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中国农业科技导报 2012年第4期14卷 66-72页

作者：赵杨敏庞俊峰张占路姬澎尉亚辉吴燕民西北大学生命科学学院西安710069 中国农业科学院生物技术研究所北京100081 深圳市农科集团有限公司深圳518040

利用race-pcr技术,以深圳红树自然保护区的木榄为材料,克隆出一个ERF类转录因子基因的cDNA全长序列,命名为BgERF(GenBank序列号:GU593720)。生物信息学分析表明:该基因全长1 870 bp,完整开放阅读框1 425 bp,具有一个保守的AP2/EREBP结构... 详细信息

利用race-pcr技术,以深圳红树自然保护区的木榄为材料,克隆出一个ERF类转录因子基因的cDNA全长序列,命名为BgERF(GenBank序列号:GU593720)。生物信息学分析表明:该基因全长1 870 bp,完整开放阅读框1 425 bp,具有一个保守的AP2/EREBP结构域,且编码的由475个氨基酸组成的蛋白具有典型的1个α螺旋,3个β转角的三维结构,在AP2/EREBP结构域的第14位为丙氨酸(A),第19位为天冬氨酸(D),属于AP2/EREBPF蛋白家族中的ERF类转录因子;NCBI-BLAST比对结果表明:该基因与胡萝卜、拟南芥、水稻、辣椒、番茄、大豆、马铃薯、陆地棉等植物ERF类转录因子具有较高的同源性;并构建了高效植物表达载体PBI121-35s-BgERF,获得的转基因烟草与野生型相比,表现出明显的耐盐性,为该基因功能的深入分析和耐盐机理的研究奠定了基础。

关键词：木榄 race-pcr技术 AP2/EREBPF蛋白 ERF转录因子生物信息学

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稻曲病菌T-DNA插入突变体B1178、B3277侧翼致病相关基因的克隆及功能初步分析

稻曲病菌T-DNA插入突变体B1178、B3277侧翼致病相关基因的克隆及...

引用

作者：郑梦婷南京农业大学

学位级别：硕士

稻曲病是由水稻中的病原真菌稻曲病菌导致。本文研究是基于农杆菌介导的转化(ATMT)技术。构建了一个稻曲病菌突变体库,其出发菌株为P1。通过分析了一个突变菌株B3277,在稻曲病菌库中由于T-DNA插入致病性增强,为解析稻曲病菌的致病分子... 详细信息

稻曲病是由水稻中的病原真菌稻曲病菌导致。本文研究是基于农杆菌介导的转化(ATMT)技术。构建了一个稻曲病菌突变体库,其出发菌株为P1。通过分析了一个突变菌株B3277,在稻曲病菌库中由于T-DNA插入致病性增强,为解析稻曲病菌的致病分子机理提供方法基础。统计分析突变菌株B3277的生物学性状,致病性,生长速率,产孢能力等。发现与野生菌株P1相比,突变菌株B3277在固体培养基PSA、TB3和MM上的生长速率和在液体PS培养基中的产孢能力均有下降,但其在田间的致病性却显著增强。经pcr技术扩增T-DNA中的基因GFP和HPH,验证了T-DNA已插入在B3277的基因组DNA中。同时利用Southern blot杂交技术,分析在外源基因B3277基因组DNA的插入,判断T-DNA拷贝。结果表明,T-DNA是以单拷贝的形式插入在B3277基因组DNA中。运用hiTAIL-pcr技术扩增获得B3277中T-DNA侧翼两端的稻曲序列,长度分别为258bp (***)和347bp (***), T-DNA的LB端序列只丢失了66bp,相反RB端大部分丢失,只剩下55bp。突变菌株B3277致病力增强,且T-DNA的RB和LB均有丢失,推测原因可能是由于T-DNA的插入导致。根据hiTAIL-pcr获得T-DNA插入位点的侧翼序列设计引物,同时结合race-pcr技术克隆T-DNA侧翼基因全长,获得一个侧翼基因Uvt3277, T-DNA插入在基因中间。对Uvt3277进行生物信息学方面的分析,发现其与一些真菌中的低亲和力铁转运蛋白有很高分的同源性。在PSA培养基上测定B3277对FeSO4的吸收能力测定,发现在一定浓度范围内能够利用FeSO4正常生长,P1则会受到抑制生长减慢,推测该突变体缺失基因与亚铁离子有关。半定量RT-pcr分析基因表达情况,结果表明,Uvt3277在B3277中与P1相比不表达。本试验结果获得了一个突变稻曲病菌B3277的T-DNA侧翼的基因Uvt3277 (GeneBank登录号No.:KJ158162),且与低亲和力转运蛋白相关,推断该基因在稻曲病菌致病过程中起着重要作用,为解析稻曲病菌的致病分子机理提供了重要线索。通过分析稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱的突变菌株B1178,统计分析了突变茵株B1178的生长速率,产孢能力、致病力等生物学性状。发现与野生菌株P1相比,突变菌株B1178在固体培养基PSA、TB3和MM上的生长速率和在液体PS培养基中的产孢能力均有下降,并且在田间的致病性也下降。经pcr技术扩增T-DNA中的基因GFP和HPH,验证了T-DNA已插入在B1178的基因组DNA中。同时利用Southern杂交技术分析B1178外源基因插入的拷贝数,结果显示T-DNA在B1178中是单拷贝的形式插入。运用hiTAIL-pcr技术扩增获得B1178中T-DNA侧翼两端的稻曲序列,长度分别为291bp(***)和311bp(***), T-DNA的LB端序列全部存在297bp,相反RB端大部分丢失,302bp中只剩下17bp。突变菌株B1178致病力减弱,生物学表型发生变化且T-DNA的RB端大部分丢失,推测原因可能是由于T-DNA的插入导致。

关键词：稻曲病菌生物学特性致病性 race-pcr技术生物信息学

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