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松花粉提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞糖脂代谢的影响

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食品与发酵工业 2019年第6期45卷 83-90页

作者：赵可心夏凯苑鹏温霖李爱民李永强段盛林中国食品发酵工业研究院有限公司北京100015 功能主食创制与慢病营养干预北京市重点实验室北京100015 国珍健康科技(北京)有限公司北京102206

研究松花粉提取物对胰岛素抵抗Hep G2细胞糖脂代谢的影响,探究其潜在分子机制。采用游离脂肪酸构建Hep G2细胞胰岛素抵抗模型,经油红O染色确认模型成功后,采用MTT法研究不同极性的松花粉提取物对细胞增殖的影响。测定各组上清葡萄糖,胞... 详细信息

研究松花粉提取物对胰岛素抵抗Hep G2细胞糖脂代谢的影响,探究其潜在分子机制。采用游离脂肪酸构建Hep G2细胞胰岛素抵抗模型,经油红O染色确认模型成功后,采用MTT法研究不同极性的松花粉提取物对细胞增殖的影响。测定各组上清葡萄糖,胞内糖原,上清甘油三酯(TG),胞内TG以及胞内总胆固醇(TC)的含量,实时荧光pcr定量检测细胞裂解液中的调控糖脂代谢关键基因In SR、PI3K以及GLUT-4的mRNA表达水平。结果表明,不同极性的松花粉提取物在质量浓度为100～500μg/m L时,对细胞无明显毒性;不同极性的松花粉提取物能够促进细胞吸收葡萄糖,抑制糖原降解,抑制TG和TC的形成,促进TG向细胞外转运,从而改善Hep G2胰岛素抵抗状况。各松花粉处理组细胞PI3K以及GLUT-4 mRNA表达量均上调,说明松花粉能够激活PI3K/Akt/GLUT-4通路从而促进糖代谢;乙酸乙酯相(AE),正丁醇相(BU)和水相(WT)组细胞In SR mRNA表达量显著上调,说明这3种提取物能够通过提高胰岛素的敏感性改善胰岛素抵抗。

关键词：松花粉糖脂代谢 q-rt-pcr InSR PI3K GLUT-4

肝癌组织及细胞系总RNA抽提逆转及基因克隆方法的改进与比较

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Zoological Research 2009年第5期30卷 520-526页

作者：易濒常宏曹毅中国科学院动物模型与人类疾病机理重点实验室云南昆明650223 中国科学院研究生院北京100049

该文建立了高效肝组织及细胞总RNA抽提、反转录以进行基因克隆和实时定量pcr(q-rt-pcr)的方法。比较了2种反转录酶(M-MLV和SuperScriptII)、2种cDNA合成引物(OligodT和random 6 primer)对总RNA反转录效率的影响,与4种DNA聚合酶(Taq聚合... 详细信息

该文建立了高效肝组织及细胞总RNA抽提、反转录以进行基因克隆和实时定量pcr(q-rt-pcr)的方法。比较了2种反转录酶(M-MLV和SuperScriptII)、2种cDNA合成引物(OligodT和random 6 primer)对总RNA反转录效率的影响,与4种DNA聚合酶(Taq聚合酶、Pfu聚合酶、LAtaq聚合酶、Prime Star聚合酶)进行长片段基因克隆的能力及效率;同时,该研究比较了不同质量总RNA对有效进行q-rt-pcr与长片段分子克隆的影响。新建立的RNA提取方法使得RNA完整性和均一性提高。RNA的完整性及均一性对长片段cDNA的克隆至关重要。部分降解的组织RNA及细胞RNA仅适合于q-rt-pcr检测mRNA的表达水平,而不适合于cDNA的克隆。

关键词：肝癌组织及细胞系总RNA抽提反转录 q-rt-pcr 长片段基因克隆

E-钙黏素mRNA在大鼠舌黏膜癌变过程中的表达研究

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口腔医学研究 2016年第1期32卷 31-34页

作者：谭红毛亮王敏廖鹏程聂敏海四川医科大学口腔医学院四川泸州646000 四川医科大学口颌面重建和再生实验室四川泸州646000 四川医科大学医学电生理学教育部重点实验室四川泸州646000

目的:研究上皮型黏附分子E-钙粘素mRNA在大鼠舌黏膜癌变过程中的表达及其意义。方法:采用4NqO饮水法诱导大鼠舌鳞状细胞癌发生,实时荧光定量pcr技术检测组织标本中E-钙粘素mRNA的表达情况。结果:在大鼠舌鳞状细胞癌发生过程中E-钙粘素m... 详细信息

目的:研究上皮型黏附分子E-钙粘素mRNA在大鼠舌黏膜癌变过程中的表达及其意义。方法:采用4NqO饮水法诱导大鼠舌鳞状细胞癌发生,实时荧光定量pcr技术检测组织标本中E-钙粘素mRNA的表达情况。结果:在大鼠舌鳞状细胞癌发生过程中E-钙粘素mRNA表达降低;上皮单纯增生组、轻度上皮异常增生组、中度和重度上皮异常增生组、鳞状细胞癌组4组标本中E-钙粘素mRNA的表达量分别是上皮正常组标本中的0.453541倍、0.207062倍、0.190954倍、0.180987倍,且鳞状细胞癌组与上皮正常组间的差异具有统计学意义。结论:在大鼠舌黏膜癌变过程中E-钙粘素mRNA表达随着病理分级的增加呈逐渐降低的趋势。E-钙粘素mRNA表达变化是大鼠舌黏膜癌变过程中的早期事件。

关键词：舌鳞状细胞癌 E-cad mRNA q-rt-pcr

南方根结线虫MiMEK2、MiLIN45基因的分离及其表达分析

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南方根结线虫MiMEK2、MiLIN45基因的分离及其表达分析

作者：徐国凯中国农业科学院

学位级别：硕士

Ras-MAPK是一类重要的信号途径,现已知所有真核细胞中均存在Ras/Raf/Mek/Erk这一高度保守的细胞信号传导通路,这一信号传导通路广泛参与细胞的生长、增殖、分化、凋亡、转移等过程。Ras/Raf/Mek/Erk信号通路是MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)... 详细信息

Ras-MAPK是一类重要的信号途径,现已知所有真核细胞中均存在Ras/Raf/Mek/Erk这一高度保守的细胞信号传导通路,这一信号传导通路广泛参与细胞的生长、增殖、分化、凋亡、转移等过程。Ras/Raf/Mek/Erk信号通路是MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)众多通路中的一个,深入研究植物寄生线虫中的Ras-MAPK通路对运用抗线虫基因工程策略进行根结线虫的防治具有重要意义。本研究通过rt-pcr的方法克隆了南方根结线虫MiMEK2(Mek)和MiLIN45(Raf)基因,利用rt-pcr和q-rt-pcr分析了其在南方根结线虫不同虫态中的表达情况,并进一步对MiMEK2和MiLIN45基因进行了酵母表达,初步探索了信号传导途径在根结线虫寄生取食行为中的作用,为抗线虫育种研究提供了重要参考。研究结果如下:1.南方根结线虫MiMEK2、MiLIN45基因克隆及基因结构分析根据已测序成功的南方根结线虫基因组序列预测MiMEK2、MiLIN45基因cDNA全长序列,设计特异性引物,利用rt-pcr的方法克隆得到了南方根结线虫MiMEK2、MiLIN45基因cDNA序列全长,长度分别为1241 bp、2592 bp(GenBank accession ***949543,***949544),均包含完整的开放阅读框,对应编码323个、863个氨基酸残基,MiMEK2基因DNA全长7497 bp,包含7个外显子,MiLIN45基因DNA全长4422 bp,包含17个外显子,与预测结果一致。通过EBI的Interpro数据库对全长序列进行分析,表明均为典型的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶家族,TMHMM程序分析两个基因均不包含跨膜结构,用ClustalW程序将推测的氨基酸序列与GenBank中C. elegans,M. arenaria,Drosophila melanogaster,C. briggsae,Brugia malayi,Rattus norvegicu氨基酸序列进行多序列比对,表明在氨基酸水平具有较高的相似性。2. rt-pcr、q-rt-pcr分析南方根结线虫MiMEK2、MiLIN45基因在不同虫态中的表达差异分别提取南方根结线虫卵块、2龄幼虫和雌虫的总RNA,反转录合成cDNA,根据MiMEK2和MiLIN45序列设计特异性引物,进行rt-pcr定性分析,并进一步以actin基因为参照,进行q-rt-pcr定量分析。分析显示MiMEK2和MiLIN45基因在南方根结线虫卵、2龄幼虫和雌虫中均有表达,但是MiMEK2基因在卵中的表达量最多,2龄幼虫中表达量最少;而MiLin45基因则在雌虫中表达量最多,2龄幼虫中表达量最少。说明MiMEK2和MiLIN45基因在南方根结线虫不同发育阶段的表达具有明显的差异,这种差异表达可能与其虫体不同发育阶段特有的生物学功能有关。3.南方根结线虫MiMEK2、MiLIN45基因的酵母表达利用双酶切、连接的方法重组毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了MiMEK2和MiLIN45基因酵母表达载体pPIC9K-M1、pPIC9K-M2。选用GS115作为毕赤酵母表达菌株,经电转化以及转化子表型鉴定、菌落pcr鉴定,获得了MiMEK2和MiLIN45基因酵母表达菌株GS115-pPIC9K-M1、GS115-pPIC9K-M2。甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE电泳分析显示,MiMEK2基因得到了准确表达,表达蛋白大小为35 kD,与推测结果一致。而MiLIN45基因并没有得到准确表达,这可能是由于MiLIN45基因较大及酵母表达菌株选取不当造成的基因表达不准确。

关键词：南方根结线虫 MiMEK2 MiLIN45 Ras-MAPK q-rt-pcr 毕赤酵母表达