检索结果-南通市图书馆

中国生物化学与分子生物学报 2009年第8期25卷 735-739页

作者：王山肖晟赫杰韩放李钰哈尔滨工业大学生命科学与工程系哈尔滨150001 美国哈佛大学医学院病理系波士顿02115

核蛋白MARVELD1(MARVEL domain containing1)是一个在多种肿瘤中表达下调的肿瘤相关基因.为寻找其相互作用分子,构建pGEX-4T-2/MARVELD1重组体并在大肠杆菌中成功表达GST-MARVELD1融合蛋白.采用GSTpull-down结合LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱)的方法对MARVELD1蛋白的相互作用分子进行筛选,发现了16个与MARVELD1相互结合的蛋白.进一步的免疫共沉淀实验证实,MARVELD1与核质转运受体蛋白importin β1能够相互作用,说明MARVELD1可能参与了importin β1的部分生物学作用,或是它通过与importin β1结合而进入细胞核.研究结果为进一步分析MARVELD1和importin β1的生物学功能奠定了基础.

关键词： MARVELD1 核质转运受体蛋白 GST pull-down 免疫共沉淀

甲基化CpG结合结构域蛋白的原核表达及应用

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四川大学学报（自然科学版） 2014年第2期51卷 408-412页

作者：刘涛兰洋吴传芳四川大学生命科学学院成都610064

本文构建了甲基化CpG结合结构域(MBD)蛋白的原核表达质粒,并表达了GSTMBD融合蛋白,采用GST柱对该融合蛋白进行纯化.体外pull-down实验发现,GST-MBD融合蛋白能够与小鼠胚胎成纤维细胞MEF中oct4基因的启动子DNA结合,验证了该蛋白的体外生... 详细信息

本文构建了甲基化CpG结合结构域(MBD)蛋白的原核表达质粒,并表达了GSTMBD融合蛋白,采用GST柱对该融合蛋白进行纯化.体外pull-down实验发现,GST-MBD融合蛋白能够与小鼠胚胎成纤维细胞MEF中oct4基因的启动子DNA结合,验证了该蛋白的体外生物活性.利用相同的实验方法,发现GST-MBD融合蛋白能够与MEF细胞中inhbb基因的启动子区结合,而不能与小鼠胚胎干细胞R1中的inhbb基因的启动子区DNA结合,同时采用半定量PCR方法检测到inhbb基因在R1细胞中高表达,而在MEF细胞中不表达,表明inhbb基因受到DNA甲基化的调控.

关键词：表观遗传学甲基化CpG结合蛋白 pull-down

长双歧杆菌BL0033与BL0034的相互作用研究

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军事医学科学院院刊 2010年第6期34卷 551-555页

作者：郭燕红刘大伟孙忠科邵长林何湘王雪松姜铮赵江丽刘威魏晓廖祥儒袁静江南大学生物工程学院江苏无锡214036 军事医学科学院疾病预防控制所北京100071

目的克隆表达*** NCC2705果糖ABC转运系统中BL0033、BL0034及其截短突变体,验证两蛋白的体外相互作用,并确定介导彼此相互作用的功能区域。方法将bl0033与bl0034基因克隆至载体pGEX-4T-1和pET32a并在***中表达,采用谷胱甘肽-Sepharose 4... 详细信息

目的克隆表达*** NCC2705果糖ABC转运系统中BL0033、BL0034及其截短突变体,验证两蛋白的体外相互作用,并确定介导彼此相互作用的功能区域。方法将bl0033与bl0034基因克隆至载体pGEX-4T-1和pET32a并在***中表达,采用谷胱甘肽-Sepharose 4B和镍柱分别对GST和His融合的蛋白进行纯化,GST pull-down验证BL0033与BL0034蛋白之间的相互作用。为了进一步确定BL0033和BL0034的作用位点,根据BL0033和BL0034基序特征构建截短突变体,GST pull-down实验检测截短体与完整蛋白结合的能力,确定介导相互作用的区域。结果在大肠杆菌中实现了融合蛋白的可溶性表达,经亲和层析获得了融合蛋白。GST pull-down实验证实BL0033与BL0034存在相互作用,其中BL0033的截短体1～23 aa能与BL0034结合,而截短体36～314 aa丧失了与BL0034的结合能力;BL0034的3个截短体中BL0034/8～244 aa、BL0034/33～220 aa能与BL0033相互作用,而BL0034/289～481 aa与BL0033没有作用。结论证实了BL0033与BL0034之间的相互作用,并确定BL0033的1～23 aa基序与BL0034的33～220 aa基序是这种相互作用的结构域,为进一步研究*** NCC2705果糖ABC转运系统的分子机制奠定了理论基础。

关键词： GST pull-down BL0033 BL0034 截短突变体蛋白间相互作用

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白与MDBK细胞互作蛋白的筛选

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中国兽医科学 2021年第8期51卷 1035-1042页

作者：白彤彤赵静虎贺琳茹周玉龙张泽财朱战波刘宇黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 黑龙江省牛病防控工程技术研究中心黑龙江大庆163319

为了筛选与鉴定牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2蛋白与MDBK细胞的互作蛋白,以牛病毒性腹泻病毒BA株为模板,通过PCR扩增E2基因,构建重组质粒pFast-E2。将其转化至DH10Bac感受态细胞,再转染sf9昆虫细胞,获得P3代重组杆状病毒,在sf9细胞中表达E2... 详细信息

为了筛选与鉴定牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2蛋白与MDBK细胞的互作蛋白,以牛病毒性腹泻病毒BA株为模板,通过PCR扩增E2基因,构建重组质粒pFast-E2。将其转化至DH10Bac感受态细胞,再转染sf9昆虫细胞,获得P3代重组杆状病毒,在sf9细胞中表达E2蛋白,应用Western-blot进行鉴定,通过pull-down结合质谱技术筛选与鉴定BVDV E2蛋白与MDBK细胞互作的候选蛋白。结果表明,PCR克隆获得的E2基因片段大小约为1047 bp;在sf9昆虫细胞中能成功表达出分子质量约为43.6 ku的E2蛋白;筛选出8种候选互作蛋白,主要包括α-辅肌动蛋白(α-actinin)、延伸因子1-α(elongation factor 1-α)、波形蛋白(vimentin)和α葡萄糖苷酶Ⅱ(GANAB);通过GO分析可知,3种蛋白(P68103、E1B9F6、E1B7J1)具有GTP酶活性和结合GTP的功能,3种蛋白(A4ZZF8、Q3B7N2、P48616)具有结合双链RNA的功能,2种蛋白(Q3B7N2、A5D7D1)具有结合肌动蛋白丝的功能,2种蛋白(A4ZZF8、Q3B7N2)具有结合离子通道的功能和配体依赖性核受体转录共激活因子活性,2种蛋白(A5D7D1、A6QNJ8)具有结合m RNA的多聚腺苷酸尾部功能,1种蛋白(P48616)是细胞骨架的结构成分,且具有蛋白绑定功能。本研究为探索BVDV感染的分子机制以及治疗靶点筛选等研究提供了参考。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白互作蛋白 pull-down 质谱

重组可溶表达结核分枝杆菌新基因编码蛋白Rv2742的相互作用蛋白质组研究

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军事医学 2019年第10期43卷 747-754页

作者：王红万李武舒佳常蕾万康林张瑶徐平戴二黑华北理工大学公共卫生学院河北唐山063210 华北理工大学附属石家庄市第五医院石家庄050021 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所蛋白质组学国家重点实验室北京蛋白质组研究中心国家蛋白质科学中心(北京)中国医学科学院蛋白组学与新药研发新技术创新单元北京102206 武汉大学基础医学院武汉430071 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室传染病诊治协同创新中心北京102206

目的 Rv2742是基于蛋白质基因组学技术从结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv,结核菌)中发现并验证的遗漏注释基因。该研究旨在筛选Rv2742在结核菌中的相互作用蛋白质,对Rv2742互作网络进行分析,为深入探索其在结核菌中所参... 详细信息

目的 Rv2742是基于蛋白质基因组学技术从结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv,结核菌)中发现并验证的遗漏注释基因。该研究旨在筛选Rv2742在结核菌中的相互作用蛋白质,对Rv2742互作网络进行分析,为深入探索其在结核菌中所参与的生物学功能提供理论基础。方法采用免疫亲和纯化质谱(IP-MS)筛选Rv2742在结核菌中的互作蛋白质。以pMAL-c2X和pMAL-c2X-Rv2742载体诱导表达、纯化获得的麦芽糖结合蛋白(MBP)和MBP-Rv2742融合蛋白为诱饵,分别取等摩尔蛋白与H37Rv非变性全细胞蛋白质裂解物进行孵育,收集2次生物学重复实验得到的与MBP和MBP-Rv2742诱饵结合的蛋白质复合物,10%SDS-PAGE凝胶电泳验证,通过液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)分析、筛选出Rv2742在结核菌中的互作蛋白质,对筛选到的蛋白质进行基因本体(gene ontology,GO)和互作网络分析。结果共筛选到105个Rv2742的潜在互作蛋白质,其定位主要分布在细胞壁、细胞质膜和细胞外区域等细胞组分中,功能上主要参与低氧应激、宿主共生、运输、毒力因子分泌等生物学过程。结论结核菌中有105个蛋白质与Rv2742互作,生物学功能及互作网络分析发现Rv2742可能参与结核菌侵入人体后的致病过程。

关键词：结核分枝杆菌新编码基因 Rv2742 蛋白质组质粒相互作用蛋白质 MBP pull-down

柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1潜在子孢子互作蛋白的筛选

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中国动物传染病学报 2017年第3期25卷 61-67页

作者：崔晓霞黄兵赵其平韩红玉朱顺海徐帅兵谢雨翔唐敏杨志远董辉中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200241 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009 上海师范大学生命与环境科学学院上海200234

为了筛选与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(Eimeria tenella apical membrance antigen 1,EtAMA1)存在互作的子孢子蛋白,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增EtAMA1基因胞外区,将扩增产物与p GEX-6P-1连接,构建原核表达质粒p GEX-6P-1... 详细信息

为了筛选与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(Eimeria tenella apical membrance antigen 1,EtAMA1)存在互作的子孢子蛋白,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增EtAMA1基因胞外区,将扩增产物与p GEX-6P-1连接,构建原核表达质粒p GEX-6P-1-EtAMA1,表达、纯化重组蛋白EtAMA1-GST。纯化的重组蛋白经Western blot验证,结果显示在75 k Da处有单一的目的条带,证实了所获得的蛋白为EtAMA1-GST融合蛋白。将EtAMA1-GST蛋白、GST蛋白和PBS分别与谷胱甘肽琼脂糖珠孵育后,再分别与子孢子裂解物共孵育,洗脱液经SDS-PAGE分析后,结果显示三者之间的条带明显不同。将差异条带切下进行质谱分析,对获得的蛋白质肽段与Uniprot中鸡球虫蛋白质数据库进行Blast比对,初步获得了10个与EtAMA1存在潜在互作的柔嫩艾美耳球虫子孢子蛋白,包括微线体蛋白、糖酵解酶类、肌动蛋白相关因子以及一些保守蛋白等,他们广泛参与了虫体的入侵、发育、能量代谢等生物学过程。研究结果为进一步阐明EtAMA1在球虫入侵宿主细胞中发挥重要作用的分子机制奠定了基础。

关键词：柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1 GST pull-down 相互作用蛋白

鸡B-FA分子中结合Ii链功能片段特性的研究

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中国免疫学杂志 2016年第10期32卷 1413-1418页

作者：喻丹丹吴琼罗兰芳余为一陈芳芳安徽农业大学安徽省人兽共患病重点实验室合肥230036

目的:研究鸡Ii链结合的B-FA分子的功能片段及其特征。方法:将克隆的B-FA基因片段(α1α2、sα1α2和α3TC)分别插入原核或真核表达质粒,然后分别转染或与Ii共转染工程菌***(BL-21)或293T细胞,经过诱导表达、亲和层析纯化和SDS-PAGE鉴定... 详细信息

目的:研究鸡Ii链结合的B-FA分子的功能片段及其特征。方法:将克隆的B-FA基因片段(α1α2、sα1α2和α3TC)分别插入原核或真核表达质粒,然后分别转染或与Ii共转染工程菌***(BL-21)或293T细胞,经过诱导表达、亲和层析纯化和SDS-PAGE鉴定后,分别用pull-down法观察B-FA片段与Ii结合与在细胞内的共定位特征。结果:首先,构建了3个重组原核表达质粒和4个重组真核表达质粒。原核表达的B-FA片段经亲和层析纯化可获得单一蛋白分子。其次,用pulldown从共转染工程菌表达的蛋白分子中分别检测到Ii/B-FA-α1α2和Ii/B-FA-sα1α2,而未能检测到Ii与α3TC的结合物,而免疫印迹结果也表明该两片段是结合Ii链形成复合物的功能片段。最后,在真核表达的293T中,B-FA-α1α2具有同B-FA相同的细胞定位特性。结论:鸡B-FA-α1α2片段是结合Ii的功能片段,并保持了B-FA的细胞定位的作用。本研究结果首次提供了B-FA分子与Ii的互相作用的实验依据。

关键词：恒定链 B-FA片段 pull-down 表达复合物

钙调蛋白的N末端和C末端片段载体构建和蛋白制备

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中国医科大学学报 2016年第10期45卷 877-882页

作者：邵冬雪孙嘉瑶杜逸李墨唐子鉴于佳慧胡慧媛孙雪菲孙胜男郝丽英中国医科大学药学院药物毒理教研室沈阳110122

目的构建钙调蛋白(Ca M)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,Clobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定。方法将上述c DNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态... 详细信息

目的构建钙调蛋白(Ca M)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,Clobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定。方法将上述c DNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B beads进行分离纯化。采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量,Bradford方法测定纯化后蛋白浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性。结果蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度目的蛋白,纯化后蛋白能与Cav1.2型钙通道结合并可恢复已"rundown"心肌细胞膜钙通道的活性。结论本研究成功构建可以表达生物活性蛋白的N-lobe、C-lobe、N-lobe12及C-lobe34原核表达载体,为深入研究Ca M的生物学功能奠定了基础。

关键词：钙调蛋白 N末端片段 C末端片段突变体 pull-down 膜片钳

拟南芥RPS14基因的克隆表达及功能初步研究

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生物技术通报 2013年第1期29卷 73-77页

作者：范艳荣刘莹张飞云首都师范大学生命科学学院北京100048

拟南芥RPS14(Ribosomal protein S14)是从拟南芥中分离出的一种核糖体蛋白,是核糖体40S亚基的组成成分,属于S11P核糖体蛋白家族,主要负责RNA转录后加工。提取拟南芥总RNA,用RT-PCR技术得到RPS14全长基因,经T-A克隆插入到pEASY-T3载体上... 详细信息

拟南芥RPS14(Ribosomal protein S14)是从拟南芥中分离出的一种核糖体蛋白,是核糖体40S亚基的组成成分,属于S11P核糖体蛋白家族,主要负责RNA转录后加工。提取拟南芥总RNA,用RT-PCR技术得到RPS14全长基因,经T-A克隆插入到pEASY-T3载体上。利用亚克隆法成功构建pGEX-6P-1-RPS14原核表达质粒。GST-RPS14融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,分子量约为43 kD。运用同样方法构建pET-28a-AK6原核表达质粒,获得大小约为26 kD的HIS-AK6融合蛋白。运用体外pull-down技术,并用SDS-PAGE和Western blot进行验证,证明拟南芥RPS14蛋白与AK6蛋白之间存在相互作用。因此,推测拟南芥的AK6与RPS14蛋白共同参与核酸代谢过程,影响RNA转录后加工,进而抑制拟南芥茎细胞的生长,使植株表现矮小特征。

关键词：拟南芥 RPS14 AK6 pull-down