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中国细胞生物学学报 2020年第4期42卷 582-591页

作者：陈虹宇许静薄涛连荫杰郝惠娟王伟山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室太原030006 山西大学生命科学学院太原030006

促进染色质转录因子(facilitate chromatin transcription,FACT)在DNA复制、转录、损伤修复相关的染色质重塑过程发挥重要的作用。FACT复合物包含pob3/SSRP1(structure-specific recognition protein-1)和SPT16(suppressor of Ty 16)两个亚基,该复合物及其亚基的功能虽在真菌、植物和动物上有些研究,但具体功能仍不完全清楚。该文以原生动物四膜虫为研究对象,对其促进染色质转录因子亚基pob3进行研究。结果显示,嗜热四膜虫FACT复合物中的pob3基因在营养生殖时期和饥饿时期表达,在有性生殖时期表达上调。在生长期和饥饿期,pob3定位于亲本大核和小核上;在有性生殖时期,pob3定位于功能小核和新大核,在降解的小核和降解的亲本大核中定位消失。截短N-端的HA-pob3Δ33在有性生殖前期定位在细胞质,但在有性生殖后期定位在配子和新发育的大核。截短C-端的HA-pob3Δ87只定位在细胞质。pob3敲减突变株发生了异常的配子核和合子核的有丝分裂,导致有性生殖无法正常完成。结果表明,促进染色质转录因子亚基pob3参与调控嗜热四膜虫细胞核的有丝分裂,对有性生殖的完成是必需的。

关键词：嗜热四膜虫 pob3 细胞定位突变有性生殖

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促进染色质转录因子亚基pob3调控嗜热四膜虫有性生殖过程

促进染色质转录因子亚基Pob3调控嗜热四膜虫有性生殖过程

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作者：陈虹宇山西大学

学位级别：硕士

真核生物的组蛋白与DNA构成核小体,继而压缩形成染色质。但这种复杂构象确实会影响了DNA的复制,转录和修复等活动。促进染色质转录因子(Facilitate Chromatin Transcription,FACT)复合物是H2A-H2B的结合伴侣,由SPT16和pob3/SSRP1这2个... 详细信息

真核生物的组蛋白与DNA构成核小体,继而压缩形成染色质。但这种复杂构象确实会影响了DNA的复制,转录和修复等活动。促进染色质转录因子(Facilitate Chromatin Transcription,FACT)复合物是H2A-H2B的结合伴侣,由SPT16和pob3/SSRP1这2个亚基构成,能够影响基因的复制,转录和修复等活动。嗜热四膜虫具有特殊的核发育阶段,为了解组蛋白伴侣在染色质装配中如何发挥作用提供了可能。本文对FACT的亚基pob3在四膜虫中的功能展开了详尽的研究。结果如下:1.嗜热四膜虫中pob3基因生物信息学分析促进染色质转录复合物FACT由SPT16和pob3/SSRP1这2个亚基构成,且pob3和SPT16这2个亚基存在协同进化。实时荧光定量PCR发现,pob3在整个结合生殖的表达量较高,并在6 h达到顶峰,不过,在营养生长以及饥饿时期表达水平很低。***-pob3定位在小核和大核为了研究pob3在四膜虫细胞中的定位,构建了包含HA-Tag的质粒pXS75-pob3。免疫荧光定位表明,HA-pob3在生长,饥饿和接合生殖时期都定位在小核和大核,其中凋亡的亲本大核和小核定位消失;但在接合生殖末期,只定位在小核。结果表明pob3可能不仅参与了大核转录和小核复制的进行,也参与小核结构的维持。***3的N端结构域和C端结构域协同参与pob3蛋白定位删除包含核定位信号序列NLS(24-33)的N端结构域后,HA-pob3△33于结合生殖前期没有定位;核选择时期,其在凋亡的小核和大核没有定位,唯独定位在选择出来的配子核;在anlagen,定位在新大核,而小核没有定位。截短C端(350-437)结构域后,在整个结合生殖过程中,HA-pob3△87仅定位于细胞质,表明pob3在细胞中的定位直接受到了其C端酸性区域的影响。结果发现,pob3的N端和C端结构域一同参与了其在细胞中的定位,而且可能拥有不一样的入核机制。***3敲减抑制了四膜虫合子核和配子核的有丝分裂为了研究pob3在四膜虫中的功能,构建了干扰质粒ppob3hpNEO。结果表明,27%的配对细胞,在配子核有丝分裂结束后,随即异常分开,成为多小核单细胞;剩余细胞继续发育,其中75%的细胞合子核有丝第二次分裂无法进行。将结合生殖时期的细胞用溶酶体和自噬体荧光探针标记后,发现在anlagen阶段,亲本大核可以按照自噬途径进行程序化降解。结果表明,pob3参加调控了合子核和配子核的复制和有丝分裂。本研究首次鉴定了嗜热四膜虫促进染色质转录复合物亚基pob3。pob3定位在各个发育阶段的小核和大核上,其中凋亡的亲本大核和小核定位消失。干扰pob3发现无法进行合子核的有丝第二次分裂。结果表明,pob3不但能够参与大核的转录和小核的复制及结构维持,而且能够参与调控了合子核和配子核的有丝分裂和复制。

关键词：嗜热四膜虫 pob3 细胞定位突变有性生殖

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