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PICK1和α-SNAP相互作用的初步研究

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PICK1和α-SNAP相互作用的初步研究

作者：张晓亮山西大学

学位级别：硕士

蛋白激酶C(?)相互作用蛋白(protein interacting with C(?) kinase,PICK1)是PKCα和膜上相应靶受体间的衔接蛋白,普遍存在于人与动物的各种细胞和组织内,其中小鼠来源的PICK1由416氨基酸残基组成,主要由N端的PDZ结构域和C端的BAR结构域... 详细信息

蛋白激酶C(?)相互作用蛋白(protein interacting with C(?) kinase,PICK1)是PKCα和膜上相应靶受体间的衔接蛋白,普遍存在于人与动物的各种细胞和组织内,其中小鼠来源的PICK1由416氨基酸残基组成,主要由N端的PDZ结构域和C端的BAR结构域组成,另外靠近两个末端各含有一个短的酸性氨基酸区。α-SNAP蛋白在膜泡转运过程中,主要对开启NSF蛋白的ATP酶活性起到分子开关的作用。作为PICK1相互作用蛋白之一,α-SNAP可通过与PICK1蛋白形成复合体来协助PICK1调节突触后膜AMPA受体数量,进而调节神经信号的传导。本文分别对PICK1蛋白、α-SNAP蛋白进行了基因克隆、蛋白的重组表达和纯化,通过体外pull-down和体内酵母双杂交等实验验证了两者的相互作用,并通过基因的定点突变和截短突变对它们之间的结合部位进行了进一步的研究。以实验室保存的重组质粒pRK5-pick1为模板,根据表达载体pGEX-6P-1和pMAL的酶切位点和数据库中已知PICK1基因序列,设计特异性引物经PCR扩增获得PICK1基因,分别克隆上述两个载体并转化*** BL21中进行表达。SDS-PAGE分析两种载体内均为可溶性表达,其目的蛋白占细胞总蛋白的25%以上,经亲和层析和Sephacryl S-200凝胶层析两步纯化获得了电泳纯的PICK1融合蛋白。分别设计PDZ结构域和BAR结构域的引物按上述同样方法分别构建了pMAL-S- bar,pGEX-6P-1-pdz,pET-32N-pdz重组质粒,并通过相应的亲和层析和凝胶层析得到电泳纯的目的蛋白。所有目的蛋白均经Western blot实验进行了验证。根据α-SNAP的基因序列设计引物以pQE9-α-snap为模板将α-SNAP蛋白基因克隆到表达载体pET-32N和pGEX-6P-1中,并在*** BL21中进行表达,SDS-PAGE分析表明可溶性的融合目的蛋白表达量均可达到菌体总表达蛋白的35%左右,进一步经相应的亲和层析和凝胶层析得以较高纯度的分离纯化。进一步根据α-SNAP蛋白的分子结构设计相应引物分别构建各截短突变SNAP、SNAP、SNAP的pET-32N重组质粒,后经Ni-NTA agrose亲和层析和Sephacryl S-200凝胶层析获得电泳纯的SNAP不同片段的突变体。通过pull-down实验比较α-SNAP和PICK1蛋白及其两个结构域相互作用情况,初步证实α-SNAP蛋白与PICK1有较强的相互作用,且推测其作用位点在PDZ结构域,进一步实验证实与PDZ结构域相互作用的SNAP区段位于1-115氨基酸残基片段(SNAP),在此基础上,分别构建了相同片段的酵母双杂交系统的重组质粒,在细胞体内分析了α-SNAP蛋白与PICK1蛋白间的识别位点,与前述结果一致酵母双杂交实验也同样证实了两者的相互作用位点分别为PDZ结构域和α-SNAP蛋白的1-115位肽段区域。

关键词：蛋白激酶Cα相互作用蛋白(PICK1) α-SNAP蛋白基因克隆蛋白表达与纯化 pull-down 酵母双杂交

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水稻深绿穂调控因子DGP1的互作蛋白研究

水稻深绿穂调控因子DGP1的互作蛋白研究

作者：陈晓龙浙江师范大学

学位级别：硕士

在自然界中,光合作用是万物生长的能量来源,它能利用太阳能将无机物转变为有机物,为生物体代谢所使用。各种粮食作物的生产也离不开光合作用,只有充分提高光合能力,提升光合效率才能有效地增加粮食的产量,满足人类日益增长的需求。然而... 详细信息

在自然界中,光合作用是万物生长的能量来源,它能利用太阳能将无机物转变为有机物,为生物体代谢所使用。各种粮食作物的生产也离不开光合作用,只有充分提高光合能力,提升光合效率才能有效地增加粮食的产量,满足人类日益增长的需求。然而植物的光合作用受叶绿体发育和叶绿素合成等相关因素的影响,探索这些过程中相关基因的功能,有助于我们更好地利用光合作用,提高粮食产量。本实验室前期获得了一个水稻深绿穗dgp1(dark green panicle1)的突变体,该突变体的叶、穗都呈现出深绿表型,同时叶绿素含量增加,光合效率增强,并且已经通过图位克隆方法克隆到该基因。由于DGP1基因编码一个未知功能的蛋白,所以首先需要在水稻中筛选出与它互作的蛋白,并通过其互作蛋白的特性来深入研究该基因调控光合效率的机制。以水稻日本晴各个组织混合提取的RNA为材料,构建酵母双杂AD(PGADT7)载体上的cDNA文库。将DGP1基因构建到BD(PGBKT7)载体上,作为诱饵蛋白,它没有自激活现象。通过酵母双杂交的方法筛选DGP1的互作蛋白,发现了两个叶绿体发育相关的转录因子GOLDEN2-LIKE1(GLK1)和GOLDEN2-LIKE 2(GLK2)。克隆完整的GLK1、GLK2到酵母AD载体上,在酵母中一对一验证它们的编码蛋白与DGP1的互作。结果发现,共转AD-GLK1,BD-DGP1和AD-GLK2,BD-DGP1的酵母都在四缺板上可以正常生长出来并且显蓝,说明GLK1、GLK2与DGP1都存在互作关系。然后分别克隆GLK1、GLK2不同的GCT-box结构域,并以同样的方法在酵母中验证与DGP1的互作。结果发现,GLK1、GLK2不同的GCT-box结构域都可以与DGP1互作,并且相比于部分的GCT-box结构,完整的GCT-box结构更易于DGP1与GLK1、GLK2发生互作。利用原核表达分别得到融合蛋白GST:DGP1、His:GLK1和His:GLK2。由于在pull-down实验中GST-DGP1可以下拉出His:GLK1和His:GLK2,所以实验结果进一步证实了 GLK1、GLK2与DGP1的互作关系。以原核表达得到的融合蛋白GST:DGP1和提取的水稻总蛋白为材料,通过pull-down筛选水稻中与DGP1互作的其他蛋白,结果pull-down实验下拉出两个蛋白条带,经过质谱测序分析后发现,它们分别是光合作用相关酶RuBisCO的大小亚基。然后分别构建RuBisCO大亚基和小亚基的酵母双杂载体,并在酵母中与DGP1进行一对一验证,结果只有一个小亚基RBCS5可以与DGP1互作,而其他的亚基均不与DGP1互作。然而本研究中酵母双杂筛选出的GLK1、GLK2没有在水稻总蛋白中被pull-down下拉出来,这可能是由于水稻中GLK1、GLK2的蛋白丰度低且通过酵母双杂技术从水稻中筛选出的是它们C端部分的结构,完整的GLK1和GLK2与DGP1互作较弱。GLK1、GLK2是叶绿体发育相关的转录因子,它们调控叶绿体发育及光合相关基因的表达,而RuBisCO则是光合作用过程中的关键酶,对光合作用能力的增加及其光合效率的提升都至关重要。因此,DGP1可能通过GLK参与叶绿体的发育、叶绿素的合成,进而影响叶色和穗色,而与RuBisCO互作则调节RuBisCO的酶活性,直接影响光合作用。但是这些研究还需要后续大量的实验加以证实。

关键词：水稻 DGP1 蛋白互作酵母双杂交 pull-down

辣椒疫霉效应分子RxLR145，RxLR197互作靶标筛选鉴定及共结晶

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辣椒疫霉效应分子RxLR145，RxLR197互作靶标筛选鉴定及共结晶

作者：张学法山东农业大学

学位级别：硕士

辣椒疫霉菌是一种主要靠土壤传播的致病性卵菌,具有广泛的宿主。辣椒疫霉在侵染寄主时通过分泌大量的Rx LR效应因子干扰植物,促进植物疫病的发生。近年来,辣椒疫病愈发严重,辣椒产业遭受巨大的打击。目前,并没有有效的措施防治该病害,因... 详细信息

辣椒疫霉菌是一种主要靠土壤传播的致病性卵菌,具有广泛的宿主。辣椒疫霉在侵染寄主时通过分泌大量的Rx LR效应因子干扰植物,促进植物疫病的发生。近年来,辣椒疫病愈发严重,辣椒产业遭受巨大的打击。目前,并没有有效的措施防治该病害,因此,从辣椒疫霉的致病机制出发筛选药物靶标显得至关重要。本文在PcRx LR145及PcRx LR197效应蛋白三维结构的基础上,通过CHIP-Seq、RNA-Seq等技术手段探索了这两种效应因子在寄主体内的作用机制,并利用pull-down,微量热涌动(MST)等实验方法验证了疑似互作靶标为阳性,从而确定效应分子的互作靶标并解释了其致病机制,之后将效应蛋白及其互作蛋白表达纯化进行共结晶以期解析出效应蛋白和其互作靶标的复合结构,结果如下:(1)以含有PcRx LR145的转基因拟南芥为材料进行CHIP-Seq实验,结果显示,PcRx LR145可与拟南芥全基因组中5’端含有GAA重复和GAGA重复的DNA序列结合,同时荧光定量PCR证明PcRx LR145可以调控这些基因的表达。(2)微量热泳动(MST)实验验证PcRx LR145可以结合含有GAA和GAGA重复的DNA片段,并测定出其结合力达到了n M级别。(3)培养PcRx LR145和含有GAA和GAGA重复的DNA序列的复合物晶体并进行了复合物的结构解析,但晶体中只含有PcRx LR145蛋白,可能因为DNA柔性过大,不能在晶体中稳定结合。(4)pull-down实验验证PcRx LR197与RPM1互作蛋白(RIN4),热激蛋白90(HSP90)互作并证明了辣椒丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(STPK)与RIN4互作,GDP-甘露糖-3,5-差向异构酶(GME)与HSP90互作,证明其存在上下游关系。(5)培养PcRx LR197与其互作蛋白RIN4的复合物晶体,进行复合物结构的解析,目前已长出晶体。从结构生物学角度研究Rx LR效应因子与寄主的互作机制,为揭示辣椒疫霉菌致病机制提供理论基础。

关键词：辣椒疫霉 RxLR pull-down 微量热泳动互作靶标蛋白纯化

斑马鱼PKR的dsRBM1和dsRBM3重组及体外功能分析

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井冈山大学学报（自然科学版） 2019年第4期40卷 23-28,45页

作者：柳铭山周细根欧湘滢高宗泽李婷婷冯敏何康胡有生井冈山大学医学部基础医学与药学院

为了重组斑马鱼(Daniorerio)双链RNA依赖的蛋白激酶(DrPKR)的双链RNA结合模体1(dsRBM1)和双链RNA结合模体3(dsRBM3)基因,并对重组基因表达的蛋白进行鉴定和功能分析,设计定向删除引物,应用PCR技术扩增DrPKR的ds RBM1和dsRBM3的基因片段... 详细信息

为了重组斑马鱼(Daniorerio)双链RNA依赖的蛋白激酶(DrPKR)的双链RNA结合模体1(dsRBM1)和双链RNA结合模体3(dsRBM3)基因,并对重组基因表达的蛋白进行鉴定和功能分析,设计定向删除引物,应用PCR技术扩增DrPKR的ds RBM1和dsRBM3的基因片段,通过重叠PCR技术将dsRBM1和dsRBM3基因重组在一起得到dsRBM13基因,再将dsRBM13构建到原核表达质粒pET32a上并表达和纯化蛋白;通过表达蛋白的二聚化实验和pull down实验对重组蛋白dsRBM13进行体外功能分析。结果:DrPKR的ds RBM1和dsRBM3重组的蛋白dsRBM13可以进行二聚化和多聚化,且能结合Poly I:C(人工合成的dsRNA)。因此,重组DrPKR蛋白模体dsRBM13仍然具有二聚化和dsRNA结合活性,提示串联了三个dsRBM的Dr PKR激活过程中,串联两个dsRBM对DrPKR激活是必需的,并且在DrPKR结合dsRNA的激活过程中,因dsRNA的长短和空间结构的多样性,含有三个dsRBM的DrPKR可能存在更强和更多的结合方式,因此具有更强的抗病毒免疫反应功能。

关键词： DrPKR dsRBM13 二聚化 Poly I:C pull-down 重组

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LRP16与ART-27的相互作用的鉴定

现代肿瘤医学 2011年第10期19卷 1915-1918页

作者：杨洁韩为东赵亚力伍志强解放军总医院基础医学研究所分子生物室北京100853 解放军总医院老年心血管病研究所北京100853

目的:鉴定LRP16与ART-27的相互作用,推测LRP16基因在肿瘤发生、发展中涉及到的信号途径。方法:酵母双杂交系统筛选出ART-27可与LRP16相互作用,采用酵母双杂交回复验证、免疫共沉淀及GST pull-down等体内、体外方法对二者之间的相互作用... 详细信息

目的:鉴定LRP16与ART-27的相互作用,推测LRP16基因在肿瘤发生、发展中涉及到的信号途径。方法:酵母双杂交系统筛选出ART-27可与LRP16相互作用,采用酵母双杂交回复验证、免疫共沉淀及GST pull-down等体内、体外方法对二者之间的相互作用进行验证。结果:LRP16与ART-27在体内、体外均可形成复合物。结论:ART-27是LRP16的特异性结合蛋白,二者的相互作用为进一步研究LRP16在胚胎发育及肿瘤发生、发展中的功能及信号传导途径奠定了基础。

关键词： LRP16 ART-27 蛋白相互作用免疫共沉淀 GST pull-down

Annexin A2原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化

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解剖科学进展 2022年第6期28卷 759-762页

作者：郭莹莹王世全王述森罗阳刘琦中国医科大学医学基因组学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110122

目的构建Annexin A2原核表达载体并纯化其重组蛋白,用于进一步研究Annexin A2的生物学功能及其互作蛋白分析。方法经基因重组技术构建Annexin A2原核表达载体,经测序鉴定、转化至*** BL21菌株后,诱导表达Annexin A2重组蛋白,并获得纯化... 详细信息

目的构建Annexin A2原核表达载体并纯化其重组蛋白,用于进一步研究Annexin A2的生物学功能及其互作蛋白分析。方法经基因重组技术构建Annexin A2原核表达载体,经测序鉴定、转化至*** BL21菌株后,诱导表达Annexin A2重组蛋白,并获得纯化的重组蛋白。结果载体克隆序列及开放阅读框架正确,经IPTG诱导在62kDa处获得重组蛋白,纯化后得到大量GST-Annexin A2重组蛋白。结论成功构建了pGEX-Annexin A2原核表达载体,表达并纯化出GST-Annexin A2融合蛋白。

关键词： Annexin A2 重组蛋白 pull-down

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人胚胎干细胞膜的特异多肽受体研究

现代生物医学进展 2014年第31期14卷 6001-6005页

作者：谭之扬金磊赵文秀马岚清华大学生命科学学院北京100084 清华大学深圳研究生院生命与健康学部广东深圳518055

目的:通过多肽筛选和比较分析,找到针对人胚胎干细胞(hESC)特异结合的多肽的膜受体蛋白,为相关通路或特异膜表面蛋白下游的研究奠定基础。方法:首先,在前期运用噬菌体展示技术的基础上进行ELISA重筛选,通过对比结合强度的大小,挑选出特... 详细信息

目的:通过多肽筛选和比较分析,找到针对人胚胎干细胞(hESC)特异结合的多肽的膜受体蛋白,为相关通路或特异膜表面蛋白下游的研究奠定基础。方法:首先,在前期运用噬菌体展示技术的基础上进行ELISA重筛选,通过对比结合强度的大小,挑选出特异性结合人胚胎干细胞的噬菌体多肽并且进行测序和合成有poly-his标签的多肽;然后运用His pull-down系统获得特异结合人胚胎干细胞的某一特殊噬菌体12肽的膜上靶分子受体蛋白;最后质谱测序后通过Mascot数据库和NCBI进行序列信息分析。结果:1通过ELISA重筛选,得到了高特异性结合人胚胎干细胞的两个噬菌体序列,其序列分别为HGAAWGTRTGHV(HGA)和VPATETAQAGHA(VPA)。2通过His pull-down实验得到了一个针对多肽VPA的特异性膜蛋白受体。3通过MALD质谱分析以及NCBI的数据库搜索分析,进一步确认这一VPA多肽特异性结合的潜在受体蛋白可能属于HECT超级家族。结论:寻找到一个潜在未知的人胚胎干细胞的特异表面标志物,此膜受体可与VPA多肽特异性结合,为人胚胎干细胞的筛选和鉴定提供了重要指标。

关键词：人胚胎干细胞(hESC) VPATETAQAGHA 多肽 His pull-down

Na_v1.2IQ及其癫痫突变体的表达纯化和活性鉴定

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解剖科学进展 2016年第2期22卷 176-178,182页

作者：郑敏王千慧封瑞李智马中女孙威毛楠高青华郝丽英郭凤中国医科大学药学院药物毒理教研室沈阳110122 沈阳二四二医院神经内分泌科沈阳110034

目的构建电压门控性钠通道亚型Na_v1.2IQ片段及其癫痫突变体的质粒,制备高浓度和高纯度的体外重组蛋白并进行活性鉴定。方法将Na_v1.2 IQ片段及癫痫突变体的cDNA插入pGEX-6p-1质粒载体后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用异丙基硫代-β-... 详细信息

目的构建电压门控性钠通道亚型Na_v1.2IQ片段及其癫痫突变体的质粒,制备高浓度和高纯度的体外重组蛋白并进行活性鉴定。方法将Na_v1.2 IQ片段及癫痫突变体的cDNA插入pGEX-6p-1质粒载体后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导Na_v1.2 IQ片段及癫痫突变体GST融合蛋白表达,GS-4B beads进行分离纯化。应用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量;采用Bradford方法测定GST蛋白浓度;应用pull-down法检测纯化后蛋白的活性。结果 Na_v1.2IQ片段及其癫痫突变体在体外大肠杆菌中具有较高的纯度和表达量,与钙调蛋白在体外能够直接结合,证明制备的蛋白片段具有一定活性。结论成功分离纯化了稳定高效的体外重组Na_v1.2IQ及其癫痫突变体蛋白,为研究Na_v1.2与相关调节因子在癫痫发病的作用提供理论依据。

关键词：钙调蛋白 pull-down 突变体癫痫

DOC-1R缺失型原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化

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解剖科学进展 2018年第5期24卷 518-521,526页

作者：沈飞高锦兰王述森王世全罗阳刘琦中国医科大学医学基因组学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110122

目的构建DOC-1R(deleted in oral cancer-I related)缺失型原核表达载体并纯化其重组蛋白,用于进一步研究DOC-1R互作蛋白及DOC-1R与其相互作用区域。方法经基因重组技术构建分别缺失DOC-1R N端1/3序列及其C端1/3序列的原核表达载体,经... 详细信息

目的构建DOC-1R(deleted in oral cancer-I related)缺失型原核表达载体并纯化其重组蛋白,用于进一步研究DOC-1R互作蛋白及DOC-1R与其相互作用区域。方法经基因重组技术构建分别缺失DOC-1R N端1/3序列及其C端1/3序列的原核表达载体,经测序鉴定、转化至*** BL21菌株后,诱导表达两种缺失型GSTDOC-1R重组蛋白,并获得纯化的重组蛋白。结果两载体克隆序列及开放阅读框架均正确,经IPTG诱导在35kD处获得重组蛋白,纯化后得到大量GST-DOC-1R缺失型重组蛋白。结论成功构建了两种pGEX-DOC-1R缺失型原核表达载体,表达并纯化出GST-DOC-1R delN42、GST-DOC-1R delC42融合蛋白。

关键词： DOC-1R 重组蛋白 pull-down