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中国野生毛葡萄VqTLP15基因的克隆与抗病性功能研究

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西北植物学报 2020年第5期40卷 727-738页

作者：王雅闫筱筱张修铭李智王西平西北农林科技大学园艺学院陕西杨陵712100 旱区作物逆境生物学国家重点实验室陕西杨陵712100 农业部西北地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室陕西杨陵712100

该研究以抗病品种中国野生毛葡萄‘商-24’和感病品种欧洲葡萄‘红地球’为材料,利用RT-PCR方法克隆TLP15基因,分别命名为VqTLP15和VvTLP15(GSVIVT01018769001),对其进行生物信息学分析、亚细胞定位、转化拟南芥,并接种不同病原菌观察... 详细信息

该研究以抗病品种中国野生毛葡萄‘商-24’和感病品种欧洲葡萄‘红地球’为材料,利用RT-PCR方法克隆TLP15基因,分别命名为VqTLP15和VvTLP15(GSVIVT01018769001),对其进行生物信息学分析、亚细胞定位、转化拟南芥,并接种不同病原菌观察分析转基因株系的抗性,采用qRT-PCR检测SA和JA/Eth信号途径以及调控气孔运动的相关基因表达。结果显示:(1)成功克隆获得VqTLP15基因的开放阅读框(ORF);氨基酸序列比对显示,VqTLP15基因与葡萄基因组网站欧洲葡萄‘黑比诺’VvTLP15和‘红地球’克隆的VvTLP15基因的同源性分别为98.99%和99.66%。(2)亚细胞定位表明,VqTLP15定位于细胞质。(3)成功获得VqTLP15转基因拟南芥株系(L1、L2、L3)。(4)接种观察发现:白粉菌处理7 d后转基因株系对白粉菌的抗性较野生型(Col-0)提高,且其叶片的白粉菌孢子浓度显著低于Col-0;灰霉菌诱导的叶片坏死性损伤在转基因株系(L1、L2和L3病斑面积>40%的比例分别为71%、62%和67%)中显著大于Col-0(43%);接种pstdc3000后转基因株系叶片的病害表型没有Col-0明显,叶片孔径减小程度大于Col-0,且细菌浓度低于Col-0。(5)组织化学染色分析表明:白粉菌处理后转基因株系叶片胼胝质沉积、细胞死亡率和O2^-·水平都显著大于Col-0;灰霉菌处理后转基因株系的细胞死亡率、H2O2和O2^-·水平均高于Col-0;pstdc3000处理后细胞死亡率和O2^-·积累水平都高于Col-0。(6)qRT-PCR检测显示:接种白粉菌后,转基因株系中PR1和ICS1的表达水平均升高,PR1表达在接种72 h时达到峰值,而ICS1在接种120 h时达到峰值,LOX3的表达水平逐渐降低,并于接种120 h时降至最低水平,但仍高于Col-0;接种灰霉菌后,转基因株系中PR1、NPR1和PDF1.2基因的表达均上调,并在接种48 h时达到峰值,LOX3基因的表达水平下降,但仍高于Col-0;接种pstdc3000后,转基因株系中PR1、PDF1.2和NHL10的表达均高于Col-0,但WRKY53的表达低于Col-0,L1中COI1、FRK1、ATPPC2、FLS2、OST1的表达水平高于Col-0;接种flg22或LPS后,L1中COI1基因的表达低于Col-0,但ATPPC2、FLS2、OST1基因的表达水平高于Col-0。研究表明,过量表达VqTLP15基因降低了对白粉菌和pstdc3000的敏感性,增加了对灰霉菌的敏感性。VqTLP15基因可能通过介导水杨酸(SA)和茉莉酸/乙烯(JA/Eth)信号转导途径以及气孔免疫反应来参与植物的抗病防御反应,为葡萄抗病分子育种提供了一个可能的候选基因。

关键词： VqTLP15 白粉病灰霉病菌 pstdc3000 气孔中国野生毛葡萄

海藻酸钠寡糖诱导拟南芥对Pseudomonas syringae pv tomato DC3000抗性的初步研究

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海藻酸钠寡糖诱导拟南芥对Pseudomonas syringae pv tomato DC300...

CO2加富环境下番茄—病原生物互作关系变化及其生理与分子机制

绿色生态可持续发展与植物保护——中国植物保护学会第十二...

作者：刘同梅王文霞尹恒中国科学院大连化学物理所

海藻酸钠寡糖（AOS）是海藻酸钠降解产物,是一种天然来源的生物活性物质,具有促进植物生长、缓解非生物胁迫等作用。目前,AOS诱导植物抗病的研究相对较少。本研究以模式植物拟南芥和Pseudomonas syringae *** DC3000（pstdc3000）为研... 详细信息

海藻酸钠寡糖（AOS）是海藻酸钠降解产物,是一种天然来源的生物活性物质,具有促进植物生长、缓解非生物胁迫等作用。目前,AOS诱导植物抗病的研究相对较少。本研究以模式植物拟南芥和Pseudomonas syringae *** DC3000（pstdc3000）为研究体系,明确了AOS可以诱导拟南芥抗pstdc3000。实验结果表明:AOS对拟南芥具有诱抗效果,诱抗效果与浓度具有密切的关系,最佳抗病浓度为25mg/kg。该浓度AOS预处理拟南芥后接种pstdc3000,与对照相比,处理组病情指数降低了8.83%,叶片中pstdc3000的增殖量显著下降,仅为对照的17.5%。同时处理组叶片中pstdc3000内参基因RecA、毒性标记基因avrPtoB也大幅下降,分别是对照组的14.1%和28.4%。25mg/kg AOS预处理拟南芥后,还可以激发抗性相关基因的变化,其中,水杨酸信号途径标记基因PR1、茉莉酸信号途径标记基因PDF1.2分别上升了10.52倍、4.59倍。综上,AOS可以诱导拟南芥抗pstdc3000,为AOS在植物病原菌的防治上提供一定的理论依据。

关键词：海藻酸钠寡糖拟南芥 pstdc3000 抗性基因

来源： cnki会议评论

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CO2加富环境下番茄—病原生物互作关系变化及其生理与分子机制

作者：张帅浙江大学

学位级别：硕士

自从工业化以来,大气中的CO2浓度已由100多年前的280μL/L左右快速升高到目前的380μL/L左右,并预计到本世纪末将达到730-1020μL/L。掌握CO2加富下植物各个方面的变化可以使我们了解未来某个时期植物生长发育的变化,并根据其变化制定... 详细信息

自从工业化以来,大气中的CO2浓度已由100多年前的280μL/L左右快速升高到目前的380μL/L左右,并预计到本世纪末将达到730-1020μL/L。掌握CO2加富下植物各个方面的变化可以使我们了解未来某个时期植物生长发育的变化,并根据其变化制定农业发展的战略以发挥优势规避劣势。在我国现代设施农业生产中,CO2加富日渐成为人们控制设施环境,调控作物生长发育的重要手段。多数研究者针对CO2浓度变化环境下植物的光合碳代谢、生态系统结构功能等开展了大量的研究,但关于在CO2浓度变化下病原生物对植物影响的研究十分有限。而植物病害是导致蔬菜等农作物产量下降和品质变劣的重要原因之一。因此,研究CO2浓度变化下作物与病原的互作关系,不仅有助于了解以大气CO2浓度上升为主要特征的未来气候变化下全球初级生产力变化特征,更加能够揭示CO2环境—作物—病原互作变化及其机制,对于设施农业生产实践中如何利用CO2加富的优势而规避其劣势具有十分重要的指导意义。本论文以番茄为对象,研究了人工控制环境CO2升高环境下三种典型病原生物烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus（TMV）、丁香假单胞细菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（Pst DC3000）及灰霉病原菌Botrytis cinerea （B. cinerea）对植物的影响及其互作关系。主要结果如下： 1.C02加富环境下番茄——TMV病毒互作关系变化利用人工控制环境提高CO2浓度,研究CO2加富下番茄接种TMV后基础抗性的变化。结果显示：CO2加富环境下TMV接种后番茄系统叶中TMV-CP的累积比正常CO2环境下相比明显减少。CO2加富及TMV接种条件下番茄体内水杨酸合成基因ICS1和PAL表达量提高;自由态和结合态水杨酸的含量增加;SA抗性信号路径的关键基因NPR1和PR1的表达量均在CO2加富及TMV接种条件下显著上调。而JA路径元件在CO2加富及TMV接种下均无明显变化。因此CO2加富下番茄对TMV基础抗性的提高可能与CO2加富环境下SA抗性路径的增强有关。 ***2加富下番茄-——pstdc3000细菌性病原菌互作关系变化 CO2加富环境下,番茄对细菌性病害pstdc3000的抗性增加。CO2加富及接种pstdc3000条件下番茄体内水杨酸合成基因ICS1和PAL表达上调,自由态和结合态水杨酸的含量增加。与TMV接种实验结果类似,SA抗性信号路径的关键基因NPR1和PR1的表达量均在CO2加富和接种pstdc3000后上调。对于未接种病原菌的番茄植株,JA信号途径中的下游原件PIⅠ和PIⅡ的表达量在CO2加富和对照环境下差异不大。但接种pstdc3000后PIⅠ,和PIⅡ的表达量与mock植株相比显著上调;CO2加富环境下接种pstdc3000后PI Ⅰ,和PIⅡ的表达量少于对照环境下的番茄。CO2加富下番茄对细菌性病害pstdc3000的抗性增加与SA信号途径在CO2加富环境下增强有关;而作为JA信号路径的元件PIⅠ和PIⅡ在对pstdc3000的抵抗中起到的作用较SA信号途径比较小 ***2加富下番茄——Botrytis cinerea真菌性病原菌的互作关系变化 CO2加富环境下,番茄对真菌性病害***的抗性减弱。CO2加富及接种灰霉病原菌后番茄体内水杨酸信号元件中NPR1和PR1均显著上调,JA信号途径中的原件PIⅠ和PIⅡ的表达量在接种灰霉病原菌后显著上调。但CO2加富环境下接种灰霉病原菌后番茄体内PIⅠ,和PIⅡ的表达量均显著低于对照环境。由此可见PIⅠ,和PIⅡ的表达在CO2加富下受到抑制可能是灰霉病发病严重的原因。 4.番茄NPR1及PI沉默后CO2加富对TMV、pstdc3000、及***抗性的影响采用VIGS方法沉默NPR1基因,在降低NPR1及PR1基因表达的同时,提高了PⅠⅠ、PⅠ Ⅱ基因的表达,从而削弱了CO2加富下TMV和pstdc3000的抗性效应及***的敏感性;沉默PI基因对NPR1及PR1基因的表达无明显影响,因此加剧了CO2加富下番茄对***的敏感性。研究发现番茄PIⅠ和PIⅡ沉默后对TMV的抗性不变;而对pstdc3000抗性减弱。由接种病毒后番茄体内PIs的表达量增加也不明显来看,JA信号途径的下游因子PIⅠ,和PIⅡ可能不参与到对TMV的抗性中,而参与到对活体营养型病原菌pstdc3000（?）勺抗性中。因此我们认为CO2加富下番茄与病原菌的互作关系变化与内源信息物质SA、JA间的交叉对话有关。

关键词：番茄 CO2加富抗性 TMV pstdc3000 B.cinerea 水杨酸茉莉酸

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玉米ZmGRM4基因的克隆及功能研究

玉米ZmGRM4基因的克隆及功能研究

作者：杭天露安徽农业大学

学位级别：硕士

植物病害作为一种常见的生物胁迫,对植物的生长发育造成了严重的破坏。而玉米作为全球重要的粮食作物及工业原料,各类病害已成为影响其产量质量的重要因素之一。因此,挖掘并研究玉米抗病相关基因具有重要意义。本研究基于前期拮抗内生... 详细信息

植物病害作为一种常见的生物胁迫,对植物的生长发育造成了严重的破坏。而玉米作为全球重要的粮食作物及工业原料,各类病害已成为影响其产量质量的重要因素之一。因此,挖掘并研究玉米抗病相关基因具有重要意义。本研究基于前期拮抗内生芽孢杆菌DZSY21可提高玉米植株的抗病能力,并通过对DZSY21处理后植株全基因组DNA甲基化测序(WGBS)分析筛选到一个与抗病相关的候选基因ZmGRM4,我们围绕此基因进行了功能研究,并获得了如下结果:1.生物信息学分析发现ZmGRM4基因定位在5号染色体上,编码序列全长为1905 bp,编码634个氨基酸,蛋白分子量为70.53 k Da,等电点7.07,包含了典型的乙烯受体蛋白保守结构域:三个疏水结构域、GAF以及His KA,结合系统发育树分析发现,ZmGRM4属于乙烯受体蛋白第Ⅰ亚家族,进化相对保守。2.组织表达模式分析发现ZmGRM4基因在玉米的不同组织均有表达,但在茎、叶和花丝中表达量较高。诱导表达模式分析发现ZmGRM4受玉米弯孢病菌、细菌性枯萎病菌以及福马毒素的诱导表达;同时在激素SA、JA的诱导下,ZmGRM4也略微上调表达。亚细胞定位结果显示ZmGRM4蛋白主要在细胞膜中表达。3.将ZmGRM4基因转入拟南芥获得过表达ZmGRM4转基因植株,并接种病原菌丁香假单胞菌Pst DC3000,结果显示过表达ZmGRM4可以提高拟南芥对Pst DC3000的抗性;转基因植株的病情指数、叶片内病原菌数量、叶片损伤程度都低于野生型株系。4.通过qRT-PCR检测SA、JA、ET信号通路标志基因的表达水平,发现在病原菌处理24 h后和野生型植株相比,转基因植株中PR1、PR2基因上调表达;PR1作为SA信号通路的标志基因,测定植株体内SA含量,结果显示病原菌处理后转基因植株中SA的积累明显高于野生型;同时利用SA抑制剂ABT预处理拟南芥,发现转基因植株失去了对Pst DC3000的抗性,表明ZmGRM4基因是通过SA介导的信号传导途径来提高拟南芥对Pst DC3000的抗性。5.构建pCUB-ZmGRM4-GFP载体瞬时表达玉米原生质体,ZmGRM4上调表达约40倍,在鞭毛蛋白flg22诱导下玉米中SA途径标志基因PR1上调8倍,进一步表明ZmGRM4基因是通过SA途径参与植物的防御进程。

关键词：玉米 ZmGRM4 抗病 pstdc3000

拟南芥pub10/pub11双突变体在抵抗丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株的功能分析

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拟南芥pub10/pub11双突变体在抵抗丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3...

作者：余涛涛湖南大学

学位级别：硕士

泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome,UPS）是真核生物体内的蛋白质降解途径,由泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3以及26S蛋白酶体复合物四个部分实现。植物泛素连接酶E3主要包括四种类型:细胞分裂后期复合体型、HECT型、... 详细信息

泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome,UPS）是真核生物体内的蛋白质降解途径,由泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3以及26S蛋白酶体复合物四个部分实现。植物泛素连接酶E3主要包括四种类型:细胞分裂后期复合体型、HECT型、SCF型和RING/U-box型。其中,植物U-box蛋白简称为PUB（plant U-box protein）。拟南芥中已报道至少存在64个PUB基因成员,有研究表明拟南芥PUBs（AtPUBs）家族成员在植物逆境响应中发挥重要功能,且不少家族成员之间存在功能互补或冗余的现象。AtPUB10是AtPUBs家族中的一员,通过介导b HLH家族MYC2转录因子的泛素化降解抑制茉莉酸途径、负调控脱落酸途径,然而缺乏pub10突变体对植物病原菌的响应,以及与AtPUB10高度同源的AtPUB11是否参与调控植物病原菌响应的研究。为了分析拟南芥E3泛素连接酶PUB10、PUB11对植物病原菌响应的影响,我们首先对AtPUB10、AtPUB11进行生物信息学分析,分析它们之间的亲缘关系以及同源性。从前提构建的遗传学突变体材料中,鉴定拟南芥pub10/pub11双突变体,并从pstdc3000侵染、病原菌引起植物突变体MAPK的变化、flg22刺激拟南芥叶片ROS释放量以及定量免疫基因的表达水平等方面着手,探究AtPUB10、AtPUB11在抵抗pstdc3000的调控作用。获得如下结果和结论:（1）通过生物信息学分析,发现构建的AtPUBs家族进化树AtPUB10、AtPUB11聚类在一起,两者蛋白氨基酸序列比对相似性达到75.44%,基因启动子都有多种光响应元件、激素响应元件以及防御和胁迫响应元件等,二级结构都主要由α-螺旋和无规卷曲构成,并且三级结构非常相似,说明两者有非常近的亲缘关系以及同源性,在拟南芥体内具有相似的生物学功能。（2）采用三引物法及表达量验证等方法成功鉴定并获得pub10/pub11双突变体;构建AtPUB10基因分段表达的pGEX4t-1载体,表达、纯化了PUB10分段蛋白;通过GSTPUB10-ARM分段蛋白免疫小鼠获得PUB10抗体,为后续AtPUB10、AtPUB11的生化功能研究打下基础。（3）通过植物抵抗病原菌的实验,发现pub10/pub11双突变体对pstdc3000更敏感,进一步分析AtPUB10、AtPUB11的缺失对植物免疫的影响,发现pub10/pub11双突变体在pstdc3000处理后MAPK磷酸化水平在10-20 min间快速下降,flg22刺激后ROS释放量降低,且JA响应基因与免疫负调控基因表达量上升明显,说明AtPUB10、AtPUB11在抵抗pstdc3000具有正调控作用。综上所述,本论文的研究结果表明AtPUB10、AtPUB11在拟南芥体内具有相似的生物学功能,能够利用大肠杆菌系统在体外分段表达,抵抗pstdc3000病原菌的过程具有正调控作用,并存在功能冗余。

关键词：拟南芥 PUB10 PUB11 pstdc3000 功能分析