： rcan2 实时荧光定量PCR 结直肠癌 mRNA

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