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安徽株H5N1 NP的原核表达及与宿主蛋白相互作用的初步研究

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安徽株H5N1 NP的原核表达及与宿主蛋白相互作用的初步研究

作者：王乃福中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

人禽流行性感冒(简称人禽流感)是由某些亚型的禽甲型流感病毒株引起的急性呼吸道传染病。自1997年禽流感病毒H5N1感染人类至今,高致病性禽流感在亚洲多个国家和地区爆发流行,给当地的国民经济和人民健康造成极大危害,因此研究禽流感病... 详细信息

人禽流行性感冒(简称人禽流感)是由某些亚型的禽甲型流感病毒株引起的急性呼吸道传染病。自1997年禽流感病毒H5N1感染人类至今,高致病性禽流感在亚洲多个国家和地区爆发流行,给当地的国民经济和人民健康造成极大危害,因此研究禽流感病毒对人的致病机制是我们有效预防和控制人禽流行性感冒要解决的问题之一。研究病毒结构蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用是病毒学基础理论研究的一个重要方面,针对蛋白相互作用的研究不仅有助于搞清病毒复制和装配的详细机制,而且有利于了解疾病的发病机理。因此利用病毒结构蛋白与宿主(主要是人)细胞蛋白的相互作用来尝试揭示H5N1的发病机制是一种非常好的方法和思路。本研究联合应用pull-down和***/MS技术初步筛查与H5N1 NP蛋白存在潜在相互作用的细胞蛋白,并应用免疫共沉淀技术验证SFPQ蛋白与NP的关系。实验内容分为以下三个部分: 第一部分H5N1安徽株核蛋白的表达纯化及BEAS-2B细胞总蛋白的制备我们构建携带NP基因的原核表达质粒pET-30a-NP;在大肠杆菌中大量表达NP蛋白。应用溶菌酶法和反复冻融方法,获得pET30a-NP诱导表达裂解上清和pET30a-NP诱导表达裂解沉淀,经过SDS-PAGE及western-blot鉴定,结果表明在裂解上清中部分NP蛋白以可溶形式存在,且分子量与NP蛋白理论值一致。应用金属螯合亲和层析和离子交换层析结合的方法对表达获得的NP蛋白进行纯化,经过SDS-PAGE扫描软件分析,SDS-PAGE中只有NP蛋白的单一条带;应用纯化获得的NP蛋白免疫新西兰大白兔,制备H5N1 NP的兔多克隆抗体血清,并应用间接ELISA方法证明该多抗血清的效价大于40000,接近国家流感中心H5N1全病毒兔多抗血清效价值。第二部分联合应用pull-down及***/MS技术初步筛查与NP蛋白相互作用的细胞内蛋白大量制备人支气管上皮细胞的总蛋白,制备过程中应用蛋白酶抑制剂防止细胞内蛋白降解,并应用核酸酶祛除核酸成分。应用pull-down技术获得与NP相互作用的细胞内蛋白样品,样品经过SDS-PAGE分析后,获得四条细胞蛋白条带,利用***/MS技术鉴定细胞蛋白身份。质谱鉴定及数据库检索结果表明我们获得与NP存在潜在相互作用的细胞蛋白共20个,其中与NP存在相互作用的已知蛋白一个,剪切因子家族蛋白4个,actin结合蛋白2个,RNA结合蛋白3个。第三部分应用免疫共沉淀方法进一步验证SFPQ蛋白与NP蛋白的关系我们成功的构建携带NP基因的pEGFP-NP真核表达质粒,经过双酶切鉴定和测序鉴定后,选取阳性克隆质粒转染人支气管上皮细胞,应用western-blot方法和荧光显微镜下观察证明NP蛋白在人支气管上皮细胞内的有效表达;应用免疫共沉淀技术进一步验证SFPQ蛋白与NP蛋白在人支气管细胞内的关系。本研究初步筛查到与NP蛋白存在潜在相互作用的细胞内蛋白共20个,并对其中的SFPQ与NP蛋白的相互作用做了进一步验证,研究结果为后期H5N1禽流感病毒致病机理研究提供实验依据。

关键词：禽流感病毒 NP 相互作用 pull-down

陆地棉GhERF7和GhERF8基因克隆与分析

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陆地棉GhERF7和GhERF8基因克隆与分析

作者：程媛媛中国农业科学院

学位级别：硕士

AP2/EREBP基因是真核生物中一类重要的转录调控因子，在调控植物生长发育和生理生化进程中发挥着重要作用。一直以来，人们都认为AP2/EREBP基因是植物中特有的转录因子，但近来研究表明在线虫和一些细菌、病毒中也发现了AP2编码基因，... 详细信息

AP2/EREBP基因是真核生物中一类重要的转录调控因子，在调控植物生长发育和生理生化进程中发挥着重要作用。一直以来，人们都认为AP2/EREBP基因是植物中特有的转录因子，但近来研究表明在线虫和一些细菌、病毒中也发现了AP2编码基因，从而揭示出AP2家族基因进化过程。根据包含结构域的不同，AP2/EREBP超家族可以分为三个家族：AP2家族包含2个重复的AP2结构域;RAV家族包含1个AP2结构域和1和B3结构域;ERF家族包含1个AP2结构域。其中，ERF家族又可以分为两个主要的亚家族：ERF亚族和CBF/DREB亚族。自从在烟草中初次发现4个乙烯响应元件结合蛋白（EREBP）后，又陆续在不同物种中发现了许多ERF基因。ERF基因广泛参与到植物激素信号转导、响应生物/非生物胁迫及各种代谢调控途径中。本研究选取ERF家族基因作为研究对象，以短季棉中棉所10号为材料，利用序列拼接克隆得到棉花中的ERF基因，运用荧光定量PCR技术对这些基因的时空表达特性及不同激素处理下响应情况进行了研究，并进一步运用pull-down技术，初步筛选了ERF下游靶基因。本研究取得的主要成果如下：1、根据本实验室已有的叶片衰老数据库，结合NCBI、DFCI等数据库，拼接得到两条ERF基因，命名为GhERF7和GhERF8,并对它们进行了保守域比对和系统进化分析，结果显示GhERF7和GhERF8都包含一个59个氨基酸的AP2结构域，进化分析显示两个基因都从属于ERF的B-3亚族。2、对两个ERF基因在三叶期幼根、幼茎、幼叶和盛花期成根、成茎、成叶和成花中的表达情况进行了分析;结果显示两个基因在棉株各个组织中都有表达，但在盛花期中整体表达都显著高于三叶期，而在盛花期叶片中表现出最大表达量。3、对田间不同生理时期叶片的叶绿素含量进行了测定，并分析两个ERF基因在叶片衰老进程中的转录变化情况。结果显示，随着叶片不断衰老、叶绿素含量不断下降，两个基因表达量呈整体上升的趋势。因此，我们推测GhERF7和GhERF8可能会与叶片衰老有一定关系。4、使用乙烯利、脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）处理棉花植株，结果显示在乙烯利和茉莉酸处理下GhERF7和GhERF8基因在叶片中上调表达，而在脱落酸处理下表达量无显著变化，推测两个基因可能处于乙烯和茉莉酸信号转导网络中，且表达途径为非ABA依赖途径。5、利用染色体步移技术，克隆得到两个基因约为1900bp的启动子序列，并对这两段序列进行了顺式元件预测。6、利用质粒重组技术表达在N端带有六联组氨酸标签的GhERF7重组蛋白，并进一步运用pull-down技术，对ERF顺式作用元件片段进行初步筛选与鉴定。

关键词：乙烯响应元件结合因子陆地棉激素处理荧光定量PCR pull-down

与家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3相互作用蛋白的筛选

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江苏农业科学 2015年第1期43卷 37-40页

作者：王明慧毛钰霞许雅香苏州大学基础医学与生物科学学院江苏苏州215123 现代丝绸国家工程实验室/苏州大学江苏苏州215123 苏州大学蚕桑研究所江苏苏州215123

丝氨酸蛋白酶抑制剂超基因蛋白质家族,参与调节昆虫体内多种生理反应。本研究在体外原核表达6His-Bmserpin-3,以此作为饵蛋白,采用His-pull down技术及SDS-PAGE分析,从家蚕血液中筛选出了能与Bmserpin-3结合的2个蛋白质,分子量分别为83... 详细信息

丝氨酸蛋白酶抑制剂超基因蛋白质家族,参与调节昆虫体内多种生理反应。本研究在体外原核表达6His-Bmserpin-3,以此作为饵蛋白,采用His-pull down技术及SDS-PAGE分析,从家蚕血液中筛选出了能与Bmserpin-3结合的2个蛋白质,分子量分别为83.04、83.57 ku。对家蚕幼虫sp-2、sp-3在不同组织的表达变化分析可知,sp-2在脂肪体、血淋巴中表达量比较高,sp-3在精巢、脂肪体、血淋巴里表达量比较高。

关键词：家蚕 pull-down 蛋白相互作用

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Daxx与雄激素受体结合的功能片段筛选

中国动脉硬化杂志 2010年第12期18卷 931-934页

作者：庹勤慧徐桂娜郭琰朱炳阳廖端芳南华大学药物药理研究所湖南省衡阳市421001

目的体外筛选出能与雄激素受体具有相互作用的Daxx结构域。方法应用聚合酶链反应扩增Daxx四个不同功能结构域,分别连接到带有GST标记的原核表达质粒pGEX-6p-1中,构建Daxx四个功能结构域的原核表达载体。经测序鉴定转化E ***21DE3菌株,... 详细信息

目的体外筛选出能与雄激素受体具有相互作用的Daxx结构域。方法应用聚合酶链反应扩增Daxx四个不同功能结构域,分别连接到带有GST标记的原核表达质粒pGEX-6p-1中,构建Daxx四个功能结构域的原核表达载体。经测序鉴定转化E ***21DE3菌株,经氨苄青霉素筛选并扩增阳性克隆,用IPTG诱导蛋白表达后纯化蛋白,采用GST pu ll-down体外筛选出与雄激素受体具有相互作用的Daxx功能结构域。结果 Daxx不同功能结构域的四个原核表达载体pGEX-6p-1/Daxx/DM1-240、pGEX-6p-1/Daxx/DM241-501、pGEX-6p-1/Daxx/DM502-625和pGEX-6p-1/Daxx/DM626-740经琼脂糖凝胶电泳和DNA测序分析,证实插入质粒的片段大小正确,无读码框移位和突变。IPTG诱导后蛋白表达具有明显差异性,表达蛋白与预期表达蛋白质分子量大小相当。纯化蛋白进行GST pu ll-down实验结果显示Daxx与雄激素受体具有相互作用。结论 Daxx通过第626-740位氨基酸序列与雄激素受体相互结合。

关键词： Fas死亡结构域相关蛋白雄激素受体 GST pull-down

调控玉米叶夹角发育的基因ZmIBH1互作路径的研究

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调控玉米叶夹角发育的基因ZmIBH1互作路径的研究

作者：柳华峰河南农业大学

学位级别：硕士

玉米(Zea mays L)是我国重要的粮食作物。提高玉米综合产量,是确保我国粮食安全,稳定促进畜牧、化工、能源等产业发展的重要保证。适当增加种植密度,是实现玉米增产的一个重要途径。叶夹角是影响玉米耐密性的重要农艺性状,合理的叶夹角... 详细信息

玉米(Zea mays L)是我国重要的粮食作物。提高玉米综合产量,是确保我国粮食安全,稳定促进畜牧、化工、能源等产业发展的重要保证。适当增加种植密度,是实现玉米增产的一个重要途径。叶夹角是影响玉米耐密性的重要农艺性状,合理的叶夹角,不仅可以增加种植密度,而且可以提高群体光合效率和通风性,改善生长环境。因此,研究玉米叶夹角形成调控的分子机制具有重要的理论和应用价值。本课题前期利用紧凑型玉米自交系Yu82与松散型自交系Yu87-1为材料构建的遗传作图群体,通过初步定位和精细定位,确定了一个位于第2号染色体上的控制叶夹角的候选基因GRMZM2G388823。基因蛋白保守结构域和遗传进化分析表明,GRMZM2G388823与水稻Os IBH1基因同源,故命名为ZmIBH1。前期通过酵母文库筛选和生物信息学分析,确定了GRMZM2G017351(ZmMAPK)、GRMZM2G083459(ZmPP2A)等5个与叶夹角发育相关的基因,并利用酵母双杂交和双分子荧光互补(Bi FC)技术,验证了ZmIBH1—ZmMAPK—ZmEER4是ZmIBH1调控玉米叶夹角发育的互作路径之一。在前期研究的基础上,本研究利用酵母双杂、Bi FC、pull-down等技术验证了ZmIBH1与ZmPP2A之间的互作关系,并对ZmPP2A、ZmEER4进行了互作蛋白的筛选、分析及验证。主要研究结果如下:***2G083459(ZmPP2A)是ZmIBH1筛选到的蛋白之一,生物信息学分析表明,ZmPP2A可编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A的调节亚基B,磷酸酶PP2A在油菜素类固醇信号转导和BZR1去磷酸化中发挥积极作用,油菜素类固醇调控植物叶夹角的大小。因此,ZmPP2A可能参与调控玉米叶夹角的发育。酵母双杂交、Bi FC、pull-down技术进一步证明ZmPP2A与ZmIBH1之间确实存在相互作用。2.利用酵母双杂交技术,以ZmPP2A、ZmEER4为诱饵,从豫82酵母文库中筛选出与ZmPP2A、ZmEER4互作的阳性克隆分别有94个、121个,其中具有正确阅读框的ORF分别有18个、16个。基因信息联合分析发现,ZmPP2A、ZmEER4筛库结果中存在一个相同的基因GRMZM2G386113(ZmMYM)。蛋白结构域分析表明,ZmMYM编码一种含有RING/U-box结构的保守功能域。生物信息学分析表明,ZmMYM可能是一种泛素链聚集因子,能够在泛素系统中引导泛素特异性识别底物蛋白。泛素系统参与细胞周期、细胞增殖、信号传导等生物进程,因此ZmMYM基因可能与叶枕细胞增殖有关,进而影响叶夹角的大小。酵母双杂交回转验证实验进一步证明ZmMYM与ZmPP2A、ZmEER4确实存在互作关系。综合上述研究结果,验证了一条ZmIBH1调控玉米叶夹角发育的蛋白互作路径,即ZmIBH1-ZmPP2A-ZmMYM-ZmEER4。结合前期研究结果,形成了一条以ZmIBH1为中心的蛋白互作调控网络。这一研究结果为揭示叶夹角关键基因ZmIBH1在玉米叶夹角发育形成过程中的分子机理提供依据。

关键词：玉米叶夹角 IBH1 酵母双杂交 BiFC pull-down 互作路径

流感病毒生命周期中关键RNA结合蛋白的筛选和初步研究

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流感病毒生命周期中关键RNA结合蛋白的筛选和初步研究

作者：余树芳宁夏大学

学位级别：硕士

流感病毒是一种具有高度传染性的人畜共患病病原,在世界范围内具有较高的发病率和死亡率,对全球的公共卫生安全造成了较为严重的威胁。目前控制世界各地季节性流感疫情爆发的唯一方法是疫苗,但由于病毒株的高变异率使疫苗的覆盖面及效... 详细信息

流感病毒是一种具有高度传染性的人畜共患病病原,在世界范围内具有较高的发病率和死亡率,对全球的公共卫生安全造成了较为严重的威胁。目前控制世界各地季节性流感疫情爆发的唯一方法是疫苗,但由于病毒株的高变异率使疫苗的覆盖面及效力大大减弱,导致流感病毒感染成为一个持续的公共卫生问题。流感病毒是一种具有包膜的、基因组分节段的负链RNA病毒,其每个基因组片段和编码的蛋白质在复制过程中都有重要的作用。当流感病毒通过受体介导的胞吞作用入侵和感染宿主细胞时,通常会诱导宿主细胞发生一系列复杂的细胞应答。流感病毒的复制需要利用宿主转录以及翻译系统的共同作用,因此宿主细胞中的蛋白在流感病毒的生命周期以及致病性中具有极其重要的作用。因此,本研究对流感病毒生命周期中与病毒RNA相互作用的关键宿主蛋白进行了相关的筛选及验证,通过siRNA沉默技术、q-PCR、Western blot以及细胞半数感染量试验,验证筛选出的关键RNA结合蛋白（RBP）对流感病毒感染及复制的影响。本研究包含三部分内容:1、用甲型流感病毒感染体外培养的人源肺癌细胞系（A549）和人单核巨噬细胞系（THP-1）,通过体外vRNA-pull down结合质谱的试验方法筛选流感病毒生命周期中关键的RNA结合蛋白（RBP）。试验结果显示:在流感病毒的生命周期中共有69个可以与流感病毒3个及3个以上病毒RNA（vRNA）片段相互作用的RBP。2、通过siRNA沉默技术、q-PCR、Western blot以及细胞半数感染量试验对筛选出的关键RNA结合蛋白（RBP）进行进一步功能探究。结果显示:筛选到的69个RBP中的DHX9、IFI27、RBBP6以及SRSF5这四个基因对流感病毒有比较明显的影响。3、利用细胞半数感染量试验和Western blot进一步验证SRSF5对流感病毒复制及感染的影响。验证结果显示:敲除SRSF5基因能够显著抑制流感病毒的感染和复制。综上所述,本研究利用相关试验对流感病毒生命周期中与vRNA相互作用的宿主蛋白进行筛选及验证,为之后进一步探究在流感病毒感染后这些RBP对宿主或病毒基因表达的影响以及其结合病毒RNA调控流感病毒感染周期的具体作用机制提供了研究基础。

关键词：流感病毒 RNA结合蛋白 pull-down 病毒RNA 病毒与宿主相互作用

重组人死亡受体6在毕赤酵母中的表达、纯化及与淀粉样前体蛋白相互作用的研究

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重组人死亡受体6在毕赤酵母中的表达、纯化及与淀粉样前体蛋白相...

作者：李伟西南大学

学位级别：硕士

阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）是一种中枢神经系统变性病,起病隐袭,病程呈慢性进行性,是老年痴呆中最常见的一种类型。20世纪中叶以来,随老龄化的加快及AD发病率的增高,AD防治已成为全球关注热点。近年有科学研究发现：淀粉样... 详细信息

阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）是一种中枢神经系统变性病,起病隐袭,病程呈慢性进行性,是老年痴呆中最常见的一种类型。20世纪中叶以来,随老龄化的加快及AD发病率的增高,AD防治已成为全球关注热点。近年有科学研究发现：淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）和死亡受体6（Death receptor-6, DR6）在神经细胞自我毁灭的途径中发挥了作用,并且认为APP可能是DR6的配体,当营养因子缺乏时就会通过特定的凋亡受体传递某些胞外信号从而导致神经退化。DR6表达于人体大多数组织和器官,一些证据表明,DR6的表达在活化和分化过程中被调节。APP的N端片段（NAPP）与DR6之间的作用类似于抗原与抗体之间的相互作用,多种因素调节其对轴突的作用。首先受到的是神经营养因子的调节,因为神经生长因子是神经元存活和生长的重要因素,营养因子的缺乏就将导致神经元的萎缩变性,而基底前脑胆碱能神经元（BF-CN）对于神经营养因子的缺乏则更为敏感,这也是AD发生的主要原因之一。在神经营养因子被剥夺的条件下,触发胞外APP的N端片段被β-分泌酶切割后,脱落并产生了NAPP,并且与神经元和轴突表面的DR6结合,激活了依赖于caspase3和caspase6的信号通路导致神经元胞体和神经元轴突的凋亡。由于NAPP-DR6相互作用机制可以很好的解释AD病症的发展过程中神经元轴突的变性崩解,并且在体内和离体条件下神经营养因子剥夺时均有轴突变性崩解和DR6的表达上调现象,这综合表明了DR6-NAPP相互作用机制可能是导致神经元凋亡和轴突变性的调控机制。因此,探究DR6的功能以及研究NAPP-DR6的相互作用机制提供了一个新的突破口,对探索AD的发病原因、致病病理和对AD治疗药物靶标的定位以及开发新的治疗AD的药物提供了一个新的方向。本研究课题以含有DR6全长cDNA的质粒为扩增模板,PCR扩增DR6（aa42-218/aa42-349）的DNA片段,并与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,经筛选鉴定后构建成功了重组载体pPIC9K-DR6（aa42-218/aa42-349）,重组载体经测序验证后电击导入毕赤酵母表达菌株GS115,得到分别表达DR6不同氨基酸片段的两个酵母重组子菌株。经过表达条件的优化实现了重组蛋白的高效分泌表达,经SDS-PAGE电泳分析,在表达上清中有相对分子量大小约为26kD和43kD的外源蛋白产生,经过Western blot检测证明其为目的蛋白。为了验证DR6和NAPP的相互作用关系,成功构建了pGST-DR6（aa42-349）,还纯化得到DR6的配体NAPP, GST pull-down结果显示两者存在体外相互结合. 本实验成功构建了人DR6（aa42-218/aa42-349）的毕赤酵母真核表达载体并实现了高效分泌表达,初步证明了重组DR6和NAPP的体外相互作用,为下一步研究DR6的生物学功能及APP与DR6的相互作用域及相互作用关键残基奠定了基础。

关键词：死亡受体-6 毕赤酵母分泌表达 pull-down 相互作用

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hALR相互作用蛋白的筛选与鉴定

hALR相互作用蛋白的筛选与鉴定

作者：李丹丹第二军医大学

学位级别：硕士

肝脏再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是肝脏再生过程中的一个重要调控因子。人ALR(hALR)是分子量为15 Ku的蛋白质分子,由125个氨基酸残基组成,在非变性条件下以同源二聚体的方式存在,具有较强的耐热性,70℃、30min... 详细信息

肝脏再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是肝脏再生过程中的一个重要调控因子。人ALR(hALR)是分子量为15 Ku的蛋白质分子,由125个氨基酸残基组成,在非变性条件下以同源二聚体的方式存在,具有较强的耐热性,70℃、30min不变性、不失活。肝再生研究发现ALR能增强肝细胞扩增,阻止粗面内质网、线粒体和其它细胞器的损坏,抑制淋巴细胞扩增,对肝脏再生及肝脏功能的修复有着重要作用。动物实验表明ALR对急性肝功能损伤有明显疗效。然而ALR的作用机理尚未完全明确,寻找与ALR相互作用的蛋白质将有助于进一步阐明其作用机制。本课题以hALR的编码序列为诱饵,采用细菌双杂交系统对人肝cDNA文库中可能与ALR相互作用的蛋白质进行了筛选,结果共得到32个阳性克隆,经过序列测定证明分别为编码人氨基乙酸-N-乙酰转移酶、集落刺激因子、凝血素(hemopexin)、补体C3、α-酸性糖蛋白2、纤维蛋白溶酶原、色素上皮细胞来源因子SERPIN F1、白蛋白、线粒体QD8159、线粒体单倍体As8D、染色体11qCMB9-78H16克隆、cDNA克隆IMAGE:3535684等的基因。经过文献调研和归类分析,选取可能与hALR功能最相关的氨基乙酸-N-乙酰转移酶(glycine-N-acyltransferase,GAT)进行了进一步的克隆、表达和相互作用研究。 GAT是成年动物肝细胞核基因编码的一种线粒体蛋白,为单体分子,有两种不同的亚型。其中a亚型由296个氨基酸残基组成,为线性分子,分子量约为30Ku,pI为6.8:b亚型由163个氨基酸残基组成,是分子量约18.5Ku的线性分子。b亚型的3’编码区以及3’UTR区与a亚型有所区别,因此b亚型的转录本较小,其C-端的氨基酸序列与a亚型不一样。稳定性研究显示,GAT在100mmol/LNaCl、KCl和K3PO4溶液条件下,其酶活性分别为47%、21%和32%。GAT在4℃ 72h、25℃ 4h以及37℃ 1h其酶活性均无改变。GAT具有多种脂酰辅酶A的活性,在线粒体中催化氨基乙酸与乙酰辅酶A底物发生反应,在内

关键词：肝脏再生增强因子相互作用蛋白氨基乙酸-N-乙酰转移酶细菌双杂交系统 PCR pull-down

微小隐孢子虫Hsp90互作蛋白的筛选及功能初步研究

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微小隐孢子虫Hsp90互作蛋白的筛选及功能初步研究

作者：冯琪吉林大学

学位级别：硕士

微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是一种重要的人兽共患寄生性原虫,寄生于人和多种哺乳动物的小肠,造成免疫低下或免疫功能不全的人严重腹泻,甚至危及生命。现在用于治疗微小隐孢子虫病的药物较少,当前被食品药物管理局批准的药物... 详细信息

微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是一种重要的人兽共患寄生性原虫,寄生于人和多种哺乳动物的小肠,造成免疫低下或免疫功能不全的人严重腹泻,甚至危及生命。现在用于治疗微小隐孢子虫病的药物较少,当前被食品药物管理局批准的药物,只有硝唑尼特被广泛的使用在儿童和有免疫活性的病人,但对免疫缺陷的病人是无效的。目前,尚无可用的疫苗来预防该病,这是因为人们对微小隐孢子虫分子生物学和致病机理的研究不足。微小隐孢子虫子孢子对宿主细胞的入侵是致病的关键因素,毒力因子在微小隐孢子虫的黏附、定植、入侵及逃避宿主免疫中发挥着重要作用,当虫体侵入细胞时会分泌蛋白,这些蛋白质发生相互作用导致虫体的入侵,因此鉴定隐孢子虫入侵宿主细胞时发生相互作用的蛋白可为控制隐孢子虫病提供潜在疫苗或药物靶点。目前在微小隐孢子虫中报道的毒力因子有热休克蛋白、黏附因子、细胞损伤因子,其中Hsp90在蛋白合成、细胞凋亡以及生物生长调节中起重要作用。在弓形虫中发现Hsp90与虫株毒力密切相关,而微小隐孢子虫Hsp90已在胞外囊泡中检测到,但尚未有Hsp90互作蛋白的相关研究。故本研究利用pull-down联合质谱技术筛选微小隐孢子虫Hsp90的互作蛋白,通过双分子荧光互补技术(Bi FC),免疫共沉淀(Co-IP)方法验证二者的互作关系,利用Duolink?PLA方法确定Hsp90与虫体互作蛋白在微小隐孢子虫内的定位情况,并探究Hsp90与宿主细胞的互作蛋白对于微小隐孢子虫增殖的影响。微小隐孢子虫Hsp90互作蛋白的筛选:首先构建诱饵质粒p ET-32a-Hsp90,并通过大肠杆菌系统表达Hsp90蛋白,将其与微小隐孢子虫蛋白、Caco-2细胞总蛋白在Anti-His Magarose Beads中进行孵育结合,通过SDS-PAGE分析,再进行LC-MS/MS质谱检测,初步筛选出与Hsp90蛋白可能存在互作关系的28种虫体蛋白,如SAC domain-containing protein、WD40 repeat myosin-like protein、RRM domain-containing protein等,通过GO和KEGG分析发现RRM domaincontaining protein功能是参与调控RNA稳定性、RNA剪接或RNA编辑等过程,与Hsp90参与蛋白合成的功能存在一定的相关性,因此选择RRM domaincontaining protein进行后续的互作验证。通过pull-down联合质谱技术初步筛选到71种与Hsp90可能存在互作关系的Caco-2细胞蛋白,如Heat shock cognate71 k Da protein、Annexin、Cystatin-A、Elongation factor 1-alpha 1等,通过GO和KEGG分析发现Elongation factor 1-alpha 1(eEF1a1)的功能是负责氨基酰t RNA的酶传递到核糖体,与Hsp90参与蛋白合成的功能存在一定的相关性,因此选择eEF1a1进行后续的互作验证。微小隐孢子虫Hsp90与虫体RRM domain-containing protein蛋白互作验证:首先构建pc DNA3.1-HA-Hsp90和pc DNA3.1-GST-RRM真核表达质粒并共转染至293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)试验确定其互作关系。然后将两种无内毒素双分子荧光互补重组质粒p BIFC-b Fos-Hsp90和p BIFC-b Jun-RRM,共转染293T细胞后观察绿色荧光确定其在细胞内的互作关系。最后制备鼠源Hsp90、兔源RRM多克隆抗体,激光共聚焦检测Hsp90与RRM在虫体内的定位,Duolink?邻位连接检测试验观察Hsp90蛋白与RRM蛋白在虫体内的共定位。Co-IP试验结果表明Hsp90与RRM存在互作关系,BIFC试验显示在共转染组的细胞中观察到绿光荧光,表明Hsp90与RRM在293T细胞胞质内存在互作关系。免疫荧光试验发现Hsp90与RRM在虫体内均主要定位于为微小隐孢子虫子孢子的胞质内,Duolink?邻位连接试验结果表明Hsp90与RRM共定位于微小隐孢子虫子孢子的胞质内。微小隐孢子虫Hsp90与宿主细胞Elongation factor 1-alpha 1(eEF1a1)蛋白互作的验证以及eEF1a1功能的初步研究:首先将真核表达质粒pc DNA3.1-GSTeEF1a1和pc DNA3.1-HA-Hsp90共转染至293T细胞,通过Co-IP试验确定其互作关系。然后构建双分子荧光互补重组质粒p BIFC-b Jun-eEF1a1,将其与p BIFC-b Fos-Hsp90共转染293T细胞后观察绿色荧光确定其在细胞内的互作关

关键词：微小隐孢子虫 eEF1a1 Hsp90 pull-down RRM