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plin5在小鼠非酒精性脂肪性肝病发生过程中表达的变化及蓝莓花青素干预的影响

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Plin5在小鼠非酒精性脂肪性肝病发生过程中表达的变化及蓝莓花青...

作者：李晨驰贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:观察小鼠非酒精性脂肪性肝病发生过程中脂滴包被蛋白5(Perilipin5,plin5)表达的变化及蓝莓花青素干预后对其表达的影响,探讨plin5蛋白在蓝莓花青素干预非酒精性脂肪性肝病发生过程中可能的作用。方法:1、体外实验:培养AML12小鼠肝... 详细信息

目的:观察小鼠非酒精性脂肪性肝病发生过程中脂滴包被蛋白5(Perilipin5,plin5)表达的变化及蓝莓花青素干预后对其表达的影响,探讨plin5蛋白在蓝莓花青素干预非酒精性脂肪性肝病发生过程中可能的作用。方法:1、体外实验:培养AML12小鼠肝细胞,取对数生长期细胞分为对照组、油酸诱导组、维生素C组、蓝莓花青素组,每组设置3个复孔。对照组给予DMEM/F12培养基培养;油酸诱导组、维生素C组、蓝莓花青素组,给予含0.75mmol/L油酸的DMEM/F12培养基,培养24h,以复制小鼠非酒精性脂肪性肝病细胞模型。模型复制成功后,采用具有抗氧化活性的水溶性维生素C作为阳性对照药物;维生素C组、蓝莓花青素组分别更换含50μg/m L维生素C及50μg/m L蓝莓花青素的DMEM/F12培养基,对照组、油酸诱导组更换DMEM/F12培养基,各组均培养24h。实验结束后,采用微板法测定细胞培养上清液中ALT、AST水平以及细胞内TG含量;WST-1法检测细胞内SOD含量;TBA法检测细胞内MDA含量;油红O染色观察细胞内脂质沉积情况;Western Blot检测细胞中plin5、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白的相对表达情况;q-PCR检测细胞中plin5 m RNA的相对表达情况。2、体内实验:将8周龄、体重25-30g、雄性ICR小鼠适应性饲养1周后随机分为对照组、非酒精性脂肪性肝病组、维生素C组、蓝莓花青素组,每组6只;对照组小鼠使用基础饲料喂养;非酒精性脂肪性肝病组、维生素C组、蓝莓花青素组小鼠使用高脂饲料喂养并腹腔注射5%CCl,剂量2μL/g,2次/周,共10周,以复制小鼠非酒精性脂肪性肝病动物模型。模型复制成功后,维生素C组、蓝莓花青素组小鼠分别给予50μg/m L维生素C溶液及50μg/m L蓝莓花青素溶液,剂量10μL/g,隔天灌胃,共8周;对照组、非酒精性脂肪性肝病组小鼠给予等量生理盐水灌胃;灌胃期间同时对非酒精性脂肪性肝病组、维生素C组、蓝莓花青素组各组小鼠腹腔注射5%CCl,剂量1μL/g,1次/周,以维持造模效果。实验结束后,各组小鼠乙醚麻醉,眼球取血,剪开腹腔后取肝右叶部分肝组织行石蜡切片及冰冻切片,其余肝组织-80℃冻存。采用微板法检测小鼠血清ALT、AST水平及肝组织TG含量;WST-1法检测肝组织内SOD含量,TBA法检测肝组织内MDA含量;病理切片行HE染色及油红O染色,观察肝脏组织形态学变化及脂质沉积情况;Western Blot检测肝组织中plin5、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白的相对表达情况;q-PCR检测肝组织中plin5 m RNA的相对表达情况。结果:1、体外实验:与对照组相比,油酸诱导组的细胞培养上清液中ALT、AST水平、细胞内TG、MDA含量均升高(P5)、细胞内SOD含量降低(P5),染色结果显示细胞内脂滴数量增加(P5),细胞内plin5、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白相对表达量以及plin5 m RNA相对表达量均升高(P5)。与油酸诱导组相比,维生素C组、蓝莓花青素组的细胞培养上清液中ALT、AST水平、细胞内TG、MDA含量均降低(P5),但未降至对照组水平,细胞内SOD含量升高(P5),染色结果显示细胞内脂滴数量减少(P5),细胞内plin5、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白相对表达量以及plin5 m RNA相对表达量均降低(P5)。与维生素C组相比,蓝莓花青素组的细胞培养上清液中ALT水平、细胞内TG、MDA含量均降低(P5),细胞内SOD含量升高(P5),染色结果显示细胞内脂滴数量进一步减少(P5)、细胞内plin5、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白相对表达量以及plin5 m RNA相对表达量均降低(P5)。2、体内实验:与对照组相比,非酒精性脂肪性肝病组的小鼠血清ALT、AST水平、肝组织中TG、MDA含量均升高(P5)、肝组织中SOD含量降低(P5),病理结果显示肝组织出现明显空泡变性及脂质沉积,肝组织中plin5、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白相对表达量以及plin5 m RNA相对表达量均升高(P5)。与非酒精性脂肪性肝病组相比,维生素C组、蓝莓花青素组的小鼠血清ALT、AST水平、肝组织中TG、MDA含量均降低(P5),但未降至对照组水平,肝组织中SOD含量升高(P5),病理结果显示肝组织空泡变性及脂质沉积得到改善,肝组织中plin5、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白相对表达量以及plin5 m RNA相对表达量均降低(P5)。与维生素C组相比,蓝莓花青素组的小鼠血清ALT、AST水平、肝组织中T

关键词：非酒精性脂肪性肝病蓝莓花青素抗氧化 plin5 PI3K/Akt

plin5通过p-AKT/p70S6K信号通路对肺癌细胞增殖的抑制作用

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滨州医学院学报 2023年第3期46卷 161-165,175页

作者：黄荣坤马颖郭若雨杨淑芯胡金霞孔丽君滨州医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室山东烟台264003

目的检测plin5在肺癌中的表达情况及作用,探讨其与p-AKT/p70S6K信号通路的关系。方法通过检索数据库资料结合免疫组化染色,分别在mRNA和蛋白水平分析plin5在肺癌及癌旁正常组织中的表达差异。慢病毒感染过表达plin5和用siRNA敲低plin5... 详细信息

目的检测plin5在肺癌中的表达情况及作用,探讨其与p-AKT/p70S6K信号通路的关系。方法通过检索数据库资料结合免疫组化染色,分别在mRNA和蛋白水平分析plin5在肺癌及癌旁正常组织中的表达差异。慢病毒感染过表达plin5和用siRNA敲低plin5在肺癌细胞系A549和NCI-H1299中表达后,CCK-8活力检测细胞增殖能力变化;比色法检测细胞ATP含量变化;流式细胞术检测活性氧含量变化;Western blot检测p-AKT/p70S6K信号通路相关蛋白变化。结果公共数据库资料和免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,在肺癌组织中plin5表达下调。过表达plin5后细胞增殖受到抑制,敲低plin5后细胞增殖能力上升。ATP含量检测显示plin5降低细胞内ATP含量水平。活性氧含量检测显示plin5上调细胞内活性氧含量水平。plin5降低p-AKT(Ser473),p-AKT(Thr308),p70S6K蛋白水平表达。结论plin5通过p-AKT/p70S6K信号通路在肺癌生长增殖中起抑制作用。

关键词： plin5 肺癌 p-AKT/p70S6K信号通路增殖

FXR通过调控脂滴蛋白plin5延缓纤维化的调控机制

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海南医学院学报 2023年第12期29卷 890-898页

作者：黄晓霞郑志民庞碧滢黄娜娜李馨熊文婷孔波刘吉升广州大学生命科学学院广东广州510006

目的:本研究旨在揭示法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)通过调控脂滴包被蛋白5(perilipin 5, plin5)从而延缓肝纤维化的调控机制。方法:利用生物信息学预测plin5基因上游的FXR反应元件(FXR response element, FXRE),构建双荧光素... 详细信息

目的:本研究旨在揭示法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)通过调控脂滴包被蛋白5(perilipin 5, plin5)从而延缓肝纤维化的调控机制。方法:利用生物信息学预测plin5基因上游的FXR反应元件(FXR response element, FXRE),构建双荧光素酶报告基因体系以检测所预测位点与FXR的结合效应;使用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)诱导人肝星状细胞LX-2构建肝纤维化模型;过表达FXR或plin5后,qPCR和Western blot检测plin5、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和I型胶原蛋白(collagenⅠ)mRNA水平和蛋白水平;油红O染色检测脂滴的生成,定量检测甘油三酯(triglyceride,TG)的含量。结果:确定了plin5基因启动子区域含有已知的反向重复序列-1(inverted repeats-1,IR-1);FXR激活后能够上调LX-2中plin5的基因表达(Pplin5能够促进脂滴的形成,TG含量的增加,并显著降低TGF-β1诱导的纤维化基因的表达(P5);FXR激活后没有显示出抑制LX-2活化的作用。结论:plin5基因上游存在已知的FXRE位点能与FXR结合,plin5过表达能促进脂滴的形成和抑制LX-2细胞的活化,FXR可能是通过调控plin5的表达部分抑制肝纤维化。

关键词： FXR plin5 脂滴肝星状细胞肝纤维化

plin5基因失活参与卵巢癌发生发展的机制研究及临床意义

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PLIN5基因失活参与卵巢癌发生发展的机制研究及临床意义

作者：赵玉洁南通大学

学位级别：硕士

目的探究plin5基因在卵巢癌中的生物学功能,探索plin5基因调控卵巢癌细胞增殖,迁移及侵袭等生物学功能的分子机制;并检测卵巢癌细胞株和临床卵巢癌标本及对应的癌旁组织中plin5基因启动子区的甲基化状态及其参与plin5基因表达的表观遗... 详细信息

目的探究plin5基因在卵巢癌中的生物学功能,探索plin5基因调控卵巢癌细胞增殖,迁移及侵袭等生物学功能的分子机制;并检测卵巢癌细胞株和临床卵巢癌标本及对应的癌旁组织中plin5基因启动子区的甲基化状态及其参与plin5基因表达的表观遗传调控机制。方法从癌症基因组图谱(TCGA)和基因型组织表达(GTEx)数据库下载RNA测序数据(RNA-seq)。筛鉴出差异表达基因(DEGs),然后通过富集分析等方法选择plin5基因进行进一步研究。通过q PCR,蛋白质印迹,免疫组化和甲基化特异性PCR(MSP)分析确定plin5的表达和启动子区甲基化水平。此外,对细胞增殖、迁移、侵袭能力以及对细胞凋亡的影响,我们采用集落形成,Transwell和流式细胞凋亡试验进行研究。最后,通过体内实验确定plin5对肿瘤生长调控作用。结果我们发现通过使用q PCR,蛋白质印迹和免疫组化分析,与对应的癌旁组织相比,plin5在卵巢癌组织中显著下调,MSP显示卵巢癌组织中plin5基因启动子区甲基化程度显著增加。用5-Aza-d C处理后可以增加plin5的表达。此外,我们发现去甲基化的plin5可以显著抑制细胞增殖,迁移和卵巢癌侵袭能力,并促进细胞凋亡。此外,异种移植实验表明plin5过表达可以显著抑制肿瘤的生长。结论plin5基因的表达水平受DNA甲基化调节,在卵巢癌中,plin5可以作为潜在的肿瘤抑制因子。

关键词：卵巢癌 plin5 甲基化 5-Aza-dC

plin5通过增加BNIP3表达调控白色脂肪棕色化

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PLIN5通过增加BNIP3表达调控白色脂肪棕色化

作者：王天宇中国医科大学

学位级别：硕士

目的:肥胖所导致的相关疾病（包括NAFLD,糖尿病等）对人类生命健康的威胁日益增大,已经引起了全世界的广泛关注。这些代谢综合征通常都会伴随有脂肪代谢紊乱和各个器官的细胞内脂质异常蓄积。PAT蛋白家族是目前研究较多的脂滴蛋白,plin... 详细信息

目的:肥胖所导致的相关疾病（包括NAFLD,糖尿病等）对人类生命健康的威胁日益增大,已经引起了全世界的广泛关注。这些代谢综合征通常都会伴随有脂肪代谢紊乱和各个器官的细胞内脂质异常蓄积。PAT蛋白家族是目前研究较多的脂滴蛋白,plin5是这个家族中的新成员,在代谢旺盛的组织中（如骨骼肌,肝脏,棕色脂肪等）高表达。有研究表明,冷刺激处理小鼠皮下白色脂肪组织后,其plin5的表达明显增高。糖耐量异常（IGT）患者服用吡格列酮（可诱导白色脂肪棕色化）10周后,皮下脂肪组织plin5 m RNA水平显著高于服药前。因此我们推测plin5可能在米色脂肪形成中起重要的调节作用。本研究拟分析plin5是否参与白色脂肪棕色化,并初步探讨其分子机制。研究方法:第一部分:探究plin5对白色脂肪棕色化的影响。给C57BL/6小鼠腹腔注射CL316243（10天）诱导棕色化,检测皮下白色脂肪组织中plin5和UCP1的表达;购买15只db/db小鼠和5只wt（BKS）小鼠。将其中10只db/db鼠随机均分为两组,分别通过尾静脉注射plin5过表达慢病毒与阴性对照慢病毒。测各组小鼠空腹血糖,处死后留存小鼠各组血清测量胰岛素含量。取尾静脉注射的两组小鼠的皮下白色脂肪组织进行Real-Time PCR和Western Blot实验,检测plin5和UCP1的表达。第二部分:使用plin5过表达慢病毒及阴性对照病毒转染后的C3H10T1/2细胞进行RNA seq高通量测序,对结果进行分析后发现了6个上调和4个下调的线粒体相关基因。对这些基因进行Real Time-PCR验证后,发现BNIP3 mRNA及蛋白显著升高,并在组织水平进行验证;将C3H10T1/2细胞转染plin5过表达质粒和BNIP31000bp启动子质粒,通过双荧光素酶报告基因检测明确plin5对BNIP3启动子的调控作用。结果:1.经CL316243诱导白色脂肪棕色化以后,小鼠皮下白色脂肪中plin5和UCP1的mRNA表达均明显增加（P＜0.05）。2.经尾静脉注射plin5过表达慢病毒的小鼠,其血清胰岛素浓度和空腹血糖均较对照组降低（P＜0.05）。3.经尾静脉注射plin5过表达慢病毒的小鼠皮下白色脂肪组织中,plin5和UCP1的mRNA表达明显增加,进一步进行Western Blot实验后,发现plin5和UCP1的蛋白表达也增高（P＜0.05）。4.根据RNA seq高通量测序结果及后续验证显示,在转染了plin5过表达慢病毒的C3H10T1/2细胞中,BNIP3 mRNA和蛋白的表达增加（P＜0.05）。5.经尾静脉注射plin5过表达慢病毒的小鼠皮下白色脂肪组织中,BNIP3的mRNA表达明显增加（P＜0.05）。6.双荧光素酶报告提示,plin5过表达组的荧光素酶活性较对照组升高2倍（P＜0.01）。结论:1.plin5促进了白色脂肪棕色化。2.plin5通过调控BNIP3表达促进白色脂肪棕色化。

关键词： plin5 BNIP3 白色脂肪棕色化

plin5在小鼠压力负荷性心力衰竭发生过程中的作用及初步机制研究

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Plin5在小鼠压力负荷性心力衰竭发生过程中的作用及初步机制研究

作者：武杰第四军医大学

学位级别：硕士

心力衰竭(Heart failure,HF)是由各种疾病引发的心肌收缩功能减弱,使心脏泵出的血液量减少,无法搏出静脉回流和身体组织代谢需要的血液供应,以及由此产生的一系列症状和体征,是各种心血管疾病的共同结局。压力负荷过重是导致心力衰竭的... 详细信息

心力衰竭(Heart failure,HF)是由各种疾病引发的心肌收缩功能减弱,使心脏泵出的血液量减少,无法搏出静脉回流和身体组织代谢需要的血液供应,以及由此产生的一系列症状和体征,是各种心血管疾病的共同结局。压力负荷过重是导致心力衰竭的重要原因。在正常的情况下,心脏的大部分能量来源于脂肪酸氧化,但是在心衰发生时,心肌细胞的能量代谢过程发生明显的变化,脂肪酸的代谢也出现明显异常。同时,心脏脂肪酸β氧化的改变能够导致心肌能量代谢异常,与心力衰竭的发生密切相关。目前,细胞内脂滴(Lipid droplets,LD)目前被认为是一个参与能量代谢的“细胞器”,能够储存脂质并在脂质代谢过程中起着非常重要的作用,与很多代谢性疾病的发生发展有关。脂滴中的脂滴表面蛋白是一类参与脂滴代谢调节的分子,其中,PAT家族最为重要,plin5是现阶段发现的第5个PAT家族的成员,主要表达于氧化代谢比较活跃的组织中,例如心脏、肝脏、骨骼肌和褐色脂肪组织(Brown Adipose Tissue,BAT)等,又被称为MLDP(Myocardial lipid droplet protein)、LSDP5(Lipid storage droplet protein5)、Perilipin 5,或OXPAT。plin5在心脏组织中表达水平最高,plin5缺失能够加快脂解作用以及脂肪酸氧化速度,从而造成心脏和肝脏的脂毒性损伤。本实验在plin5敲除小鼠模型的基础上,通过升主动脉缩窄术(Transverse aortic constriction,TAC),建立心衰的动物模型,来研究plin5在压力负荷性心衰发生过程中的作用及可能的分子机制,为心衰的治疗提供参考。1、plin5缺失加重TAC诱导的小鼠心肌肥大以及心脏功能的下降。8周龄的野生型和plin5敲除小鼠分别进行升主动脉缩窄术(TAC)。术后四周取各组小鼠心脏,计算小鼠心脏重量(Heart weight,HW)/小鼠整体重量(Body weight,BW)。同时,对小鼠心脏进行HE染色,采用Cell Sens Entry软件随机选择5个不同视野,计算心肌细胞横截面积。结果显示,TAC术后,plin5敲除小鼠HW/BW相比野生组明显升高,而且plin5敲除小鼠心肌细胞横截面积相比野生组明显增大。这些结果提示,plin5缺失加剧TAC诱导的小鼠心肌肥厚。TAC术后四周,应用超声仪及高频探头行经胸二维心脏超声检查(M模式)获得野生型和plin5敲除小鼠的心动图,分别测定左室收缩末期内径(Left ventricular systolic internal dimension,LVID;S),左室射血分数(Ejection fraction,EF),左心室短轴缩短率(Fraction shortening,FS)。结果显示,plin5缺失加剧TAC诱导的左心室收缩末期心室腔扩张程度,并导致心脏功能明显下降。2、plin5缺失降低心脏中脂滴储存降低,并增加了非酯化脂肪酸的水平。TAC术后四周,取各组心脏组织,行油红O染色,结果显示plin5缺失小鼠心肌中脂滴含量明显降低;心肌组织的甘油三酯(Triglyceride,TG)定量分析显示,plin5敲除小鼠导致心肌组织中TG含量明显下降,而游离脂肪酸(FFA)的水平却高于野生型小鼠,但野生型小鼠和plin5敲除小鼠血清中FFA未出现明显变化。TAC术后,小鼠心肌组织内脂滴数量和TG含量,以及心肌组织和血中游离脂肪酸(FFA)水平也出现类似的变化。这些结果表明,plin5缺失能够降低心肌组织内脂肪的储积,而增加游离脂肪酸水平。3、plin5缺失导致小鼠心肌组织中线粒体数量增多,并且加剧TAC术后的心肌过氧化损伤。取TAC术后四周小鼠心室组织,利用透射电镜观察心肌组织超微结构,结果发现,plin5缺失增加小鼠心肌细胞中的线粒体数量,而且TAC术后plin5缺失小鼠心肌细胞中线粒体数量也明显多于野生型小鼠,尽管TAC术造成心肌细胞线粒体数量的减少。Western Blot结果显示,线粒体中重要分子Cox IV以及Cytochrome C水平升高,且Real-time PCR也显示Cox IV以及Cytochrome C m RNA水平升高,表明线粒体数量增加,与电镜观察的结果一直。TAC术后,plin5敲除小鼠的心肌组织中Cox IV和Cytochrome C的蛋白和m RNA水平均出现降低,与野生型小鼠类似。以上结果说明,plin5缺失能够增加心肌组织中线粒体的数量。TAC术后4周,取各组小鼠心脏组织,检测各组小鼠心肌组织中的MDA,SOD以及ROS水平。研究结果发现,在假手术组中,plin5缺失小鼠心脏组织中MDA含量略高于野生小鼠,而TAC术后plin5缺失心肌组织中MDA水平明显升高;在假手术组,plin5缺失小鼠心肌内SOD的活性没有明显差异,而在TAC术后P

关键词： plin5 脂滴脂毒性损伤心力衰竭心肌肥厚脂肪酸β氧化 ROS

脂滴蛋白plin5在阿托伐他汀抑制肝脏脂质储积中的作用和机制研究

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脂滴蛋白Plin5在阿托伐他汀抑制肝脏脂质储积中的作用和机制研究

作者：曹开宇中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是除饮酒及其他明确的肝损伤因素外,以弥漫性脂肪变性(steatosis)和肝脏脂肪异常堆积为主要特征的肝脏疾病。NAFLD的出现与肝细胞发生的异常的脂质堆积关系密切。NAFLD在发达... 详细信息

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是除饮酒及其他明确的肝损伤因素外,以弥漫性脂肪变性(steatosis)和肝脏脂肪异常堆积为主要特征的肝脏疾病。NAFLD的出现与肝细胞发生的异常的脂质堆积关系密切。NAFLD在发达国家已影响了约1/3的人口,是导致慢性肝病的最常见原因。我国人民生活水平日益提高,NAFLD发生率也逐年升高,随着肝炎疫苗接种的普及和治疗水平的提高,NAFLD将成为肝硬化(cirrhosis)和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的首要病因。当肝细胞异常脂质蓄积超过其代偿能力时,过量的脂质连同其代谢产物对肝细胞产生一系列的损害和影响,被称为脂毒性(lipotoxic)损伤,主要包括氧化应激(oxidative stress)、炎症和内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)等。在这些因素的作用下,NAFLD由单纯脂肪变向非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纤维化(fibrosis)、肝硬化进展,甚至发生癌变。在哺乳动物细胞内,过量的脂质通常以中性脂质(neutral lipid)[包括胆固醇酯(cholesterol ester,CE)和甘油三酯(triglyceride,TG)]的形式存储于脂滴(lipid droplets,LDs)中。脂肪代谢在肝脏异常活跃,因此脂滴是肝细胞正常脂代谢的重要的“缓冲系统”,在脂质代谢稳态的维持中有着非同寻常的意义。然而,脂滴增大和过多是NAFLD的一个重要病理学标志,且肝细胞内脂滴的数量和大小与NAFLD进程密切相关。长久以来,脂滴通常被认为是一个单纯的细胞内中性脂肪的存储场所。近年来,愈来愈多的研究指出,脂滴是一个多功能的代谢活跃的细胞器(organelle),其不仅仅参与了脂质的储积,还参与了多种代谢过程,如能量供应、细胞膜的合成等。脂滴的多种功能受到其表面蛋白的调节,其中Perilipins是脂滴的重要标志分子。Perilipin 5(plin5)作为一个关键的脂滴蛋白(lipid droplet protein,LDP),不仅保持肝细胞内脂肪的相对稳定,还参与调节脂滴的代谢过程。在小鼠和人体内,plin5主要表达于脂质代谢旺盛的器官,如肝脏、心脏、骨骼肌和棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)等。前期实验中,我们利用plin5敲除小鼠发现,plin5缺失的肝脏表现出脂肪含量显著减少,提示plin5参与肝脏脂肪代谢的调节。进一步研究表明,plin5能够抑制脂滴中甘油三酯的脂解和/或降低脂肪酸氧化速度,并促使整体细胞内脂质积累,但具体调控机制和在疾病发生中的具体作用仍待深入探索。他汀类药物(statins)是临床上应用最普遍的最具有代表性的调脂药,能够抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase,HMGCR)活性,主要用于降低血中胆固醇含量,被普遍使用于高胆固醇血症、动脉粥样硬化(atherosclerosis)等血脂异常疾病的治疗。随着应用的普及,人们逐渐发现他汀类药物还具有多效性,能够发挥氧化应激、炎症反应、恢复内皮细胞等降脂以外的作用。近来,诸多研究提示,他汀类药物能够抑制肝脏炎症、纤维化,甚至对肝细胞肝癌也有着保护作用。最近有研究认为,阿托伐他汀能够抑制肝脏中plin5的表达,从而增加肝细胞脂解速度,但其作用机制仍有待进一步深入。目的:1.探讨阿托伐他汀对NAFLD患者肝脏脂质储积的影响。2.利用plin5基因敲除小鼠,明确脂滴蛋白plin5在阿托伐他汀治疗脂肪肝中的作用。3.通过探讨阿托伐他汀调控plin5磷酸化对肝脏脂肪代谢的影响,探讨其分子机制。方法:1.按照纳入标准和排除标准,我们搜集了我院就诊的口服阿托伐他汀钙治疗6个月的患者资料,根据其影像学和肝功能检查,确定其是否有脂肪肝及脂肪肝的严重程度。从中选取了101例患有不同程度NAFLD患者,按照体重指数分为正常体重组(18.5≤BMI53),分析了阿托伐他汀对两组患者脂肪肝的影响。2.利用高脂饲料(high-fat diet,HFD)喂养小鼠,使其肝脏脂质储积,并通过给予阿托伐他汀灌胃,确定阿托伐他汀对肝脏脂质含量和plin5表达水平的影响;进一步利用阿托伐他汀处理野生型和plin5缺失的小鼠和原代肝细胞,探讨阿托伐他汀对肝脏和肝细胞脂质含量的影响,确定plin5在阿托伐他汀抑制肝脏脂质储积中的具体作用。3.通过亚细胞分离脂滴和胞质部分,分析阿托伐他汀处理后plin5在脂滴和细胞质中含量变化。通过对脂滴水解和肝细胞脂肪酸氧化(fatty acid oxi

关键词：阿托伐他汀脂肪肝 plin5 脂滴蛋白激酶A

CMA降解plin5参与NAFLD脂解异常的研究

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CMA降解Plin5参与NAFLD脂解异常的研究

作者：马硕怡中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

【背景】非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)以肝脏内甘油三酯(Triglyceride,TG)含量增加为主,可以进展为肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。在美国非酒精性脂肪性肝炎是导致肝硬化的一个很重要的原因,其相关... 详细信息

【背景】非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)以肝脏内甘油三酯(Triglyceride,TG)含量增加为主,可以进展为肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。在美国非酒精性脂肪性肝炎是导致肝硬化的一个很重要的原因,其相关的肝硬化也已经成为目前肝移植的第二大指征。在我国NAFLD发病率逐年升高,且呈现出年轻化趋势。NAFLD患者主要表现出肝脏中TG、胆固醇等脂类以脂滴的形式大量堆积而导致的脂肪变性,同时伴或不伴有外周血中TG、胆固醇等升高。脂肪变性的主要原因是肝细胞脂肪酸的摄取和TG的合成增加,TG分解和脂肪酸输出、氧化减少。因此,以脂滴形式储存的TG、胆固醇等脂质的分解障碍在NAFLD疾病发生发展过程中扮演重要角色。传统的脂滴分解主要指脂酶的脂解作用。而近年来自噬在脂解中的作用已被越来越多的研究证实。2009年自噬与脂滴脂解之间的联系首次被证实,研究发现,无论是在体内还是体外试验中,抑制自噬能够增加细胞内TG和脂滴的含量,自噬功能的丧失能够减少TG的分解。自噬主要包括大自噬、分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)和小自噬。CMA的具体过程是:热休克蛋白hsc70识别具有“KEFRQ”样膜体的胞浆蛋白,将其带到溶酶体并交给其膜上的lamp2a分子,lamp2a再将该蛋白转运入溶酶体内,被腔内的酶降解。其中lamp2a是CMA的核心分子。研究发现在体内阻断CMA,肝脏出现脂肪变性,聚集在肝脏的脂质不能被动员到外周。而CMA的底物是蛋白,所以其在脂代谢中的作用主要是通过调控脂滴包被蛋白来实现的。脂滴表面镶嵌有多种蛋白即脂滴包被蛋白,perilipins(plins)蛋白是非常重要的脂滴包被蛋白之一。plins包括5个成员即plin1-5,这5个成员N端的100个氨基酸高度同源,它们的主要功能是调节细胞内脂质的储存和维持脂质稳态,但是又各有区别,且每个成员有着特定的组织分布、亚细胞定位和脂质结合性能。plin5是该家族中的第5个成员,主要分布在心肌、骨骼肌、棕色脂肪及肝脏等高度氧化的组织。虽然肝组织中表达的plins不止plin5,但是由于plin5多样化的功能,其在肝脏脂解中发挥主导作用。且发现plin5在脂肪酸代谢的调节中表现出一些矛盾的角色,既增加甘油三脂的储存,又增加了脂肪酸的氧化。同时,plin5还可能参与了脂肪酸向线粒体转运氧化,影响线粒体的生物合成和功能调节。在这些功能方面,plin5与其他plins表现出了显著的不同。CMA作为脂代谢中的关键环节,plin5在脂代谢中的作用是否受其调控,且这种调控异常是否参与了NAFLD脂解障碍,目前尚未见文献报道。【目的】1.明确CMA核心分子lamp2a及plin5在NAFLD病变中的表达情况;2.证实CMA在脂滴降解中的作用及对plin5表达的影响;3.阐明CMA降解plin5的分子机制。【方法】1.利用Western-blot、免疫组织化学等方法检测非酒精性脂肪性肝病患者及脂肪肝小鼠模型肝组织中lamp2a与plin5表达情况;2.以肝细胞系Hep G2细胞为背景,构建lamp2a敲除的细胞系即Hep G2-lamp2a(-)细胞系,检测lamp2a敲除对plin5表达及其细胞内脂滴分解的影响;3.通过利用溶酶体抑制剂、激动剂处理Hep G2细胞及Hep G2-lamp2a(-)细胞,进而利用Western-blot检测plin5表达情况;4.利用免疫共沉淀、免疫荧光染色等方法研究plin5是否通过CMA途径降解,从而影响脂质分解。【结果】1.Western-blot结果提示,NAFLD患者较正常人肝组织中lamp2a表达明显降低,plin5表达升高;免疫组化提示NAFLD患者lamp2a表达结果与Western-blot结果一致;q RT-PCR提示两组中lamp2a与plin5 m RNA均无差异。在脂肪肝小鼠模型中,Western-blot、免疫组化均提示肝组织中lamp2a表达明显降低、plin5表达明显升高;q RT-PCR提示plin5 m RNA水平无明显改变,lamp2a m RNA显著下降。2.利用CRISPR/Case9技术成功构建以Hep G2为背景的lamp2a敲除细胞系Hep G2-lamp2a(-),Western-blot结果提示常规培养的Hep G2-lamp2a(-)细胞中plin5轻度升高;当给予油酸刺激8h时Hep G2细胞、Hep G2-lamp2a(-)细胞中plin5均同步升高;当撤掉油酸,用含血清的常规培养基继续培养16h时,Hep G2细胞、Hep G2-lamp2a(-)细胞中plin5均进一步升高;当撤掉油酸,用不含血清的培养基继续培养16h时,Hep G2细胞中plin5出现了明显的降解,而Hep G2-lamp2a

关键词： Lamp2a plin5 分子伴侣自噬非酒精性脂肪性肝病脂质分解

PYC通过PI3K/PPARα调控HepG2细胞内plin5表达及脂质蓄积的机制研究

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PYC通过PI3K/PPARα调控HepG2细胞内Plin5表达及脂质蓄积的机制研...

作者：钟文霞中国医科大学

学位级别：硕士

目的:非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的肝损伤因素所致的以肝细胞内脂质过度蓄积为主要特征的临床病理综合征。其病理过程可从非酒精性脂肪肝进展到非酒精性脂肪肝炎甚至肝硬化、肝... 详细信息

目的:非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明确的肝损伤因素所致的以肝细胞内脂质过度蓄积为主要特征的临床病理综合征。其病理过程可从非酒精性脂肪肝进展到非酒精性脂肪肝炎甚至肝硬化、肝癌。脂肪储存小滴蛋白5(Perilipin5,plin5)是PAT(Perilipin1、ADRP、Tip47)家族的新成员,主要表达于氧化代谢高的心脏、肝脏、骨骼肌及棕色脂肪组织中,其与细胞内脂质蓄积有着密切的联系。NAFLD患者肝脏及肥胖小鼠肝脏中plin5表达显著增高,小鼠过表达plin5可促进肝脏内甘油三酯蓄积,提示plin5参与NAFLD的形成。然而,目前关于plin5在参与脂质蓄积过程中的调控机制并不十分明确。碧萝芷(Pycnogenol,PYC)是法国沿海松树皮提取物,具有强大的抗炎、抗氧化作用。本课题组前期研究发现,在小鼠巨噬细胞中PYC可以抑制脂多糖(LPS)诱导的脂肪储存小滴蛋白2(plin2)表达,在ApoE敲除鼠中PYC可以改善动脉粥样硬化、减轻肝脏脂质蓄积、促进白色脂肪棕色化。但是关于PYC对plin5在NAFLD中的调控作用并没有研究报道。因此,本研究拟通过观察NAFLD模型中OA对plin5的调控,并探讨PYC调控plin5表达的潜在机制。研究方法:培养HepG2细胞,给予不同浓度的十八烯酸(油酸,Oleic acid,OA)处理不同的时间,通过RT-PCR及western blot检测plin5及过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR?)的表达;分别给予PPAR?抑制剂GW6471、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR?)抑制剂GSK0660、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR?)抑制剂GW9662、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases,p38MAPK)抑制剂SB203580处理后,通过RT-PCR及western blot检测plin5的表达;给予磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PI3K)抑制剂LY294002处理后,通过RT-PCR及western blot检测plin5及PPAR?的表达;油红O染色及定量进行评估细胞内甘油三酯的蓄积情况;给予不同剂量PYC处理后,GPO-POD酶法测定细胞内甘油三酯含量;通过RT-PCR及western blot检测plin5及PPAR?的表达。结果:1.OA呈浓度及时间依赖性的诱导HepG2细胞中plin5表达。给予不同浓度的OA(solvent control、200μM、400μM)及不同的时间(0h、12h、24h)处理后发现plin5 mRNA和蛋白表达呈浓度及时间依赖性增加。2.PPAR?介导了HepG2细胞中OA诱导的plin5表达。分别给予上述PPARs家族抑制剂处理后,只有GW6471能显著降低plin5 mRNA表达(Pplin5蛋白表达也明显降低(Pplin5表达。给予p38MAPK抑制剂SB203580处理后,OA+SB203580组与OA组比较,plin5蛋白表达无统计学差异(P>0.05)。而当给予LY294002处理后,OA+LY294002组与OA组比较,plin5 mRNA及蛋白表达明显降低(Pplin5表达。给予HepG2细胞LY294002处理后,OA+LY294002组与OA组比较,PPAR?mRNA及蛋白表达明显降低(P0.05)。6.PYC抑制OA诱导的脂质蓄积,降低HepG2细胞内甘油三酯含量。给予不同剂量PYC处理后,OA+PYC组、OA+PYC组细胞内脂质蓄积减少,甘油三酯含量明显减少(Pplin5及PPAR?表达。给予不同剂量PYC处理后,OA+PYC组、OA+PYC组分别与OA组相比,plin5及PPAR?mRNA及蛋白表达明显降低(Pplin5表达,增加肝细胞内脂质蓄积。2.PYC可能通过PI3K/PPAR?通路下调plin5表达,减少肝

关键词： plin5 非酒精性脂肪肝病碧萝芷脂质蓄积