检索结果-南通市图书馆

作者：高洁南京农业大学

学位级别：硕士

需冷量是否满足影响着果树作物的花芽质量和水果产量,而休眠是一种积累需冷量的过程。梅是一种蔷薇科植物,起源于中国,具有很好的观赏价值及食用价值。由于其早春开花而且有较小的基因组测序数据,被认为是研究休眠良好的材料。近几年,mi... 详细信息

需冷量是否满足影响着果树作物的花芽质量和水果产量,而休眠是一种积累需冷量的过程。梅是一种蔷薇科植物,起源于中国,具有很好的观赏价值及食用价值。由于其早春开花而且有较小的基因组测序数据,被认为是研究休眠良好的材料。近几年,microRNA被报道在植物生命过程的各个阶段都起着重要的作用,为了研究microRNA在梅休眠中的调控作用,进一步了解休眠的分子机理。本文以梅品种‘桃型梅’的不同休眠阶段的花芽为材料进行了 miRNA高通量测序并进行分析。深入研究了在休眠进程中表达量变化明显的miR169家族,并通过RLM-5’RACE实验验证其预测靶标。GA4处理梅休眠枝条检测NF-Y家族三个亚族基因PmNF-YA3、PmNF-YB3和PmNF-YC1的表达趋势。进一步通过酵母双杂交实验以及双分子荧光互补实验证明pmrgl2、PmNF-YA3、PmNF-YB3和PmNF-YC1蛋白两两之间的互作关系。主要结果如下:1.通过对休眠四个时期梅花芽材料进行miRNA组测序,从2709万clean reads中得到了共679个新型miRNA和199个已知miRNA可能参与梅休眠。差异表达的已知miRNA属于55个保守的miRNA家族,其中miR159家族最多,其次是miR166,miR156和miR171家族,这些家族被报道在休眠或者开花中起重要作用。对差异表达的miRNA进行靶基因预测,预测靶向基因中有很多转录因子或与激素合成和信号传导相关。我们随机挑选了 9个miRNA进行qRT-PCR验证,与转录组测序结果的表达趋势基本一致。***测序结果中,miR169家族由于其在诱导休眠阶段表达量上升,而在休眠解除阶段表达量明显下降的特点引起了我们的注意,并且其预测靶向转录因子NF-YA。通过结合休眠不同时期的转录组结果数据初步说明两者可能存在靶向关系,NF-YA在诱导休眠阶段表达水平下降,在休眠解除阶段上升,与miR169呈现相反的表达趋势。最后通过RLM-5’RACE实验证实了 miR169e靶向PmNF-YA3,并且在miR169成熟体5’端第9和第10位点处切割。3.为检测NF-Y家族在赤霉素诱导梅休眠解除中的作用。以高需冷量品种‘丰后’休眠时期一年生枝条为材料采用外源GA4处理,采集处理后0d、3d、5d、8d、10d的枝条花芽,提取RNA进行用qRT-PCR实验验证NF-Y家族基因的表达量变化。结果显示,GA4处理后NF-YA家族基因PmNF-YA3、PmNF-YB3和PmNF-YC1表达量明显上升,与GA信号抑制因子pmrgl2表达趋势相反。4.验证NF-Y家族与pmrgl2的关系。构建了PmNF-YA3、PmNF-YB3和PmNF-YC1基因的酵母双杂交猎物载体和诱饵载体。将猎物质粒AD转入Y187,诱饵质粒转入Y2H Gold并进行重组质粒的毒性检测和自激活检测。结果表明,它们对酵母菌株没有毒性且自身没有转录激活活性。将猎物质粒和诱饵质粒共同转入Y2H Gold酵母感受态进行酵母双杂交实验。结果显示PmNF-YA3、PmNF-YB3和PmNF-YC1蛋白之间相互作用,并且都与pmrgl2蛋白存在互作。利用双分子荧光互补实验对蛋白互作进行验证,与酵母双杂结果一致。

关键词：梅花芽休眠 microRNA 高通量测序 NF-Y pmrgl2

H2O2在外源GA4解除果梅芽休眠中的作用

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H2O2在外源GA4解除果梅芽休眠中的作用

作者：温璐华南京农业大学

学位级别：硕士

梅(Prunus mune *** Zucc.)原产中国,属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus L.)植物,在我国的栽培利用已有三千多年的历史,需冷量范围比较大,从26.3 CP到75.7 CP,在研究果树季节性休眠机制中具有独特优势。大量研究发现,GA4对调控植物的休眠... 详细信息

梅(Prunus mune *** Zucc.)原产中国,属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus L.)植物,在我国的栽培利用已有三千多年的历史,需冷量范围比较大,从26.3 CP到75.7 CP,在研究果树季节性休眠机制中具有独特优势。大量研究发现,GA4对调控植物的休眠起到关键的作用,且发现用GA4喷施果梅枝条可以解除芽的休眠。本研究以果梅为材料,采用紫外分光光度计法和qRT-PCR技术,研究了不同处理解除休眠过程中,果梅芽内H2O2含量、抗氧化酶类活性的变化;以及抗氧化酶类编码基因和信号相关基因的表达变化。对H2O2在外源GA4解除果梅芽休眠中起到的信号作用进行分析。以杨树组培苗为材料,通过农杆菌介导的方法,将构建完成的pmrgl2基因过表达载体转化到杨树组培苗中,测定转基因杨树苗叶片中的H2O2含量和抗氧化酶类活性;并对抗氧化酶类编码基因及信号相关基因进行表达分析;并采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)技术,测定了转基因组培苗和杨树组培苗中的GA4含量。主要结果如下:1.以高需冷量果梅品种'丰后'为试材,分别于2013年及2014年果梅树体自然休眠期多次采集枝条,研究200 μM GA4处理和10 mM H2O2以及质量分数为1%的H2O2处理对人工气候室内水培枝条萌芽率和H2O2含量、抗氧化酶类活性及H2O2相关基因和信号相关基因表达的影响。结果表明,200 μMGA4处理的枝条花芽的萌芽率明显高于1%H202、10 mM H2O2处理和对照,且南京地区最佳处理时期为元旦前后;在GA4处理促进果梅休眠解除期间,H2O2含量在果梅花芽休眠解除时达到峰值,并且控制细胞内 H2O2 产生的最主要的基因Respiratory burst oxidase homolog protein E(NADP Hoxi-E)以及促进H2O2产生的超氧化物歧化酶(SOD)活性以及其编码基因Superoxide dismutase[Cu-Zn](SOD[Cu-Zn])也在此时达到峰值。过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)具有清除H2O2的作用,二者的活性分别在H2O2含量到达峰值之前和到达峰值之时受到抑制,但是二者的编码基因Probablephospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase 和 Catlase l-like 的表达量一直维持在较高水平。其他相关基因在200 μM GA4处理花芽中的表达也都明显与其他处理及对照不同,且具有规律性,这些基因包括:DELLA蛋白基因GAI及赤霉素受体蛋白基因GID1B-like,Ca/calmodulin-dependent protein kinases related kinase 5(CDPK-5),Mitogen-activated protein kinase 9(MAPK-9)以及Calreticulin-3-like(CRT-3-like)。基于对 H2O2可能在休眠解除期间作为信号物质的认识,推测GA4打破果梅花芽休眠可能通过相关基因控制抗氧化酶类活性,调控H2O2含量的变化,并引起H2O2上下游多种信号相关基因表达水平的变化,最终对休眠解除起作用。2.以二年生高需冷量果梅品种'丰后'嫁接苗及低需冷量品种'桃形梅'嫁接苗为试材,采用0～7.2℃模型记录低温积累时数,于果梅需冷量进程不同时期对树体进行GA4处理,研究GA4处理人工气候室内果梅嫁接苗叶芽萌芽率和H2O2及抗氧化相关酶类活性的影响。结果显示,GA4处理的果梅叶芽萌芽率明显高于对照;250μMGA4解除'桃形梅,叶芽休眠的最佳处理时期为低温累计达到其需冷量的三分之一左右;300μM GA4解除'丰后'叶芽休眠的最佳处理时期为低温累计达到其需冷量的二分之一左右。研究发现GA4和对照处理后,两个品种叶芽中的抗氧化酶类活性都有不同幅度上升,但是GA4处理后抗氧化酶活性显著高于对照。且低需冷量果梅品种'桃形梅'相比高需冷量的果梅品种'丰后',具有更高的CAT活性和POD活性,而两个品种的SOD活性大小并没有显著的差异,推测CAT和POD这两种抗氧化酶在果梅休眠解除过程中起到更重要作用。根据叶芽内H2O2含量和抗氧化酶类活性变化,推测GA4打破果梅叶芽休眠可能与花芽休眠解除类似,都是通过抗氧化酶系统调控H2O2含量的变化来对休眠解除起作用。3.构建了pmrgl 基因过表达载体,并以杨树组培苗为试验材料,通过农杆菌介导的方法,将过表达载体转化到杨树中。本研究使用的pYH4215载体具有对潮霉素的抗性,因此转基因苗可以在含有潮霉素的培养基上存活。为进一步确定抗潮霉素杨树植株确实为转基因植株,除对杨树叶片进行GUS染色外,还提取了转基因杨树叶片的基因组DNA

关键词：果梅休眠花芽叶芽 GA4 H2O2 qRT-PCR pmrgl2

梅PmFRL3基因克隆及其与RGL2和ABI5蛋白互作分析

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梅PmFRL3基因克隆及其与RGL2和ABI5蛋白互作分析

作者：李涵韬南京农业大学

学位级别：硕士

梅（Prunus mume *** Zucc.）,蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus L.）植物,原产于我国横断山脉区域,既是一种观赏植物也是一种重要的经济型果树。梅果实被人们当做休闲食品和佐味食品,因其营养价值较高,也被誉为健康食品。梅是落叶果树... 详细信息

梅（Prunus mume *** Zucc.）,蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus L.）植物,原产于我国横断山脉区域,既是一种观赏植物也是一种重要的经济型果树。梅果实被人们当做休闲食品和佐味食品,因其营养价值较高,也被誉为健康食品。梅是落叶果树中开花萌芽较早的果树,其需冷量范围广,是研究木本果树季节性休眠机制的良好材料。为了研究Frigida-like家族在梅休眠解除及花期调控的作用,本文通过NCBI数据库中的梅基因组数据,对Frigida-like基因家族成员进行鉴定分析;以梅早花品种‘桃形梅’和晚花品种‘丰后’的花芽为试验材料,克隆了PmFRL3基因和亚细胞定位,并采用生物信息学手段分析其序列结构和功能;进一步通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验,明确PmFRL3和pmrgl2、PmABI5蛋白之间是否存在互作;采用q RT-PCR技术分析不同休眠时期的PmFRL3、pmrgl2及PmABI5的表达水平,同时分析外源激素GA和ABA处理对其表达的影响。主要结果如下:1.全基因组分析发现,梅基因组中含有12个Frigida-like蛋白基因家族成员,这些基因在五条染色体上分布不均。对4种蔷薇科植物和拟南芥的Frigida-like蛋白的系统发育分析表明,它们可分为5个亚家族（I-V）,且在蔷薇科植物中缺失I亚家族（FRI）。基因复制分析表明,PmFRL家族中存在三个串联复制事件和一个片段复制事件。RT-q PCR和RNA-seq结果表明PmFRL基因可能参与了梅休眠的调控。2.从梅品种‘桃形梅’和‘丰后’花芽中克隆了FRL3基因,其完整开放阅读框为3159 bp,编码1052个氨基酸。序列比对后发现,虽然两个品种中的FRL3基因的编码区存在部分碱基差异,但它们编码蛋白的氨基酸序列完全一致。利用生物信息学进一步分析PmFRL3蛋白的基本理化性质发现:PmFRL3蛋白主要由α-螺旋,延伸链,β-折叠和无规卷曲组成,是不稳定的亲水性蛋白,不具跨膜结构;SNP多态性分析表明,PmFRL3基因附近存在61个SNPs,其中一个SNP位点与开花时间相关;亚细胞定位结果表明PmFRL3蛋白定位于细胞核中。3.构建了PmFRL3、pmrgl2和PmABI5基因的酵母双杂载体。对酵母双杂交重组质粒进行毒性检测和自激活检测。结果表明,重组质粒对酵母菌株没有毒性作用且自身没有转录激活活性。将猎物表达载体和诱饵表达载体共转化Y2H Gold酵母菌株,进行酵母双杂交试验。结果表明PmFRL3蛋白可以和pmrgl2及PmABI5蛋白相互作用,且pmrgl2和PmABI5之间不存在相互作用。通过双分子荧光互补试验对其蛋白互作关系进一步验证,与酵母双杂试验结果一致。利用q RT-PCR技术分析PmFRL3、pmrgl2和PmABI5在不同休眠时期的表达水平结果表明:PmFRL3、pmrgl2和PmABI5三者的表达趋势相同。进入自然休眠初期表达量升高;而进入生态休眠时,三者基因表达量达到峰值,进入休眠解除时期后,表达量又开始降低。此外,这些基因在‘桃形梅’中的表达量均低于‘丰后’。外源激素GA处理后,pmrgl2表达量下调,PmABI5表达量上调;外源激素ABA处理后,PmFRL3表达量下调,pmrgl2表达量上调。

关键词：梅 PmFRL3 pmrgl2 PmABI5 蛋白互作

梅PmSLY1基因的克隆、表达分析及其与DELLA蛋白的互作研究

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梅PmSLY1基因的克隆、表达分析及其与DELLA蛋白的互作研究

作者：吕林南京农业大学

学位级别：硕士

梅(Prunus mume *** Zucc.)属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus L.),起源于我国东南部,是重要的一种经济型果树。其花观赏价值较高,果实则含有多种利于人体代谢的氨基酸,其果实主要用于加工。果梅相比于其它落叶果树,开花萌芽比较早,由于其... 详细信息

梅(Prunus mume *** Zucc.)属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus L.),起源于我国东南部,是重要的一种经济型果树。其花观赏价值较高,果实则含有多种利于人体代谢的氨基酸,其果实主要用于加工。果梅相比于其它落叶果树,开花萌芽比较早,由于其需冷量范围较大,因此是研究木本果树季节性休眠机制的一种好材料。DELLA蛋白在GA信号转导途径中是抑制因子,能够抑制植物的生长发育。为了研究F-box蛋白的编码基因SLY1在果梅季节性休眠中对DELLA蛋白的作用,本文以国家果梅种植资源圃中的果梅品种‘桃形梅’为试验材料,克隆得到了PmSLY1基因,并且利用生物信息学对其序列结构和功能做进一步的分析;对转pmrgl2基因杨树进行休眠处理,观察其表型;利用qRT-PCR技术分析pmrgl2基因及与GA4信号转导相关的部分基因在转基因杨树中的表达水平;同时分析PmSL Y1基因在果梅不同休眠时期的表达量。进一步构建了酵母双杂表达载体,利用酵母双杂交系统验证PmSLY1和pmrgl2蛋白之间是否存在互作。主要结果如下:1.根据NCBI比对已知梅基因组序列mRNA,从果梅品种‘桃形梅’花芽中克隆了SLY1基因,其完整编码区序列为1866bp,编码621个氨基酸。经NCBI比对发现,该序列具有Sec1域,我们将该基因命名为PmSLY1。利用生物信息学技术分析PmSLY1蛋白的基本理化性质。结果发现:PmSLY1蛋白主要由α-螺旋、延伸链、与无规卷曲构成,是疏水性蛋白质,且不具跨膜结构;同源序列比较表明,PmSLY1与桃(Prunus Persica)的SEC1家族转运蛋白SLY1具有很高的同源性。2.以转pmrgl2基因杨树为试材,提取转基因组培苗叶片中的RNA,并对pmrgl2和GA信号通道相关基因GID1b、GA20ox2和GA3ox1进行qRT-PCR分析,结果表明,与野生型杨树相比,转基因株系中的pmrgl2、GID1b、GA20ox2和GA3ox1的表达量都较高,即GA信号通道相关基因表达量跟随RGL2基因变化而变化。我们进一步采用低温处理使转基因杨树提前进入休眠,观察其表型结果发现,转基因杨树株高均低于对照,且在同一时期,转基因杨树叶子较对照绿,叶子衰老较慢。上述结果可以推测是由于pmrgl2基因过表达,使转基因杨树休眠延迟。3.以‘桃形梅’花芽为试材,运用qRT-PCR分析了 PmSLY1基因在不同休眠时期的表达水平。试验结果表明:花芽进入内休眠时期时,PmSLY1基因表达量开始下降;而在生态休眠时期,该基因表达量开始升高,当达到一定水平时,即开始进入休眠解除时,表达量又开始降低,整个休眠期PmSLY1基因表达量趋势表现为“降-升-降”。可初步预测在赤霉素信号通道中SLY1基因与DELLA的降解有关。4.成功构建了酵母双杂交表达载体猎物载体pGADT7-PmSLY1和诱饵载体pGBKT7-pmrgl2。对酵母双杂交重组质粒进行毒性检测,结果表明,重组诱饵质粒pGBKT7-pmrgl2和重组猎物质粒pGADT7-PmSLY1分别转入Y2H Gold、Y187酵母菌株后,在缺陷培养基上长出的单菌落长势良好,其密度和大小与空载体相比没有明显差异,表明重组质粒对酵母菌株没有毒性作用。自激活检测结果表明,猎物蛋白PmSLY1和诱饵蛋白pmrgl2都不能够在QDO(SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His)缺陷培养基上生长,即它们自身没有转录激活活性。将重组质粒pGADT7-PmSLY1、pGBKT7-pmrgl2共转化进Y2H Gold酵母菌株进行酵母双杂交实验。结果表明,PmSLY1与pmrgl2蛋白之间存在互作。

关键词：果梅休眠 PmSLY1 pmrgl2 qRT-PCR 酵母双杂