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伴侣蛋白Hfq、proq对APEC致病力的影响及proq、sRNA RyfA对APEC生物被膜调控机制研究

伴侣蛋白Hfq、ProQ对APEC致病力的影响及ProQ、sRNA RyfA对APEC生...

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作者：陈睿南京农业大学

学位级别：硕士

禽大肠杆菌病(Avian colibacillosis)是由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic ***,APEC)引起的禽类多系统混合疾病的统称。作为肠道外致病性大肠杆菌(Ex PEC)的一种重要亚型,APEC对养禽业造成了很大的经济损失。同时,作为一类食源性病原... 详细信息

禽大肠杆菌病(Avian colibacillosis)是由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic ***,APEC)引起的禽类多系统混合疾病的统称。作为肠道外致病性大肠杆菌(Ex PEC)的一种重要亚型,APEC对养禽业造成了很大的经济损失。同时,作为一类食源性病原菌,APEC因具有人畜共患的潜力也时刻威胁着公共卫生安全。目前对APEC的防控主要以抗生素为主,然而由于抗生素的滥用,导致细菌出现了广泛耐药性,甚至出现了超级耐药菌,这使得对APEC的防控更为艰难。在外界环境中,APEC通常会形成生物被膜增强菌体对外界的抵抗力,进入机体后,APEC首先粘附在细胞表面,在躲过宿主的免疫系统攻击后才能感染深层组织,严重时引起败血症。sRNA(small RNAs)作为一种非编码RNA,已被证实在多种细菌的生命周期中扮演着重要的调控作用,且大多数sRNA是通过与其靶m RNA配对而发挥调控作用,在调控过程中通常需要伴侣蛋白的参与,如proq、Hfq等。我们探究了Hfq作为sRNA伴侣蛋白对APEC的致病力的调控。在构建了Hfq缺失株后,研究Hfq缺失株多种致病表型变化,结果发现在APEC的感染过程中,Hfq发挥着重要作用。另外还探究了伴侣蛋白proq与其sRNA RyfA的相互作用从而对APEC致病力及生物被膜的形成产生了正向的调控作用。发现proq及ryfA缺失株的毒力均明显下降。通过对proq作为伴侣蛋白结合RyfA生物被膜的形成机制进行了Northern blot及EMSA实验,揭示了proq与RyfA的结合对APEC毒力及生物被膜的形成具有正向调控作用。1.伴侣蛋白Hfq对APEC致病力的调控通过Red同源重组法构建缺失株FY26Δhfq,对缺失株进行了多种致病表型测定。结果表明,与野生株FY26相比,hfq的缺失导致APEC生长速率明显下降,生物被膜形成能力仅为野生株的一半。此外还发现hfq缺失株的毒力明显减弱,其中包括对细胞的粘附能力,在吞噬细胞内的存活能力,竞争能力,在动物体内的定殖能力以及致死率相较野生株都显著降低。上述结果表明RNA伴侣蛋白Hfq对APEC致病力有着重要的正向调控作用,为临床防控APEC提供了新的方向。2.伴侣蛋白proq与sRNA RyfA结合对APEC致病力及生物被膜形成有正向调控作用构建FY26的proq缺失株FY26Δproq以及回补株FY26Cproq,并对野生株、缺失株以及回补株的多种致病表型进行了测定。研究发现proq的缺失导致APEC生物被膜形成能力减弱、对细胞的粘附力降低、在吞噬细胞内的存活能力下降、在雏鸡及小鼠体内的定殖能力减弱、感染雏鸡及小鼠时的致死率下降,并仅能引起轻微的肝脏、肺脏等脏器病理变化。提取缺失株总RNA经转录组分析,结果显示,与FY26野生株相比,缺失株中有209个基因转录水平出现显著差异(变化超过两倍)。其中包括膜相关蛋白基因、硫酸盐转运体亚基相关基因等111个基因显著上调表达,另外有包括冷休克蛋白、热休克蛋白相关基因以及编码FAD结合蛋白的基因等98个基因显著下调表达。特别是proq的缺失导致了一类已知的sRNA-RyfA转录水平下调了约8倍。通过构建了ryfA缺失株、回补株测定RyfA对APEC致病表型的影响,结果显示FY26ΔryfA引起的表型变化与proq缺失株类似,而RyfA对生物被膜的正向调控作用显著强于proq。通过分析proq结合的RNA配体的结构以及RyfA的二级结构,经Northern blot、EMSA试验,我们发现,proq是通过与RyfA的相互作用对APEC的生物被膜的形成起到正向的调控作用的,并对APEC的致病力有着显著影响。以上研究为APEC/ExPEC的防控提供了新的思路。

关键词：禽致病性大肠杆菌 sRNA 伴侣蛋白 Hfq proq 生物被膜 RyfA 致病力

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