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表达乙脑病毒prm基因重组伪狂犬病病毒的构建

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畜牧兽医学报 2007年第1期38卷 53-58页

作者：李自力陈焕春徐高原方六荣肖少波王祥何启盖华中农业大学动物医学院湖北省预防兽医学重点实验室武汉430070 湖北省公安厅武汉430034

本研究以乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株基因组RNA为模板,采用RT-PCR一步法扩增了prm基因的全长cDNA(558 bp),用BamHI和EcoRI双酶切prm基因的扩增产物,回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中,获得了转... 详细信息

本研究以乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株基因组RNA为模板,采用RT-PCR一步法扩增了prm基因的全长cDNA(558 bp),用BamHI和EcoRI双酶切prm基因的扩增产物,回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中,获得了转移载体pPgG-prm,并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明:与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较,prm基因的同源性为100%。以伪狂犬病病毒Ea株TK-/gG-/LacZ+突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒prm基因的重组伪狂犬病病毒TK-/gG-/prm+,为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。

关键词：乙型脑炎病毒 prm基因重组伪狂犬病病毒

登革2型prm基因的重组病毒对不同型别登革病毒复制的阻断作用

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中国生物化学与分子生物学报 2002年第5期18卷 568-572页

作者：于曼秦鄂德陈水平赵月峨范宝昌段鸿元姜涛杨佩英胡志君军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

观察登革 2型prm基因的pSFV重组甲病毒抗该型病毒的作用 ,进一步探讨登革 2型prm基因的这种重组病毒对其它 3个血清型登革病毒复制的阻断作用 .采用体外转录和电穿孔 ,分别将构建的含正、反义prm基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RN... 详细信息

观察登革 2型prm基因的pSFV重组甲病毒抗该型病毒的作用 ,进一步探讨登革 2型prm基因的这种重组病毒对其它 3个血清型登革病毒复制的阻断作用 .采用体外转录和电穿孔 ,分别将构建的含正、反义prm基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒 .再将激活的重组病毒感染细胞 ,分别用不同型病毒进行攻击 .然后通过免疫荧光法 ,观察对登革病毒复制的阻断作用 .结果表明 ,含登革 2型prm基因的重组病毒不仅可阻断登革 2型病毒的复制 ,同样具有抑制其他 3个型病毒复制的能力 ,且抗登革 1、4型病毒的复制作用强于抗登革 3型病毒的作用 .用 10 3 TCID50 剂量的登革病毒攻击 ,含反义prm基因的重组病毒可完全阻断登革 1、3、4型病毒的复制 .但含正义prm基因的重组病毒对登革 3型病毒的复制不能完全阻断 .

关键词：登革2号 prm基因重组病毒登革病毒病毒复制阻断作用

登革病毒prm基因真核表达载体的构建及在白纹伊蚊细胞C6/36中的表达

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中国人兽共患病杂志 2002年第3期18卷 45-47页

作者：葛春喜黄炯烈陈观今吴瑜王玲中山医科大学寄生虫教研室广州510080

目的　构建登革病毒prm基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6 / 36中表达。方法　将prm基因亚克隆入真核表达载体 pEGFP -N3,转化大肠杆菌JM 10 9,筛选阳性克隆进行PCR及酶切鉴定 ,将获得的重组质粒以脂质体法转化白纹伊蚊C6 / 36细胞并... 详细信息

目的　构建登革病毒prm基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6 / 36中表达。方法　将prm基因亚克隆入真核表达载体 pEGFP -N3,转化大肠杆菌JM 10 9,筛选阳性克隆进行PCR及酶切鉴定 ,将获得的重组质粒以脂质体法转化白纹伊蚊C6 / 36细胞并使其表达 ,利用RT -PCR法检测目的基因的转录 ,Western -blot检测融合蛋白的表达。结果　成功构建了 pEGFP -prm重组质粒 ,RT -PCR证明 prm基因在蚊细胞内的转录 ,Western -blot检测到 prm -GFP融合蛋白的表达。结论　成功构建登革了病毒 prm基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6 / 36中表达。

关键词：登革病毒 prm基因 RT-PCR Western blot 真核表达白纹伊蚊

登革2型病毒prm基因对不同型登革病毒复制的特异抑制作用

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军事医学科学院院刊 2002年第1期26卷 24-27页

作者：秦鄂德于曼赵月峨陈水平胡志君范宝昌段鸿元杨佩英军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

目的 :将我国登革 2型病毒prm(D2 _prm)基因导入甲病毒载体系统 ,探讨含正、反义prm基因的重组病毒对不同血清型登革病毒复制的特异抑制作用。方法 :采用体外转录和电穿孔的方法 ,首先分别将构建的含正、反义prm基因的重组质粒DNA和辅... 详细信息

目的 :将我国登革 2型病毒prm(D2 _prm)基因导入甲病毒载体系统 ,探讨含正、反义prm基因的重组病毒对不同血清型登革病毒复制的特异抑制作用。方法 :采用体外转录和电穿孔的方法 ,首先分别将构建的含正、反义prm基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒。再将经激活的重组病毒感染宿主细胞 ,分别用不同型登革病毒攻击 ,然后通过免疫荧光法 ,观察对不同型登革病毒复制的抑制作用。结果 :含登革 2型正、反义prm基因的重组甲病毒 ,不仅可完全抑制该型病毒在宿主细胞中的复制 ,而且对其他 3个型病毒的复制也具有不同程度的抑制作用。含反义prm基因的重组病毒对 4个型登革病毒复制的抑制作用最强。结论 :登革 2型病毒的正、反义prm基因在宿主细胞中通过重组甲病毒 ,可介导对登革 1～

关键词：甲病毒载体抗病毒作用登革2型病毒 prm基因不同型登革病毒复制特异抑制作用

基于登革2型病毒prm基因的新型脱氧核酶对病毒RNA降解作用的初步观察

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军事医学科学院院刊 2007年第1期31卷 16-19,23页

作者：尉雁姜涛李晓峰赵慧刘忠钰邓永强刘然陈水平于曼秦鄂德山西医科大学第二医院太原030001 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的:针对登革2型病毒(DEN2)prm基因设计新型脱氧核酶并观察其抗病毒作用。方法:根据脱氧核酶(DR z)裂解RNA靶位的特异性,选择DEN2 prm基因中符合5′…R↓Y…3(′R=A/G,Y=U/C)特征且其二级结构中以未配对与配对碱基的磷酸二酯键为靶位,... 详细信息

目的:针对登革2型病毒(DEN2)prm基因设计新型脱氧核酶并观察其抗病毒作用。方法:根据脱氧核酶(DR z)裂解RNA靶位的特异性,选择DEN2 prm基因中符合5′…R↓Y…3(′R=A/G,Y=U/C)特征且其二级结构中以未配对与配对碱基的磷酸二酯键为靶位,设计合成DEN2特异性脱氧核酶,筛选具有裂解prm RNA活性的DR z。观察DR z与靶序列浓度比、Mg2+浓度及反应时间对DR z裂解效率的影响。结果与结论:体外裂解实验显示,在所设计合成的8个脱氧核酶中,DR z614对登革病毒的prm RNA靶序列具有裂解活性,降解效率高达82%。本研究为进一步探讨新型抗登革病毒策略奠定了基础。

关键词：登革病毒脱氧核酶 prm基因

乙型脑炎病毒SA14-14-2株prm基因的克隆与测序

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动物医学进展 2003年第1期24卷 87-89页

作者：王祥陈焕春何启盖吴斌贾杏林吴美洲湖北省公安厅刑侦总队湖北武汉430070 华中农业大学畜牧兽医学院湖北武汉430070

以我国乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的基因组RNA为模板,设计1对包含prm基因完整编码区的引物,采用一步法RT-PCR技术扩增其prm基因,扩增出大小约558bp特异性带。将其克隆到pMD18-T载体中,用双脱氧末端终止法进行全序列测定,序列分析表明... 详细信息

以我国乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的基因组RNA为模板,设计1对包含prm基因完整编码区的引物,采用一步法RT-PCR技术扩增其prm基因,扩增出大小约558bp特异性带。将其克隆到pMD18-T载体中,用双脱氧末端终止法进行全序列测定,序列分析表明我国疫苗株SA14-14-2的prm基因核苷酸序列与GenBank收录的完全一致。prm基因的获得为进一步研究该基因的免疫原性以及乙型脑炎病毒基因工程疫苗奠定了基础。

关键词：乙型脑炎乙型脑炎病毒 SAl4-14-2株 prm基因基因克隆序列分析反转录-聚合酶链反应

登革病毒(NGC株)C与prm全长基因的扩增与克隆

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中国人兽共患病杂志 2002年第1期18卷 5-7页

作者：葛春喜陈观今黄炯烈中山医科大学病原生物学部广州510080

目的　从登革病毒 (NGC株 )中快速分离基因组RNA ,RT -PCR扩增及克隆C和 prm全长基因 ,从而为研究蚊虫细胞对登革病毒的细胞内免疫研究奠定基础。方法　以Trizol试剂从C6 / 36细胞培养上清中提取基因组RNA ,RT -PCR扩增全长C和 prm基因 ... 详细信息

目的　从登革病毒 (NGC株 )中快速分离基因组RNA ,RT -PCR扩增及克隆C和 prm全长基因 ,从而为研究蚊虫细胞对登革病毒的细胞内免疫研究奠定基础。方法　以Trizol试剂从C6 / 36细胞培养上清中提取基因组RNA ,RT -PCR扩增全长C和 prm基因 ,T -A重组入pGEM -T载体 ,重组质粒的双酶切、PCR与测序鉴定。结果与结论　应用Trizol试剂从蚊细胞培养液上清中快速分离到高纯度和完整登革病毒RNA基因组 ,成功扩增与克隆出全长登革病毒C和

关键词：登革病毒 NGC株 prm基因 C基因 RT-PCR

猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立及乙脑病毒四川分离株prm/E基因的序列分析

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猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立及乙脑病毒四川分离株PrM/E...

作者：王伟杰四川农业大学

学位级别：硕士

乙型脑炎(简称乙脑)是一种经蚊媒传播的严重威胁人畜健康的急性传染病。猪是乙脑病毒的重要储存宿主和扩增宿主,乙脑带毒猪是该疫病的主要传染源。该病给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。本研究建立了猪乙脑病毒RT-PCR诊断方法并对... 详细信息

乙型脑炎(简称乙脑)是一种经蚊媒传播的严重威胁人畜健康的急性传染病。猪是乙脑病毒的重要储存宿主和扩增宿主,乙脑带毒猪是该疫病的主要传染源。该病给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。本研究建立了猪乙脑病毒RT-PCR诊断方法并对分离自四川崇州猪场和内江猪场的蚊源乙脑病毒(CZ1株和NJ1株)进行prm/E基因的序列分析,从分子水平上了解四川乙脑分离毒株的生物学特性,对JEV的诊断、预防和控制具有较大的意义。1.猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立参考GenBank中收录的31株JEV E基因序列,进行相似性分析,以SA14-14-2为参照确定1725-2163区段为扩增靶序列;用Primer 5软件合成了一对引物(P1/P2),产物长度为439bp。对试验的Mg2+浓度、引物浓度、退火温度等反应条件进行优化、选择。确定了PT-PCR扩增最佳体系为：10×buffer (Mg2+-Free) 5μL,25mM Mg2+ 2.0μL, 2.5mM dNTP 4μL, 10pmol上下游引物各0.8μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL,DNA模板1μL,最后用无菌去离子水补至50μL。PCR扩增程序如下：94℃-5min;94℃-30S,56℃-30 S,72℃40 S,30个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。RT-PCR特异性检测试验表明,该方法对常见的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒扩增均无条带;敏感性检测显示,能最低检测到10pg的JEV核酸。结果表明建立了RT-PCR检测JEV方法,具有简单、快速、特异性好、灵敏性高等优点。2.四川乙脑分离株CZ1株、NJ1株prm/E基因的序列分析采用RT-PCR扩增并克隆分离株的prm/E区段序列,利用prm(456-695位)区段序列与29株参考序列进行基因分型分析,并对E区段核苷酸序列与减毒活疫苗株SA14-14-2的相应序列进行比对,分析CZ1株、NJ1株与SA14-14-2氨基酸的相似性及关键结构域的差异。结果表明,CZ1株prm(456-695位)区基因分型证实分离株属于基因Ⅰ型,E区段与SA14-14-2的核苷酸与氨基酸相似性分别为90.9%和97.2%,但在E蛋白的活性关键结构域有15个氨基酸存在差异;JEV-NJ1株prm(456-695位)区基因分型证实分离株属于基因Ⅲ型,E区段与SA14-14-2的核苷酸与氨基酸相似性分别为99.6%和99.2%,但在E蛋白的活性关键结构域有3个氨基酸存在差异;本研究初步确定了CZl株和NJ1株的部分分子特征,对乙脑的流行病学研究及其防治具有重要意义。

关键词：猪乙型脑炎 RT-PCR prm基因基因型 E基因

乙型脑炎病毒重庆分离株CQRC-02 prm/E基因的克隆和序列分析

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乙型脑炎病毒重庆分离株CQRC-02 prM/E基因的克隆和序列分析

作者：唐方强四川农业大学

学位级别：硕士

乙脑病毒的毒力、免疫原性、细胞嗜性等主要由病毒的囊膜蛋白决定的，E蛋白也是乙脑感染的重要保护性抗原，本实验分别用BHK21细胞和乳鼠来增殖疫苗株SA14-14-2和重庆分离株CQRC-02，用抽提的病毒基因组RNA通过RT-PCR扩增prm／E基因，... 详细信息

乙脑病毒的毒力、免疫原性、细胞嗜性等主要由病毒的囊膜蛋白决定的，E蛋白也是乙脑感染的重要保护性抗原，本实验分别用BHK21细胞和乳鼠来增殖疫苗株SA14-14-2和重庆分离株CQRC-02，用抽提的病毒基因组RNA通过RT-PCR扩增prm／E基因，并将该片段重组到克隆载体PUC18。从Genbank中获得中国其他乙脑病毒分离株的核酸序列，根据已在Genbank上登记的E基因核酸序列采用CLUSTAL W软件运用邻接法（neighbor joining）进行分析并绘制基因树，分析表明重庆分离株CQRC-02和我国大部分分离株属于基因型Ⅲ，SH-80和SH-90株属于基因型Ⅰ。通过对E蛋白氨基酸序列作多序列比较，表明重庆分离株CQRC-02在E蛋白氨基酸序列上符合强毒特征。采用CKUSTAL W软件对E蛋白的氨基酸序列作多序列比较，分析造成日本中山株和我国弱毒疫苗母株SA14、灭活疫苗毒株P3株和标准株A2抗原性差异的氨基酸突变位点，表明E51、E83和E242的氨基酸突变可能是造成日本中山株抗原性不同的原因，在这些位点，CQRC-02株和我国的其他分离株一致。

关键词：乙脑 prm基因 E基因基因型抗原性