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Down-regulating Circular RNA prkcsh suppresses the inflammatory response after spinal cord injury

Neural Regeneration Research 2022年第1期17卷 144-151页

作者： Jia-Nan Chen Yi-Ning Zhang Li-Ge Tian Ying Zhang Xin-Yu Li Bin Ning Department of Orthopedics Jinan Central HospitalCheeloo College of MedicineShandong UniversityJinanShandong ProvinceChina Department of Orthopedics Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical UniversityJinanShandong ProvinceChina

Circular RNAs(circRNAs)are a class of conserved,endogenous non-coding RNAs that are involved in transcriptional and post-transcriptional gene regulation and are highly enriched in the nervous system.They participate in the survival and differentiation of multiple nerve cells,and may even promote the recovery of neurological function after stroke.However,their role in the inflammatory response after spinal cord injury remains unclear.In the present study,we established a mouse model of T9 spinal cord injury using the modified Allen’s impact method,and identified 16,013 circRNAs and 960 miRNAs that were differentially expressed after spinal cord injury.Of these,the expression levels of circprkcsh were significantly different between injured and sham-treated mice.We then treated astrocytes with tumor necrosis factor-αin vitro to simulate the inflammatory response after spinal cord injury.Our results revealed an elevated expression of circprkcsh with a concurrent decrease in miR-488 expression in injured cells.We also found that circprkcsh regulated the expression of the inflammationrelated gene Ccl2.Furthermore,in tumor necrosis factor-α-treated astrocytes,circprkcsh knockdown decreased the expression of Ccl2 by upregulating miR-488 expression,and reduced the secretion of inflammatory cytokines in vitro.These findings suggest that differentially expressed circRNAs participate in the inflammatory response after spinal cord injury and act as the regulators of certain microRNAs.Furthermore,circprkcsh may be used as an miR-488 sponge to regulate Ccl2 expression,which might provide a new potential therapy for SCI.The study was approved by the Animal Ethics Committee of Shandong University of China(approval No.KYLL-20170303)on March 3,2017.

关键词： astrocyte Ccl2 ceRNA circRNA inflammation miR-488 ncRNA prkcsh RNA sequencing spinal cord injury

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prkcsh通过放射诱导内质网应激对结直肠癌放射敏感性的作用及机制研究

PRKCSH通过放射诱导内质网应激对结直肠癌放射敏感性的作用及机制...

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作者：金静中南大学

学位级别：硕士

目的:研究表明蛋白激酶C底物80K-H(Protein kinase C substrate 80K-H,prkcsh)参与内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)通路的激活,影响肿瘤的发生发展,但prkcsh对肿瘤放射敏感性的影响目前未见报道。本研究旨在探讨prkcsh是否影响照射后结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)细胞的放射敏感性及其具体机制探究,有利于探究结直肠癌放射敏感性分子调控新机制,具有重要的公共卫生意义。方法:通过慢病毒感染构建prkcsh敲低人结直肠癌细胞HCT116和HT29及prkcsh基因过表达的HCT116细胞;通过实时荧光定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测prkcsh在结直肠癌组织中的表达量,通过细胞增殖计数(Cell Counting Kit-8,CCK-8)探究prkcsh对结直肠癌细胞照射前后细胞活力影响,通过划痕实验和侵袭实验分析prkcsh对细胞迁移和侵袭能力的影响;通过克隆形成实验检测细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞凋亡和蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)检测C-Caspase3、Bax、Bcl2蛋白表达量分析prkcsh对结直肠癌细胞放射敏感性的影响;通过WB实验检测GRP78、PIRE1α、XBP1s蛋白表达量分析prkcsh对放射后ERS通路激活的影响;通过中性彗星电泳检测细胞尾距、免疫荧光检测γH2AX foci点和WB实验检测P-DNAPKcs、P-ATM、P-ATR等关键蛋白表达量分析prkcsh在DNA损伤修复中的作用,并且探讨由prkcsh介导的ERS通路和DNA损伤修复通路之间的联系;最后利用裸鼠成瘤(Cell derived xenograft,CDX)实验模型,观察prkcsh敲低细胞在放射前后与对照组细胞成瘤的差异,并通过免疫组化、WB实验进一步验证;使用IBM SPSS26.0软件进行统计分析,其中两个独立实验组采用了两样本t检验,多个独立实验组组间差异采用方差分析。规定Pprkcsh在结直肠癌组织中表达量升高,与放射敏感癌组织相比,放射不敏感癌组织中m RNA相对表达量更高为(2.71±0.83);(2)敲低prkcsh使照射后结直肠癌细胞活力水平降低,照射后24 h细胞迁移和侵袭能力减弱,照射后克隆形成数目显著减少,存活分数降低,并促进照射后结直肠癌细胞凋亡,24 h凋亡率为12.08±0.34%,48 h凋亡率为22.4±0.70%,凋亡相关蛋白表达升高;过表达prkcsh会促进照射后结直肠癌细胞的生长活力,抑制照射后细胞的凋亡;(3)敲低prkcsh使照射后细胞彗星尾距显著高于对照组,免疫荧光检测照射后敲低prkcsh细胞的γH2AX foci点数量增加;(4)敲低prkcsh后GRP78、P-IRE1α、XBP1s蛋白表达下调,照射后ERS受到抑制,P-DNAPKcs、P-ATM和P-AIR等DNA损伤修复蛋白表达下调,DNA损伤修复通路NHEJ和HR受到抑制,过表达prkcsh则会在照射后促进这一过程;(5)裸鼠皮下荷瘤结果表明,照射后敲低prkcsh组裸鼠的肿瘤体积和重量小于对照组;免疫组化结果显示照射后敲低prkcsh后γH2AX蛋白表达增加,细胞增殖减少,凋亡增加;WB实验证明照射后敲低prkcsh会抑制ERS通路和DNA损伤修复通路激活。结论:(1)prkcsh在结直肠癌组织中高表达,有利于癌细胞的增殖、迁移和侵袭,对辐射具有抵抗性,降低了结直肠癌对放射的敏感性。(2)prkcsh低表达会影响IRE1α的磷酸化激活,从而抑制结直肠癌中放射诱导的内质网应激通路IRE1α的激活,NHEJ和HR关键蛋白磷酸化激活减少,DNA损伤修复通路受到抑制。(3)体内外实验结果共同证明prkcsh在结直肠癌中通过影响内质网应激通路介导的DNA损伤修复通路的激活来发挥作用。图36幅,表13个,参考文献89篇

关键词：放射 DNA损伤修复内质网应激结直肠癌 prkcsh

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水稻prkcsh参与内质网介导细胞程序性死亡的功能研究

水稻PRKCSH参与内质网介导细胞程序性死亡的功能研究

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作者：陈冰南京农业大学

学位级别：硕士

细胞程序性死亡(PCD)在动植物生长发育过程中普遍存在,具有重要意义。目前,调节细胞程序性死亡的途径主要有三种:死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径。而对内质网途径的具体机制尚不清楚。本实验室在前期研究中发现水稻prkcsh是PCD... 详细信息

细胞程序性死亡(PCD)在动植物生长发育过程中普遍存在,具有重要意义。目前,调节细胞程序性死亡的途径主要有三种:死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径。而对内质网途径的具体机制尚不清楚。本实验室在前期研究中发现水稻prkcsh是PCD相关基因。prkcsh即蛋白激酶C底物80K-H,该序列编码葡糖苷酶Ⅱ的β亚基,与其催化作用葡糖苷酶Ⅱ的α-亚基相互作用,葡糖苷酶Ⅱ催化去掉N-端α-1,3-连接的葡萄糖。本研究以水稻为材料,具体分析prkcsh的亚细胞定位及其与内质网介导的PCD之间的关系。首先利用生物信息学方法对PRRKCSHH基因序列和蛋白结构进行了分析:prkcsh基因大小为1845bp,编码614个氨基酸;主要包含蛋白结构LDLa(低密度脂蛋白受体域A类)、prkcsh(蛋白激酶C底物)以及N-端的信号肽。根据亚细胞定位预测分析,结合蛋白C-端HDEL序列推测该蛋白很可能定位在内质网上。采用PEG转化法将带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的prkcsh转入水稻原生质体中,观察绿色荧光与内质网染料完全重合,证明prkcsh定位在内质网上。在DTT处理产生内质网胁迫条件下,prkcsh出现点状分布现象。为深入探索prkcsh在内质网途径起的作用,本研究利用酵母双杂交实验,筛选与之互作的蛋白。首先将prkcsh与pGBKT7构建成融合诱饵载体,验证了pGBKT7-prkcshH没有毒性和自激活作用。将该重组诱饵载体pGBKT7-PRRKCSHH与水稻cDNA文库进行融合筛选,在四缺培养基上筛出21个阳性单克隆,将这21个阳性克隆在含X-a-gal/AbA的四缺板进行验证,筛选出10个与prkcsh相互作用的基因,经测序分析得到5个非重复的基因。验证后得到4个阳性克隆,其基因的登录号分别为FPP合酶、GFA2、RP L23、R5P3E。其中GFA2位于线粒体上,并参与细胞程序性死亡。将prkcsh与GFA2进行回转验证,互作效果强烈。为进一步探究prkcsh与PCD的关系,本实验采用原核表达体系表达prkcsh蛋白。将PRRKCSHH与PET-28a载体构建成融合载体,将融合载体转入大肠杆菌DE-3中。鉴定出的阳性克隆进行扩大培养,经IPTG诱导后用SDS-PAGE胶检测出两条大量表达的带有His标签的prkcsh蛋白。进过冰上破碎,蛋白电泳检测上清没有目的蛋白,prkcsh 蛋白以包涵体形式存在。在尿素变性的prkcsh蛋白中加入含有0.5mML-Arg、1mMGSSG 和 2mMGSH 的 LEBuffer 中进行复性,用 Ni-NTA 柱分离纯化prkcsh蛋白,经透析袋透析后通过SDS-PAGE电泳检测发现存在两条目的蛋白条带,其大小分别为80kDa和110kDa。分别切下SDS-PAGE胶上两条目的条带,进行质谱鉴定,分析发现这两个蛋白条带都为prkcsh蛋白。由于该蛋白带有His标签,用Western方法发现110 kDa的蛋白被杂交出含有His标签的条带,而80kDa未被杂交出条带,证明80kDa蛋白是不完整的prkcsh,而110 kDa蛋白是完整的prkcsh。原核表达产物为深入研究上述相互作用的机制奠定了基础。综上所述,本研究发现prkcsh定位在内质网上,通过酵母双杂交证明其与PCD相关的GFA2相互作用,显示prkcsh也可能参与内质网介导的PCD过程。原核表达产物为深入研究上述相互作用机制奠定了基础。

关键词：内质网 prkcsh 细胞程序性死亡

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