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rassf4在糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病中的作用及机制研究

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RASSF4在糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病中的作用及机制研究

作者：许朝飞天津医科大学

学位级别：硕士

目的:糖尿病的发病率正不断增高;同时,大量流行病学研究还表明糖尿病患者肝癌的患病率也在不断增高,但糖尿病如何促进肝癌发生及进展的机制仍不清楚。糖尿病患者常同时患有非酒精性脂肪性肝病,随着肝脏中脂肪变性、炎症以及纤维化的增加... 详细信息

目的:糖尿病的发病率正不断增高;同时,大量流行病学研究还表明糖尿病患者肝癌的患病率也在不断增高,但糖尿病如何促进肝癌发生及进展的机制仍不清楚。糖尿病患者常同时患有非酒精性脂肪性肝病,随着肝脏中脂肪变性、炎症以及纤维化的增加,NAFLD逐渐发展为NASH;若未能及时进行治疗干预,疾病可能发展为肝癌。因此,对于这三种疾病关系的机制研究有待进一步进行。本研究旨在寻找糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病向肝癌进展的关键靶基因,从而帮助指导临床进行靶向治疗。方法:1、以16周龄db/db与对照的db/m小鼠为研究对象,并通过RT-PCR、Western blot、免疫荧光检测小鼠肝组织脂肪变性、炎症和纤维化水平的差异。进一步对小鼠肝脏进行全基因组转录组测序,然后对测序结果分析、筛选出一个关键的肿瘤相关基因rassf4,并在小鼠肝组织中进行验证。2、在NASH患者中检测rassf4的表达水平;同时选择14周龄db/db与db/m小鼠,并在db/db小鼠中进行rassf4的过表达,2周后通过RT-PCR、Western blot和HE染色检测小鼠肝脏的纤维化相关指标的表达差异。以肝星状细胞(LX2)和HL-77O2为研究对象,分别对HL7702进行高糖高脂干预、rassf4的过达或敲减的处理后再与LX2共培养,并通过Western blot检测LX2纤维化水平的改变。3、通过分析小鼠肝脏转录组测序结果以及STRING网站分析,发现目的基因可能调节Hippo通路。然后通过RT-PCR和Western blot检测Hippo通路中关键基因的表达水平。进一步通过CO-IP检验rassf4的相互作用蛋白。4、以肝癌和癌旁组织以及正常肝细胞(HL-7702)和三种不同肝癌细胞(Hep G2、MHCC-97H、Huh7)为研究对象,通过RT-PCR和Western blot检测rassf4的表达水平。同时通过Kaplan-Meier plotter数据库对rassf4不同表达水平的人群绘制生存曲线。5、根据不同肝癌细胞中rassf4表达水平的不同,选择表达较高的Hep G2细胞,并通过si RNA敲减rassf4的表达;选择表达较低的MHCC-97H细胞,并通过转染质粒进行rassf4的过表达。Western blot和RT-PCR验证后进一步通过划痕实验、Transwell实验、Ed U增殖实验检测目的基因表达水平改变对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖的影响,并对细胞的凋亡水平进行检测。进一步通过同样的方法进行高糖高脂对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖影响的检测。6、在Hep G2细胞中通过慢病毒进行rassf4的稳定过表达,再进行裸鼠皮下成瘤和集落形成实验,以研究rassf4对肝癌细胞成瘤能力的影响。7、通过使用Hippo通路的抑制剂XMU-MP-1,进一步在Hep G2细胞中通过划痕实验、Transwell实验以及Ed U实验,检测抑制Hippo通路对rassf4发挥效应的影响。结果:1、与db/m小鼠相比,db/db小鼠肝脏纤维化相关因子α-SMA、Desmin、TGF-β的蛋白表达明显升高;α-SMA的免疫荧光也得到了相同的结果;db/db小鼠肝脏HE染色可见更多的脂肪空泡,油红染色也看到大量的脂滴沉积。RT-PCR显示db/db小鼠肝脏脂肪合成因子CD36表达增强,脂解因子Sh REBP-1c表达下降,Western blot同样验证了CD36的表达;同时炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的蛋白表达水平也增强。2、对小鼠肝组织测序结果分析筛选得到了和肿瘤相关的基因rassf4;rassf4在db/db小鼠中表达下降,是一种潜在的抑癌基因。在NASH患者中rassf4的RNA和蛋白表达水平是下降的。过表达rassf4的db/db小鼠肝脏纤维化相关蛋白COL1A1、COL4A1、FN1、α-SMA和Desmin的表达水平明显降低。同时,肝细胞中过表达rassf4可以部分逆转高糖高脂干预肝细胞对肝星状细胞的激活作用,Western blot结果显示激活相关蛋白α-SMA、Desmin、TGF-β的蛋白表达水平降低;相反,敲低rassf4的肝细胞可以激活肝星状细胞,进而导致纤维化相关蛋白表达水平的增高。3、STRING网站查询显示rassf4可能作用蛋白均与Hippo通路有很大关联,同时RT-PCR和Western blot结果显示出rassf4可以通过刺激Hippo通路而抑制YAP1的磷酸化和入核。CO-IP结果则显示rassf4与Hippo通路中上游的MST1蛋白存在相互作用。4、rassf4在肝癌组织和肝癌细胞中的RNA和蛋白表达均是下降的;生存曲线显示较高水平的rassf4生存率更高。5、在敲低rassf4的Hep G2肝癌细胞中,细胞的迁移、侵袭和增殖能力

关键词：糖尿病非酒精性脂肪性肝病肝癌 rassf4 Hippo通路纤维化

rassf4在骨骼肌成肌细胞分化与融合过程中的作用

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RASSF4在骨骼肌成肌细胞分化与融合过程中的作用

作者：马学芳吉林大学

学位级别：硕士

背景:骨骼肌占人体体重的40%,在运动和能量代谢中发挥重要作用,是人体最重要的组织之一。骨骼肌由大量的肌纤维构成,每个多核肌纤维则是通过单核成肌细胞分化及融合而成。骨骼肌损伤后修复是通过单个肌卫星细胞（一种肌肉干细胞）激活... 详细信息

背景:骨骼肌占人体体重的40%,在运动和能量代谢中发挥重要作用,是人体最重要的组织之一。骨骼肌由大量的肌纤维构成,每个多核肌纤维则是通过单核成肌细胞分化及融合而成。骨骼肌损伤后修复是通过单个肌卫星细胞（一种肌肉干细胞）激活、分化并相互融合形成新生纤维来完成的。骨骼肌的发育与损伤后修复对于生命活动的维持具有重要意义,成肌细胞融合是此过程中的重要环节。研究成肌细胞融合的机制对骨骼肌的正常发育以及损伤后修复至关重要。本研究主要通过建立动物损伤模型以及体外诱导成肌细胞融合两种方法来探究成肌细胞融合的机制。研究发现小GTP酶ARF6可以通过PLD1/PIP5K-PIP2促进成肌细胞融合。ARF6有GTP结合的激活形式和GDP结合的非激活形式两种状态,我们利用ARF6-Q67L/T44N质粒突变来模拟ARF6的两种状态,来研究ARF6在各种细胞活动中的作用机制。研究表明rassf4可以通过ARF6-PIP5K-PIP2来调节SOCE和ER-PM的连接,他们发现rassf4更易与ARF6-GDP形式结合。研究表明,rassf4可以促进人骨骼肌原代细胞的肌源性分化,但其机制需要进一步研究。因此,本研究将探究rassf4在成肌细胞分化与融合过程中的作用,以及在成肌细胞中rassf4与ARF6的关系。目的:1.研究rassf4在成肌细胞分化与融合过程中的作用。2.研究在成肌细胞中,rassf4与ARF6的关系。方法:1.利用RT-PCR以及q PCR检测rassf4在骨骼肌形成过程、骨骼肌损伤后修复过程以及体外诱导成肌细胞分化融合过程中的表达情况。2.在小鼠成肌细胞系C2C12中过表达或敲低rassf4,通过免疫荧光和Western blot检测myogenin、myosin的表达水平,以及统计融合指数来观察rassf4对成肌细胞分化与融合的影响。3.在C2C12中同时过表达rassf4-YFP和ARF6-Q67L/T44N-HA（持续GTP结合的激活状态/GDP结合的非激活状态）,通过Co-IP以及免疫荧光共定位来研究rassf4与ARF6的关系。4.在小鼠成肌细胞C2C12中过表达rassf4之后观察ARF6-GTP形式的表达变化。结果:***-PCR以及q PCR结果显示在骨骼肌形成过程、骨骼肌损伤后修复过程以及体外诱导成肌细胞分化与融合的过程中,rassf4的表达都显著上升。2.小鼠成肌细胞C2C12过表达rassf4后其myogenin以及myosin的表达增加,融合指数也增高;而敲低rassf4之后,C2C12中myogenin以及myosin的表达下降,同时,其融合指数也降低。3.小鼠成肌细胞C2C12过表达rassf4-YFP以及ARF6-Q67L/T44N-HA之后,Co-IP结果显示,C2C12未分化时（D0）以及分化后（D2）,rassf4都可以和ARF6结合,并且优先和ARF6-T44N结合;对rassf4-YFP+ARF6-T44N-HA C2C12进行免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察发现,rassf4-YFP与ARF6-T44N-HA共定位。4.成肌细胞C2C12过表达rassf4之后,内源性ARF6-GTP表达升高。结论:***4可以促进成肌细胞的分化与融合过程。***4可以通过调节ARF6的活性来调节成肌细胞的融合。

关键词：成肌细胞的分化与融合 rassf4 ARF6

rassf4对骨骼肌成肌细胞分化融合的影响及作用机制

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RASSF4对骨骼肌成肌细胞分化融合的影响及作用机制

作者：阮宁吉林大学

学位级别：硕士

背景:骨骼肌是附着在骨骼上的肌肉组织,是人体三大肌肉组织之一,参与机体运动和能量代谢。骨骼肌的发育和损伤后修复与成肌细胞密切相关。骨骼肌由成肌细胞发育而来,成肌细胞分化融合形成多核合胞体-肌纤维,肌纤维束状排列最终发育形成... 详细信息

背景:骨骼肌是附着在骨骼上的肌肉组织,是人体三大肌肉组织之一,参与机体运动和能量代谢。骨骼肌的发育和损伤后修复与成肌细胞密切相关。骨骼肌由成肌细胞发育而来,成肌细胞分化融合形成多核合胞体-肌纤维,肌纤维束状排列最终发育形成骨骼肌。骨骼肌具有显著的再生能力,当其受损时,肌卫星细胞被激活为成肌细胞,成肌细胞分化融合对骨骼肌进行修复。当骨骼肌不能正常发育或损伤修复时,机体会产生各种疾病,如先天性肌病。因此,骨骼肌的正常发育和损伤修复对于机体有重要意义,研究成肌细胞分化融合机制则至关重要。研究发现,rassf4在人原代成肌细胞的体外分化过程中m RNA及蛋白表达水平发生改变,但其是否参与体内肌生成过程及其作用机制尚不清楚。rassf4与ARF6密切相关:ARF6通过激活PLD和PIP5K产生PA和PIP2从而促进成肌细胞分化融合,而rassf4与PIP5K联合同样可以调控PIP2的产生;在He La细胞中,rassf4与ARF6-GDP相互作用促进ARF6激活。那么在成肌细胞中rassf4是否能通过作用于ARF6从而调节成肌细胞分化融合?它又是否还有其他作用机制?因此,本论文旨在探讨rassf4是否参与体内外成肌细胞分化融合过程及其作用机制,以进一步阐明成肌细胞分化融合机制,为肌病的治疗提供理论基础。目的:***4是否参与骨骼肌成肌细胞分化融合。***4调节骨骼肌成肌细胞分化融合的作用机制。方法:1.利用Western blot及q PCR检测rassf4在小鼠成肌细胞分化融合过程、骨骼肌发育过程以及骨骼肌损伤后修复过程中的表达情况。2.在骨骼肌损伤修复的原代成肌细胞中,通过Western blot及Co-IP来研究rassf4与ARF6的关系。3.构建rassf4截短体质粒并转染小鼠成肌细胞系C2C12,观察蛋白定位;通过Western blot检测myogenin、myosin的表达水平来观察其是通过哪一结构域影响成肌细胞分化融合。结果:*** blot及q PCR结果显示rassf4在小鼠成肌细胞分化融合过程、骨骼肌发育过程以及骨骼肌损伤后修复过程中的表达都升高。*** blot结果显示,在骨骼肌损伤修复的原代成肌细胞中,rassf4与ARF6的表达均显著性增加;Co-IP结果显示,无论骨骼肌发不发生损伤修复,原代成肌细胞中,内源性rassf4都可以和ARF6发生免疫共沉淀,并且在发生损伤修复的原代成肌细胞中结合的更多。***4的SARAH结构域中可能含有核外转运信号;rassf4是一种穿梭蛋白;删除SARAH结构域后,rassf4在核中驻留且可以促进成肌细胞分化融合。结论:***4参与骨骼肌成肌细胞分化融合。***4通过作用于ARF6调节成肌细胞分化融合。***结构域决定rassf4的细胞定位,并且删除SARAH结构域可促进成肌细胞分化融合。

关键词：骨骼肌成肌细胞成肌分化融合 rassf4 ARF6

rassf4的异常表达在非小细胞肺癌中的意义

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现代肿瘤医学 2016年第13期24卷 2048-2051页

作者：刘洋韩勇董千泽王恩华中国医科大学基础医学院病理学教研室辽宁沈阳110001

目的:探讨rassf4在非小细胞肺癌中的表达模式和意义。方法:应用免疫组化及Western Blot方法,检测并分析89例非小细胞肺癌样本中rassf4的表达情况及其与临床病理因素的相关性。结果:在非小细胞肺癌组织中,41.57%(37/89)出现rassf4的表达... 详细信息

目的:探讨rassf4在非小细胞肺癌中的表达模式和意义。方法:应用免疫组化及Western Blot方法,检测并分析89例非小细胞肺癌样本中rassf4的表达情况及其与临床病理因素的相关性。结果:在非小细胞肺癌组织中,41.57%(37/89)出现rassf4的表达下调,并且其异常表达与患者的高TNM分期(P=0.005)、淋巴结转移(P=0.024)及患者不良预后(P=0.018)相关。在肺癌细胞系中,我们在部分细胞系(57.14%,4/7)中发现了rassf4的异常表达。结论:rassf4蛋白的弱表达可能是判断非小细胞肺癌恶性程度的重要标志之一。

关键词： rassf4 非小细胞肺癌临床病理因素预后

肺癌细胞中rassf4的高表达抑制肺癌细胞的增殖和侵袭能力

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现代肿瘤医学 2016年第14期24卷 2190-2194页

作者：刘洋韩勇王恩华中国医科大学基础医学院病理学教研室辽宁沈阳110001

目的:探讨rassf4在肺癌中的增殖和侵袭能力。方法:向肺癌细胞系H460和A549中导入rassf4的c DNA质粒后,通过MTT、克隆形成实验、基质胶侵袭实验、流式细胞术等方法检测肺癌细胞的生长和侵袭能力。结果:rassf4能够通过下调MMP2、MMP9和cyc... 详细信息

目的:探讨rassf4在肺癌中的增殖和侵袭能力。方法:向肺癌细胞系H460和A549中导入rassf4的c DNA质粒后,通过MTT、克隆形成实验、基质胶侵袭实验、流式细胞术等方法检测肺癌细胞的生长和侵袭能力。结果:rassf4能够通过下调MMP2、MMP9和cyclin D1的表达,抑制肺癌细胞的侵袭、增殖及克隆形成能力。结论:rassf4在肺癌细胞中通过抑制细胞生长及侵袭能力发挥重要的肿瘤抑制功能。

关键词： rassf4 肺癌增殖侵袭

基于CYTH2靶标抗肺癌小分子抑制剂的筛选验证

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基于CYTH2靶标抗肺癌小分子抑制剂的筛选验证

作者：王小惠华中农业大学

学位级别：硕士

在工业化,城市化和环境污染的情况下,肺癌是临床上发病率死亡率最高的癌症。肺癌的控制已引起世界范围的关注,NSCLC(非小细胞肺癌)在肺癌中占80%。非小细胞肺癌中最常见的是鳞癌、大细胞、腺癌。美国2020年肿瘤药物支出达到710亿美元,... 详细信息

在工业化,城市化和环境污染的情况下,肺癌是临床上发病率死亡率最高的癌症。肺癌的控制已引起世界范围的关注,NSCLC(非小细胞肺癌)在肺癌中占80%。非小细胞肺癌中最常见的是鳞癌、大细胞、腺癌。美国2020年肿瘤药物支出达到710亿美元,我国开发的抗肿瘤药物数量和速度均显著低于欧美国家。目前,分子靶向药物已经逐步成为肺癌的重要治疗手段,靶向药物具有很好的应用前景。Cytohesin-2(CYTH2)在生物体内广泛表达并且十分保守,主要参与ARF中GTP与GDP的转化,在癌细胞的迁移、凋亡、增殖、分化、免疫反应中起到了信号转导的作用。CYTH2介导EGFR和IGF-1R两条信号通路促进肺癌细胞的迁移、增殖,抑制凋亡,另外β整合素在恶性肿瘤中常恶性表达,参与细胞迁移,增殖,肿瘤血管生成等多种功能,整合素1再循环受CYTH2调节。CYTH2敲除可以减少肺癌细胞的粘附、扩散和迁移。CYTH2是肿瘤的潜在靶点,本文通过计算机虚拟筛选技术,基于CYTH2蛋白晶体结构寻找CYTH2蛋白的抑制剂,取得了如下成果:***2靶标是A549肺癌细胞发生发展中关键靶点设计购买小RNA,相关试验验证小RNA干扰CYTH2可以抑制A549肺癌细胞的迁移、增殖和促进凋亡。构建pc DNA3.0(+)-CYTH2真核表达载体,发现超表达CYTH2可以促进A549肺癌细胞的迁移和增殖。荧光定量PCR验证si RNA干扰CYTH2、超表达CYTH2对其上下游通路的影响:si RNA干扰CYTH2,可以显著抑制CYTH2上下游相关信号通路中MAP2K3、IGF-1R基因的转录水平,抑制IRS和AKT基因的转录水平。超表达CYTH2可显著上调CYTH2基因的转录水平,同时促进其上下游通路IGF-1R、IRS、AKT基因转录水平。2.基于CYTH2的橄榄苦苷、淫羊藿苷在A549细胞上的体内外药效学研究分子对接技术寻找到了橄榄苦苷、淫羊藿苷两种小分子化合物,CCK8试验寻找两种化合物在A549肺癌细胞上的后续试验浓度。采用划痕试验、细胞集落试验、Ed U试验、流式细胞术检测细胞凋亡对其在A549非小细胞肺癌细胞上进行效果验证,发现橄榄苦苷、淫羊藿苷5、10μM可以极显著抑制A549肺癌细胞的迁移、细胞集落形成,增殖、促进凋亡,抗肺癌效果优于已知的CYTH2靶点抑制剂Secin H3,与临床上经常使用的抗肺癌化疗药物顺铂相当。橄榄苦苷20 mg/kg体内裸鼠皮下成瘤试验验证,可以极显著抑制肿瘤的增长速度。33-40天(橄榄苦苷给药期)相比于20-30天,肿瘤体积、重量极显著减小。顺铂20 mg/kg对裸鼠的脾脏、肺脏、心脏、肝脏、肾脏均无明显毒性。免疫组化结果表明橄榄苦苷20 mg/kg组可以显著抑制肿瘤细胞内的肿瘤增殖指数Ki67的表达,且抑制能力优于顺铂20 mg/kg组;橄榄苦苷20 mg/kg组可以极显著抑制CYTH2的表达,极显著促进rassf4的表达。3.基于CYTH2的橄榄苦苷、淫羊藿苷在A549细胞上的作用机制研究对橄榄苦苷、淫羊藿苷作用于A549肺癌细胞的机制进行探索,RT-q PCR结果显示Secin H3 40、80、160μM,橄榄苦苷1.25、2.5、5、10μM、淫羊藿苷5、10μM均可以极显著抑制CYTH2基因的转录水平。由于A549细胞自身的负反馈调节,橄榄苦苷10μM、淫羊藿苷10μM可以极显著促进EGFR、rassf4、MAP2K3的转录水平;可以极显著促进IGF-1R基因的转录水平;淫羊藿苷10μM可以极显著促进IRS基因的转录水平;橄榄苦苷10μM可以极显著促进AKT基因的转录水平。Western Blot结果表明Secin H3 80μM、橄榄苦苷10μM、淫羊藿苷10μM均能极显著抑制CYTH2蛋白的表达,橄榄苦苷、淫羊藿苷10μM可极显著促进其下游rassf4-MAP2K3-p38蛋白的表达,促进rassf4下游Bax促凋亡蛋白,极显著促进Bim促凋亡蛋白的表达,还能极显著促进Caspase9促凋亡相关蛋白的表达进而促进A549肺癌细胞的凋亡。4.橄榄苦苷、淫羊藿苷可以与CYTH2、rassf4结合构建pET28a-CYTH2、pCold I-CYTH2原核表达载体并对其可溶性进行分析:CYTH2蛋白在p Cold I原核表达载体中表达效果最好,最优的诱导表达条件为16℃,摇床140 r/min,IPTG浓度为0.2 m M。采用该诱导表达条件大量制备扩菌,纯化CYTH2蛋白,得到浓度为3.930 mg/m L的CYTH2蛋白。等温滴定量热法(ITC)证明Secin H3、橄榄苦苷、淫羊藿苷可与CYTH2蛋白结合,结合常数分别为2.246×10、1.161×10、4.648×10且均为放热反应,均为中等结合强度。细胞热转移

关键词：分子对接 CYTH2 rassf4 肺癌橄榄苦苷淫羊藿苷