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来源于pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达

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生物工程学报 2006年第4期22卷 545-549页

作者：杨宗岐李轶女张志芳王勇沈桂芳南开大学生命科学学院中国农业科学院生物技术研究所北京100081 中国农业科学院生物技术研究所

来源于pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶,在植物中表达耐高温α-淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。选择衣藻叶绿体基因组同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2和壮观霉素抗性基因,构建了来... 详细信息

来源于pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶,在植物中表达耐高温α-淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。选择衣藻叶绿体基因组同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2和壮观霉素抗性基因,构建了来源于pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶基因的衣藻叶绿体表达载体p64A。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中,经壮观霉素抗性(100mg/L)筛选,获得了9个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后,经PCR、Southernblot检测分析及暗培养,证实耐高温α-淀粉酶基因已整合到衣藻叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明,转基因衣藻表达产物具有耐高温α-淀粉酶活性,每克鲜重衣藻最高达77.5u。实验结果证明在植物叶绿体中表达工业酶制剂是可行的。

关键词： pyrococcus furiosus 耐高温α-淀粉酶叶绿体表达衣藻

基于内源Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统构建超嗜热火球菌pyrococcus yayanosii A1的基因敲降系统

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微生物学报 2021年第7期61卷 1920-1932页

作者：陈柔珂吕永新张欢欢宋庆浩徐俊上海交通大学微生物代谢国家重点实验室上海200240 上海交通大学生命科学技术学院上海200240

【目的】亚氏火球菌(pyrococcus yayanosii)A1菌株的最适生长温度为98℃,最适生长压力为5.2×10^(4) Pa,是研究此类严格厌氧、超嗜热和兼性嗜压古菌的环境适应性机制的良好材料。本研究基于P.yayanosii A1基因组中Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统... 详细信息

【目的】亚氏火球菌(pyrococcus yayanosii)A1菌株的最适生长温度为98℃,最适生长压力为5.2×10^(4) Pa,是研究此类严格厌氧、超嗜热和兼性嗜压古菌的环境适应性机制的良好材料。本研究基于P.yayanosii A1基因组中Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统,旨在建立可应用于此类古菌的基因表达敲降系统(gene knock-down system)。【方法】人工构建的mini-CRISPR簇,由内源性CRISPR簇Group 1的重复序列(repeats)和待敲降的淀粉酶基因(PYCH_13690)中的原间隔序列(protospacer)组成。将该mini-CRISPR簇插入到具有辛伐他汀抗性的穿梭载体pLMOShhp中,使之转录与目的基因mRNA匹配的crRNA,引导Cmr复合物对其进行切割。【结果】使用高静水压(HHP)诱导型启动子Phhp诱导mini-CRISPR簇表达时,淀粉酶基因的mRNA数量在5.2×10^(4) Pa静水压时下调到原来的67.05%,在1.0×10^(2) Pa静水压时下调为原来的49.69%;而使用组成型启动子Phmtb诱导mini-CRISPR簇表达时,淀粉酶基因的mRNA数量在5.2×10^(4) Pa静水压时下调为原来的58.48%,在1.0×10^(2) Pa静水压时下调为原来的23.97%。使用鲁戈氏碘液显色法对这两类基因表达敲降突变菌株的培养物中残留的淀粉含量进行分析,结果显示突变菌株的淀粉降解能力明显降低。【结论】在P.yayanosii A1中建立了基于内源Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统的基因敲降系统,可以用于抑制此类超嗜热嗜压古菌体内基因的表达。

关键词：超嗜热古菌嗜压微生物 pyrococcus yayanosii CRISPR-Cas 基因敲降

pyrococcus furiosus耐热淀粉酶工程菌的构建及直链麦芽寡糖的制备

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工业微生物 2013年第4期43卷 34-37页

作者：凡建刚褚仲梅张毅华东理工大学生物工程学院上海200237 中科院上海生命科学研究院上海200233 中科院合成生物学重点实验室上海200032

为了制备特定长度的直链麦芽寡糖,利用PCR方法得到了极端耐热古生菌激烈热球菌Pytococcus furiosus的耐热淀粉酶基因pfta,对其进行序列分析表明,其编码区含有1938 bp,编码含645个氨基酸残基的蛋白质。将该基因系列与表达载体pT7473连接... 详细信息

为了制备特定长度的直链麦芽寡糖,利用PCR方法得到了极端耐热古生菌激烈热球菌Pytococcus furiosus的耐热淀粉酶基因pfta,对其进行序列分析表明,其编码区含有1938 bp,编码含645个氨基酸残基的蛋白质。将该基因系列与表达载体pT7473连接,构建重组质粒pT7473-pfta,以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主表达。重组菌株经诱导表达后SDS-PAGE电泳结果显示有明显的分子量约76 kD的特异蛋白条带出现。表达的蛋白经过金属镍离子亲和层析纯化后电泳鉴定出现的条带与预期相符。以环糊精为原料,利用获取的PFTA的单点水解开环反应活性,在90℃、pH5.0、10 min的条件下,能够生产出特定长度的直链麦芽寡糖。

关键词： pyrococcus furiosus 淀粉酶环糊精麦芽寡糖

融合超嗜热菌pyrococcus furiosus红素氧还蛋白可提高靶蛋白的热稳定性

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生物技术通报 2021年第10期37卷 110-119页

作者：吴娇余桂珍袁航刘娴高艳秀龚明邹竹荣云南师范大学生命科学学院云南省生物质能源和环境生物技术重点实验室教育部生物质能源持续发展和应用工程研究中心昆明650500

热稳定性是功能蛋白(特别是酶蛋白)储存和使用的重要限制因子。许多商业酶因耐热性不能达到工业生产的热处理条件而无法被采用;另外,植物中与光合作用有关的关键酶也受高温抑制,从而导致农作物产量下降。因此,对酶蛋白进行分子改良以提... 详细信息

热稳定性是功能蛋白(特别是酶蛋白)储存和使用的重要限制因子。许多商业酶因耐热性不能达到工业生产的热处理条件而无法被采用;另外,植物中与光合作用有关的关键酶也受高温抑制,从而导致农作物产量下降。因此,对酶蛋白进行分子改良以提高其热稳定性,进而提升其功效和扩大其应用范围,具有重要的现实意义。选取3种典型的热稳定性差、易聚集但具有重要功能的酶蛋白(小桐子抗坏血酸过氧化物酶1即JcAPX1、大肠杆菌高丝氨酸-O-转琥珀酰酶即EcMetA、假单胞菌亚磷酸盐脱氢酶即PsPtxD)作为靶蛋白,鉴定出超嗜热菌pyrococcus furiosus的小分子红素氧还蛋白(rubredoxin)能够作为热稳定融合标签,提高大肠杆菌重组表达靶蛋白的可溶性、热稳定性及其活性的耐热能力,为通过融合表达策略提高目标蛋白的热稳定性并强化其应用提供了一个新的技术选择。

关键词：蛋白热稳定性融合标签超嗜热菌 pyrococcus furiosus 红素氧还蛋白

古菌pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达

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微生物学通报 2003年第3期30卷 22-25页

作者：沈微华国强王正祥唐雪明诸葛健江南大学生物工程学院和教育部工业生物技术重点实验室无锡214036

用PCR方法从嗜热古菌pyrococcusfuriosus的基因组DNA中扩增出胞外α 淀粉酶成熟肽结构基因 ,插入 pUC19中构建成质粒 pUC19 amy。将 pUC19 amy外源片段接入酿酒酵母表达载体 pYX2 12多克隆位点 ,构建成载体 pYX2 12 amy ,电转化酿酒酵... 详细信息

用PCR方法从嗜热古菌pyrococcusfuriosus的基因组DNA中扩增出胞外α 淀粉酶成熟肽结构基因 ,插入 pUC19中构建成质粒 pUC19 amy。将 pUC19 amy外源片段接入酿酒酵母表达载体 pYX2 12多克隆位点 ,构建成载体 pYX2 12 amy ,电转化酿酒酵母W 30 3 1A。转化子成功表达出有活性的高嗜热α 淀粉酶。重组酶具有与P furiosus产生的胞外α 淀粉酶相似的酶学性质 :最适 pH为 5 0 ,最适温度约为 90℃ ,在 12 1℃下热处理 30min酶活仍能保持 5 0

关键词： pyrococcus furiosus 胞外α-淀粉酶酿酒酵母

极端嗜热菌pyrococcus furiosus热休克蛋白HSP60的克隆表达和纯化

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安徽农业科学 2009年第4期37卷 1483-1486,1501页

作者：陈华友张志燕吴岩张毅江苏大学生命科学研究院江苏镇江212013 中国科学院上海生命科学研究院上海200233

[目的]研究极端嗜热菌pyrococcus furiosus的热休克蛋白HSP60(Pfu-HSP60)的克隆表达与纯化方法。[方法]应用加拿大HSP60数据库及其BLAST和FASTA序列比较工具对Pfu-HSP60基因序列进行同源性分析,对HSP60基因进行了体外扩增并在大肠杆菌... 详细信息

[目的]研究极端嗜热菌pyrococcus furiosus的热休克蛋白HSP60(Pfu-HSP60)的克隆表达与纯化方法。[方法]应用加拿大HSP60数据库及其BLAST和FASTA序列比较工具对Pfu-HSP60基因序列进行同源性分析,对HSP60基因进行了体外扩增并在大肠杆菌中成功克隆与表达,还进行了Pfu-HSP60蛋白的纯化。[结果]以Taq酶为DNA聚合酶,用PCR方法扩增出预期的Pfu-HSP60基因,插入质粒pET-21a,转化入大肠杆菌受体菌BL21-Codonplus(DE)3-RIL,0.1mmol/LIPTG诱导2 h,得到可溶性高表达,经超声、离心、上清85℃加热、再离心得到初步纯化的Pfu-HSP60蛋白,再经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化,收集峰超滤浓缩后经SephacrylS-200凝胶过滤柱,收集Pfu-HSP60蛋白峰,结果获得纯度为94.5%以上的重组Pfu-HSP60蛋白,总得率为28.0%。[结论]该研究为Pfu-HSP60蛋白的结构和功能及其他热休克蛋白相互作用机制等的研究奠定基础。

关键词：热休克蛋白 pyrococcus furiosus 纯化极端嗜热菌

超高温古生菌强烈炽热球菌(pyrococcus furiosus)的生理代谢

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生命科学 2000年第4期12卷 189-192,184页

作者：和致中云南大学云南省微生物研究所昆明650091

本文述及pyrococcusfuriosus的丙酮酸代谢、麦芽糖发酵（高温糖酵解途径）、由丙酮酸糖原异生途径、还原性末端产物—L－丙氨酸的形成和钨对代谢类型的影响等。

关键词：超高温古生菌 pyrococcus furiosus 生理代谢

pyrococcus furiosus小分子热休克蛋白Pfu-sHSP的克隆表达和纯化

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信阳师范学院学报（自然科学版） 2009年第1期22卷 71-73页

作者：陈华友谭小力张志燕褚仲梅江苏大学生命科学研究院江苏镇江212013 中国科学院上海生命科学研究院上海200233

用PCR扩增嗜高温菌pyrococcus furiosus的小分子热休克蛋白基因后,克隆于质粒pT7473中.该小分子热休克蛋白Pfu-sHSP含有较多的稀有密码子,在大肠杆菌BL21(DE)3几乎无表达,而在带有大肠杆菌稀有密码子AGA(arg)AGG(arg),AUA(ile)和CUA(leu... 详细信息

用PCR扩增嗜高温菌pyrococcus furiosus的小分子热休克蛋白基因后,克隆于质粒pT7473中.该小分子热休克蛋白Pfu-sHSP含有较多的稀有密码子,在大肠杆菌BL21(DE)3几乎无表达,而在带有大肠杆菌稀有密码子AGA(arg)AGG(arg),AUA(ile)和CUA(leu)的BL21—Codonplus(DE)3—RIL中能大量表达.大量表达Pfu-sHSP蛋白的细胞用超声波破碎后,离心沉淀用85℃水浴20 min,再离心,上清液再以Q Sepha-rose Fast Flow阴离子交换和S-200凝胶过滤层析进一步纯化,可以得到90%以上的蛋白.

关键词：小分子热休克蛋白 pyrococcus furiosus 分子伴侣

共表达极端菌伴侣蛋白prefoldin提高P450 BM3突变体催化效率（英文）

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生物化学与生物物理进展 2017年第12期44卷 1125-1131页

作者：彭帅英褚仲梅陆坚峰李东晓王永红杨胜利张毅华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237 中国科学院上海生命科学研究院上海200031 中国科学院合成生物学重点实验室上海200031

P450 BM3来源于巨大芽孢杆菌,其突变体(A74G、F87V、L188Q、D168H)能够在大肠杆菌细胞内催化吲哚合成靛蓝.然而在常规的培养条件下(37℃,250 r/min),大肠杆菌细胞内靛蓝的生物转化量极低.本文将极端嗜热古菌pyrococcus furiosus的分子... 详细信息

P450 BM3来源于巨大芽孢杆菌,其突变体(A74G、F87V、L188Q、D168H)能够在大肠杆菌细胞内催化吲哚合成靛蓝.然而在常规的培养条件下(37℃,250 r/min),大肠杆菌细胞内靛蓝的生物转化量极低.本文将极端嗜热古菌pyrococcus furiosus的分子伴侣蛋白与P450 BM3突变体在大肠杆菌进行共表达,以研究分子伴侣蛋白是否能够提高靛蓝的生物转化量.实验结果表明,极端嗜热古菌的分子伴侣蛋白prefoldin能够显著提高靛蓝的产量.同时,实验结果发现prefoldin能够明显提高大肠杆菌细胞内的NADPH/NADP^+比率.鉴于NADPH是参与靛蓝生物转化过程的重要因素,靛蓝生物转化量的显著增加可能与该比率的提高有关.

关键词：细胞色素P450 BM3 大肠杆菌靛蓝 prefoldin pyrococcus furiosus