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森林与环境学报 2018年第1期38卷 13-19页

作者：李慧敏谢婉凤冯丽贞陈慧洁刘宏毅叶小真福建农林大学林学院福建福州350002 福建农林大学金山学院福建福州350002

Avr9/Cf-9 rapidly elicited(ACRE)gene是富含亮氨酸重复单元,参与蛋白与蛋白互作,特异性识别病原物激发子的关键基因,在植物抗病过程中有重要意义。利用RT-PCR从马尾松中克隆出Avr9/Cf-9 rapidly elicited gene,命名为pmacre(Gen Bank... 详细信息

Avr9/Cf-9 rapidly elicited(ACRE)gene是富含亮氨酸重复单元,参与蛋白与蛋白互作,特异性识别病原物激发子的关键基因,在植物抗病过程中有重要意义。利用RT-PCR从马尾松中克隆出Avr9/Cf-9 rapidly elicited gene,命名为pmacre(Gen Bank登录号:MF630966)。测序结果显示,pmacre c DNA序列全长862 bp,其中完整编码区长度624 bp,编码207个氨基酸;以PFGFP Bar 137质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动pmacre基因的植物表达载体PFGFP Bar 137-pmacre;采用冻融法转入农杆菌AGL1菌株,通过花序浸染法对拟南芥进行了遗传转化,并获得了4株阳性苗,经目的基因ACRE和GFP基因双重PCR检测,证实目的基因已整合到拟南芥基因组中。研究结果为进一步分析马尾松ACRE基因的功能和深入揭示R基因调控马尾松响应松材线虫侵染的作用机制奠定基础。

关键词：马尾松 pmacre 基因克隆载体构建遗传转化

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马尾松抗病相关基因pmacre的克隆与功能验证

马尾松抗病相关基因PmACRE的克隆与功能验证

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作者：李慧敏福建农林大学

学位级别：硕士

为抵御病原菌的侵害,植物在生长发育过程中形成了一系列复杂的抗病机制。Avr9/Cf-9诱导快速反应蛋白基因(Avr9/Cf9 rapidly elicited gene,ACRE)是介导抗病防御反应的关键基因,该基因富含亮氨酸重复单元(LRR)、参与蛋白与蛋白互作、特... 详细信息

为抵御病原菌的侵害,植物在生长发育过程中形成了一系列复杂的抗病机制。Avr9/Cf-9诱导快速反应蛋白基因(Avr9/Cf9 rapidly elicited gene,ACRE)是介导抗病防御反应的关键基因,该基因富含亮氨酸重复单元(LRR)、参与蛋白与蛋白互作、特异性识别病原物激发子,在植物抗病过程中扮演重要角色。马尾松(Pinus massoniana Lamb.)是我国南方重要的经济、用材多用途树种,然而面临松树世界毁灭性病害——松材线虫病(Pine wilt disease,PWD)的危害,就目前而言,任何单一的防治措施似乎都难以奏效,筛选松树的抗线虫病基因并利用转基因技术分析研究其功能,从而培育抗性松树可能是最为经济有效的解决途径。课题组前期利用高通量RNA-Seq技术筛选到马尾松中响应松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)侵染的抗病基因。鉴于此,本文通过克隆马尾松抗病基因ACRE对其进行遗传转化,并对比松材线虫侵染下转基因与野生型拟南芥抗病相关基因的差异表达以及引起的生理活性变化,研究结果如下:1.以马尾松茎干为试材,提取总RNA,并反转录为cDNA作模板,以ACRE基因的保守区域设计cDNA全长引物,通过RT-PCR技术扩增出pmacre基因的cDNA片段,并将产物克隆至pEASY-Blunt载体,转化大肠杆菌Trans-T1菌株。经双向DNA测序及Blast分析获得全长cDNA克隆862bp,结果提交至GeneBank(登录号:MF630966)。其中完整编码区长度624bp,编码207个氨基酸。2.以PFGFPBar 137质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动pmacre基因的植物表达载体PFGFP Bar 137-pmacre;采用冻融法转入农杆菌AGL1菌株,通过花序浸染法对拟南芥进行了遗传转化。通过Basta抗性进行初步筛选,获得转pmacre基因拟南芥植株4株。通过提取转基因拟南芥的基因组DNA,分别对ACRE基因和GFP基因进行PCR检测,证明pmacre已成功转入拟南芥,所获植株是转基因拟南芥,分别命名为A-1、A-2、A-3、A-4。3.将得到的4个转基因拟南芥株系种植至T3代,通过转基因株系与野生型拟南芥表型差异观察,转基因拟南芥较野生型均表现为出苗早、主根长,但转基因拟南芥较野生型拟南芥则株型、长势、开花结实等方面均无明显差异,表明拟南芥中过量表达pmacre基因在正常生长情况下,除了出苗早、主根长有区别外,不会引起其它表型差异。进一步对拟南芥4个株系中的pmacre基因进行qPCR检测,发现A-1转基因拟南芥中pmacre基因相对表达量最高。4.用松材线虫分别接种A-1转基因型和野生型拟南芥,受侵染后的拟南芥均可正常生长,未出现明显病斑,但转基因植株生长状态更好。利用qPCR检测松材线虫诱导12h、24h、36h、48h、72h后抗病相关基因PAL、EDS1、NPR1、PR1、PR4、PR5的表达情况,结果表明pmacre基因的过表达诱导了所测抗病相关基因的表达,推测pmacre基因通过参与调控SA、JA/ET、苯丙烷代谢途径提高植物对松材线虫的抗性。5.通过对松材线虫侵染下的野生型和转基因拟南芥叶片SOD、CAT、POD中防御酶活力的测定与分析,表明转pmacre基因拟南芥较野生型拟南芥酶活性更高,可有效抵御松材线虫的侵染。综上所述,pmacre基因的过表达提高了拟南芥转基因株系抗松材线虫的能力,理论上为进一步开展其抗松材线虫病分子机制的剖析和在抗病育种中的应用研究奠定了基础。

关键词：马尾松 pmacre 植物表达载体构建抗病基因功能验证

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