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靶向肽脯氨酰顺反异构酶1（pin1）的抑制剂筛选及体外抗肿瘤活性评价

靶向肽脯氨酰顺反异构酶1（Pin1）的抑制剂筛选及体外抗肿瘤活性...

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作者：乔惠郑州大学

学位级别：硕士

目的:恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升,对人体健康造成严重威胁。肽基脯氨酰顺反异构酶1(pin1)可特异性识别并结合pSer/Thr-Pro位点,并催化含该位点蛋白的顺反异构化,调节蛋白活性、稳定性、蛋白-蛋白相互作用及亚细胞定位等,其在许... 详细信息

目的:恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升,对人体健康造成严重威胁。肽基脯氨酰顺反异构酶1(pin1)可特异性识别并结合pSer/Thr-Pro位点,并催化含该位点蛋白的顺反异构化,调节蛋白活性、稳定性、蛋白-蛋白相互作用及亚细胞定位等,其在许多肿瘤细胞及组织中过表达,如前列腺癌、食管鳞癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等。pin1激活50余种致癌基因或促增殖因子,抑制20余种抑癌基因或抗增殖因子,可同时调节多条癌症驱动通路,在肿瘤进展中发挥关键作用,与肿瘤的临床分期及预后密切相关;pin1也可作为肿瘤的生物标志物及预后指标,是当前的研究热点与方向。近年来,许多pin1小分子抑制剂都是通过高通量筛选及基于机制和结构的合理设计开发出来的,在酶水平上达到低微摩尔级或低纳摩尔级,但由于其细胞渗透性差,在细胞水平上活性偏低等因素限制其进一步的研究和开发。因此,寻找高效且细胞渗透性好的pin1小分子抑制剂是十分迫切的。本课题拟通过计算机辅助虚拟筛选、细胞水平活性评价等获得靶向抑制pin1的高效、高细胞渗透性的化合物,同时考察了该化合物的体外抗肿瘤细胞增殖活性,并初步探讨其作用机制。方法:本课题通过:(1)采用Western blot确定pin1高表达的肿瘤细胞株,用于后续实验。(2)计算机辅助虚拟筛选和细胞水平活性评价得到先导化合物,以该化合物结构为基础进行优化得到一系列衍生物,通过近一步的细胞水平筛选得到了显著抑制pin1活性的小分子抑制剂1 169。(3)通过瞬时转染确定有效的pin1干扰质粒,利用该质粒构建pin1沉默的稳定转染细胞株。(4)通过热迁移、Co-IP,以及检测化合物1169处理的shpin1稳转株中pin1及其下游蛋白的表达情况,从而确定化合物1 169在细胞水平对pin1的靶向活性。(5)在PC3、KYSE70细胞株及shpin1稳转细胞株中,进行MTT、集落形成、transwell等实验并检测迁移相关蛋白的表达,评价化合物1169对细胞增殖、集落形成、迁移的影响及其对pin1的靶向抑制作用。(6)流式细胞术确定化合物1169对PC3、KYSE70细胞周期的影响。(7)Western blot法检测化合物1169对pin1下游蛋白表达的影响,初步探讨化合物1169在PC3、KYSE70细胞中的作用机制。(8)通过灌胃给予小鼠高剂量的化合物1169,2周后取心、肝、脾、肺、肾等重要脏器,进行组织蜡块包埋、切片及HE染色,初步确定化合物1169对小鼠的毒副作用。结果:(1)在1 1种肿瘤细胞和2种正常细胞中,pin1在前列腺癌细胞PC3、食管癌细胞KYSE70中的表达水平较高,且明显高于正常细胞。(2)基于pin1晶体结构,通过计算机辅助虚拟筛选获得30个化合物,检测其在细胞水平对pin1下游蛋白CyclinD1表达的影响,获得显著抑制pin1活性的先导化合物12。(3)在pin1高表达的前列腺癌细胞PC3和食管癌细胞KYSE70中,与其他衍生物相比,化合物1 169显著抑制pin1下游蛋白CyclinD1、β-catenin、NFκB、AKT的表达,故获得显著抑制pin1活性的化合物1 169。(4)获得有效的pin1干扰质粒shpin1-835,并成功构建pin1沉默的PC3、KYSE70稳定转染细胞株。(5)在PC3和KYSE70细胞中,CETSA结果表明,化合物1169在细胞水平与pin1结合,增加了 pin1的热稳定性;Co-IP结果表明,化合物1169显著抑制pin1与CyclinD1之间的结合;用化合物1169处理shpin1稳转株后,shpin1组与shpin1+1169组中pin1下游蛋白表达无显著性差异,表明化合物1169靶向pin1。以上结果共同表明,化合物1169在PC3、KYSE70细胞中靶向抑制pin1。(6)在pin1高表达的PC3、KYSE70细胞中,化合物1169对细胞增殖、集落形成、迁移的抑制作用与pin1沉默的结果一致,表明化合物1 169通过靶向pin1显著抑制细胞增殖、集落形成和迁移。(7)细胞周期结果显示,随着化合物1169作用浓度的提高,PC3细胞中G0/G1期比例分别为 63.71%、71.22%、76.73%、83.02%(P1),KYSE70 细胞中 G2/M 期比例分别为 12.28%、14.12%、14.54%、23.73%(P1)。表明化合物1169明显引起PC3细胞发生G0/G1期阻滞,引起KYSE70细胞发生G2/M期阻滞,且具有细胞特异性。(8)化合物1169显著下调PC3、KYSE70细胞中pin1下游蛋白CyclinD1、β-catenin、NFκB、和AKT的表达,表明该化合物可能通过抑制pin1活性降低了 pin1下游蛋白CyclinD1、β-catenin、NFκB、和AKT的稳定性及表达水平,从而发挥抗肿瘤作用。(9)2g/kg化合物

关键词： pin1 前列腺癌食管癌抗肿瘤活性作用机制

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pin1与cyclin D1在急性白血病中的表达及意义

Pin1与cyclin D1在急性白血病中的表达及意义

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作者：马若巾郑州大学

学位级别：硕士

前言肿瘤发生的共同特征是细胞周期调控机制的紊乱，导致细胞的生长失控。急性白血病是造血细胞恶性克隆性疾病，其显著特征是细胞过度增殖和分化障碍，多种癌基因、抑癌基因及其相关基因功能异常，引起其相应蛋白的变化，导致细胞周... 详细信息

前言肿瘤发生的共同特征是细胞周期调控机制的紊乱，导致细胞的生长失控。急性白血病是造血细胞恶性克隆性疾病，其显著特征是细胞过度增殖和分化障碍，多种癌基因、抑癌基因及其相关基因功能异常，引起其相应蛋白的变化，导致细胞周期调控紊乱，细胞恶性增殖，促进了白血病的发生发展。细胞周期的运行要实现精确调控，适时的蛋白结构磷酸化或脱磷酸化的改变与特定蛋白的降解一样重要。细胞中磷酸化调节是一种普遍存在的生物现象，细胞内的很多蛋白通过磷酸化或脱磷酸化来活化从而参与细胞功能的调节。磷酸化依赖的脯氨酸异构酶是磷酸化调节中很重要的调控机制。目前的研究认为，磷酸化丝／苏氨酸-脯氨酸残基存在顺式和反式两种构象，而pin1则通过与磷酸化的丝／苏氨酸-脯氨酸残基结合后，使其构像发生改变，由顺式变为反式，调节蛋白质的功能。pin1的过表达可能参与了多种肿瘤的发生发展。 Cyclin D1是G1／S转换的限速控制因素，抑制cyclin D1的活性，可以使细胞受阻于G1期，限制瘤细胞的增殖，从而抑制肿瘤生长。研究发现，cyclin D1在多种肿瘤中过表达。本研究采用免疫细胞化学法检测pin1与cyclin D1蛋白在初治急性白血病患者及完全缓解后患者骨髓单个核细胞中的表达情况及它们之间的相关性，探讨其在急性白血病发病中的作用。材料与方法 1．研究对象：(1)初治急性白血病骨髓：共收集标本62例，其中男42例，女20例，年龄10～75岁(中位年龄35岁)。包括：①急性髓系白血病(AML)40例，其中M 2例，M 2例，M 20例，M 7例，M 3例，M 3例，M 2例，M1例;②急性淋巴细胞白血病(ALL)22例。所有急性白血病患者均依据FAB分型诊断标准划分。(2)完全缓解病人骨髓35例，为初治组完全缓解后标本。(3)对照组为非恶性血液病骨髓正常者。所有研究对象均取自于2006年5月至12月郑州大学第一附属医院就诊患者。 2．标本处理：采集急性白血病患者化疗前骨髓和对照者骨髓各1ml，分离单个核细胞，制备细胞滴片，采用免疫细胞化学法染色检测pin1和cyclin D1蛋白在初治AL(Acute leukemia)、AL-CR及正常对照者骨髓细胞中的表达。 3．数据统计：实验数据用SPSS11.0软件进行统计学处理，pin1蛋白、cyclin D1抗原阳性率比较采用x检验，变量间的相关分析应用Spearman等级相关分析，以α=0.05为检验水准。结果 1．pin1在正常人骨髓标本中不表达或呈微弱表达。在初治AL患者骨髓单个核细胞中59.7％呈现胞核或胞浆的阳性和(或)强阳性表达，其中AML阳性率为65％，ALL阳性率为50％，两者之间无统计学意义(P＞0.05)。在AL-CR中阳性率为2.9％，其中AML-CR阳性率为4.2％，ALL-CR阳性率为0％，两者之间无统计学意义(P＞0.05)。初治组与正常对照组，初治组与AL-CR组间有显著统计学意义(P＜0.01)，AL-CR组与对照组间无统计学意义(P＞0.05)，且初治AML与AML-CR间及ALL与ALL-CR间均有统计学意义(P＜0.05)。 2．cyclin D1在正常人骨髓标本中不表达或微弱表达。在初治AL患者骨髓单个核细胞中56.5％呈现胞核或胞浆的阳性和(或)强阳性表达，以胞核表达为主，其中AML的阳性率为50％，ALL的阳性率为68％，两者之间无统计学意义(P＞0.05)。在AL-CR中阳性率为2.9％，其中AML-CR阳性率为0％，ALL-CR阳性率为9.1％，两者之间无统计学意义(P＞0.05)。初治组与正常对照组，初治组与AL-CR组间有显著统计学意义(P＜0.01)，AL-CR组与对照组间无统计学意义(P＞0.05)，且初治AML与AML-CR间及ALL与ALL-CR间均有统计学意义(P＜0.05)。 3．相关性分析显示pin1和cyclin D1在急性白血病患者骨髓中的表达呈正相关(r=0.465，P＜0.05)。 4．pin1和cyclin D1蛋白水平与患者的年龄、性别、白细胞高低及浸润等临床特征无明显相关性(P＞0.05)。结论 1．pin1和cyclin D1在初治AML和ALL患者中的表达均显著高于正常对照组和完全缓解组，提示pin1和cyclin D1的异常高表达可能参与了急性白血病的发生和发展。 2．pin1与cyclin D1呈正相关，提示pin1过表达可以促进cyclin D1的表达，pin1可能为cyclin D1的上层调控因素。

关键词： pin1 cyclin D1 急性白血病免疫细胞化学

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pin1抑制由G0S2调节的APL细胞的凋亡

Pin1抑制由G0S2调节的APL细胞的凋亡

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作者：张越东福建医科大学

学位级别：硕士

目的:研究pin1在肿瘤细胞中的作用,验证抑癌蛋白G0S2是pin1作用的靶基因,pin1通过调节G0S2的表达,从而对白血病的发生发展起调节作用;探讨pin1调节G0S2对白血病细胞生物学特性的影响,及其分子机制。方法:(1)构建pin1敲除的CRISPR-Cas9质... 详细信息

目的:研究pin1在肿瘤细胞中的作用,验证抑癌蛋白G0S2是pin1作用的靶基因,pin1通过调节G0S2的表达,从而对白血病的发生发展起调节作用;探讨pin1调节G0S2对白血病细胞生物学特性的影响,及其分子机制。方法:(1)构建pin1敲除的CRISPR-Cas9质粒,转染HEK-293T细胞株,构建pin1敲除的细胞。(2)通过Real-time PCR进行筛查pin1敲除后与细胞周期、增殖及迁移相关基因mRNA表达的改变情况,筛选对pin1敲除敏感的基因。(3)观察利用shRNA敲减pin1以及ATRA抑制pin1蛋白活性后对白血病细胞株HL-60、NB4细胞生物学的影响:MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期与凋亡等;Western Blot检测pin1敲减及G0S2过表达后相关基因的改变。结果:(1)pin1敲除的HEK-293T细胞株细胞增殖能力等相对于正常的HEK-293T细胞来说,受到显著的影响:a.利用CRISPR-Cas9技术成功构建了pin1敲除的HEK-293T细胞,基因组测序结果显示,其基因组分别丢失了18和30个碱基;b.细胞增殖以及细胞形态发生了显著的变化;c.Real-time PCR结果显示G0S2等相关基因在pin1敲除后显著上调;ZEB1等基因显著下调;d.Western Blot结果提示,pin1敲除后,Cyclin D1、CDK6等蛋白下调;e.回复pin1后,G0S2表达下调。(2)在急性粒细胞白血病(APL)细胞中敲减pin1及pin1特异性抑制剂—ATRA作用后,G0S2显著上调,细胞增殖、凋亡、周期等显著变化:a.在APL细胞中沉默pin1后,检测到G0S2 mRNA的表达水平显著增加;b.pin1特异性抑制剂—ATRA作用于APL细胞后,pin1蛋白显著下调,mRNA并未有明显变化,而G0S2 mRNA及蛋白表达均有所增加;c.ATRA作用后,APL细胞的增殖能力受到显著抑制,细胞周期被阻滞于G0/G1期且PE-Annexin检测细胞凋亡率发现其增加约20%,TUNEL染色均显示细胞凋亡显著增加;d.在肝癌细胞中pin1敲减与ATRA处理均能使pin1下调,G0S2上调,并且导致细胞凋亡率的增加。结论:(1)利用CRISPR-Cas9技术构建的pin1敲除HEK-293T细胞成功,pin1敲除以后G0S2,ZEB1等基因mRNA表达水平发生显著变化;(2)pin1敲减及ATRA处理APL细胞均发现G0S2的表达水平均发生显著上调,并且细胞增殖、周期等均显著受到影响。由此得出结论:pin1调节G0S2的表达,促进APL的发生。

关键词： CRISPR-Cas9 pin1 G0S2 HEK-293T细胞白血病

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pin1和Cyclin D1在原发性肝癌中的表达及意义

Pin1和Cyclin D1在原发性肝癌中的表达及意义

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作者：郑东林广西医科大学

学位级别：硕士

目的:本实验通过检测原发性肝癌、相应癌旁组织及正常肝组织中pin1及Cyclin D1的表达,探讨这两个基因在肝癌发病中的作用及与临床病理特征的关系。方法:采用实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应(RQ RT-PCR)方法,对收集的48例经手术切除及... 详细信息

目的:本实验通过检测原发性肝癌、相应癌旁组织及正常肝组织中pin1及Cyclin D1的表达,探讨这两个基因在肝癌发病中的作用及与临床病理特征的关系。方法:采用实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应(RQ RT-PCR)方法,对收集的48例经手术切除及病理学证实的原发性肝癌患者的癌组织标本及相应癌旁组织、8例正常肝组织,进行pin1及Cyclin D1基因检测,比较肝癌、癌旁组织及正常肝组织中两基因表达的差异,分析两者之间的相关性及其与肿瘤临床分期和病理特征的关系。结果: pin1基因在肝癌组织、癌旁组织、正常肝组织中扩增的△Ct值均数分别为3.01±0.74、5.43±1.00、6.09±1.22,pin1在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织(△Ct值3.01±0.74对5.43±1.00, p1±0.74对6.09±1.22, p1基因在肝癌组织、癌旁组织、正常肝组织中扩增的△Ct值均数分别为4.58±0.90、6.76±0.84、6.97±1.12,Cyclin D1在肝癌组织中的表达亦明显高于癌旁组织(△Ct值4.58±0.90对6.76±0.84, p1.12, ppin1与Cyclin D1的表达密切正相关(p1),但pin1和Cyclin D1与性别、年龄、肿瘤的分期、肿块直径、有无包膜、有无癌栓、AFP等病理特征均无明显的相关性。结论: pin1和Cyclin D1在原发性肝癌中的表达明显增高,pin1可能间接或直接与Cyclin D1相互作用而调节细胞周期,从而在肝癌发生过程中起着重要作用,并可能成为治疗肝癌的新靶点。pin1及Cyclin D1的表达与原发性肝癌的临床病理特征无明显关系。

关键词：原发性肝癌基因 pin1 Cyclin D1 实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应

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pin1在不同时限氧反常诱导的神经元损伤及其线粒体凋亡通路中的作用

Pin1在不同时限氧反常诱导的神经元损伤及其线粒体凋亡通路中的作...

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作者：韩永玲福建医科大学

学位级别：硕士

目的观察pin1在不同时限氧反常诱导的大鼠胚脑皮质神经元损伤中的表达变化、pin1的表达改变对神经元形态功能的影响,并探讨不同时限的神经元氧反常损伤后,pin1在神经元线粒体凋亡途径中的可能作用及其作用特点。方法原代培养大鼠胚脑皮... 详细信息

目的观察pin1在不同时限氧反常诱导的大鼠胚脑皮质神经元损伤中的表达变化、pin1的表达改变对神经元形态功能的影响,并探讨不同时限的神经元氧反常损伤后,pin1在神经元线粒体凋亡途径中的可能作用及其作用特点。方法原代培养大鼠胚脑皮质神经元,并用尼氏染色和微管相关蛋白2(MAP-2)鉴定神经元。将培养成熟的胚脑皮质神经元分为正常对照组(Control);不同时限氧糖剥夺/再复氧糖(OGD/R)模型组:即OGD1h/R6h组(M6h)、OGD1h/R12h组(M12h);pin1蛋白抑制剂组:即Juglone 6μmol/L组(M6h+J6,M12h+J6);Pi B 0.7、1.0μmol/L组(M6h+P0.7,M6h+P1组,M12h+P0.7,M12h+P1组),每组均设6个复孔。倒置相差显微镜动态观察细胞形态;CCK-8法检测神经元活性;Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡;免疫细胞化学法分别检测神经元pin1、Bax及p-Bim EL蛋白表达;流氏细胞术检测神经元线粒体膜电位(Δψm);透射电镜观察神经元超微结构的改变。结果(1)与Control组相比,M6h组和M12h组细胞折光性下降,突起收缩变圆,神经元网络破坏,M12h组细胞甚至出现崩解,神经元网络严重破坏;随复氧时间延长,神经元活性明显下降(P1),神经细胞凋亡增加(P1),pin1蛋白表达升高(P1),线粒体相关凋亡因子p-Bim EL、Bax蛋白表达均明显升高(P1),Δψm下降(P12h组细胞超微结构损伤,线粒体、内质网肿胀,空泡样变;(2)复氧糖即刻分别使用Juglone 6μmol,Pi B0.7、1.0μmol/L后,与M6h组相比,M6h+J6、M6h+P0.7、M6h+P1.0组细胞活性下降(P1),细胞凋亡增加(P1),pin1蛋白表达下降(P1),线粒体相关凋亡因子p-Bim EL、Bax蛋白表达均明显升高(P1),Δψm下降(P12h组相比,M12h+J6、M12h+P0.7、M12h+P1.0组细胞活性则明显升高(P1),细胞凋亡减少(P1),pin1蛋白表达下降(P1),线粒体相关凋亡因子p-Bim EL、Bax蛋白表达均明显降低(P1),Δψm升高(P1)OGD1h/R6、12h后,随复氧糖时间的延长,神经元pin1蛋白表达逐渐升高,细胞损伤加重、活性下降,细胞凋亡增加,线粒体相关凋亡因子p-Bim EL、Bax蛋白表达亦明显升高,Δψm下降,且OGD1h/R12h后细胞超微结构损伤。上述指标变化与复氧糖时限均呈正相关。(2)于复氧糖6h分别使用Juglone6μmol、Pi B0.7、1.0μmol/L抑制pin1后,神经元活性降至更低,凋亡更增加,pin1蛋白表达下调,线粒体促凋亡因子p-Bim EL、Bax蛋白表达则进一步升高,Δψm更下降,提示在神经元OGD1h/R6h这一时限pin1可能与某些抗损伤因子相互作用而保护神经元对抗凋亡,当pin1活性被抑制后,pin1与抗损伤因子的作用减弱,导致细胞凋亡更重。(3)于复氧糖12h时分别使用Juglone 6μmol、Pi B0.7、1.0μmol/L抑制pin1后,细胞损伤减轻,神经元活性上升,细胞凋亡减轻,pin1蛋白表达下降,同时线粒体相关凋亡因子p-Bim EL、Bax蛋白表达均明显下调,且pin1、p-Bim EL、Bax蛋白表达变化成正相关,Δψm有所恢复,细胞超微结构损伤亦减轻,提示pin1在神经元OGD1h/R12h这一时限可能通过稳定磷酸化的p-Bim EL而活化线粒体凋亡通路,促进神经元凋亡。当pin1活性被抑制后,其稳定磷酸化的p-Bim EL的作用减弱,使线粒体凋亡通路的活化减轻,神经元凋亡亦减轻。即神经元中的pin1在这一时限可能通过对磷酸化的p-Bim EL稳定性的调控作用,参与介导神经元凋亡。

关键词： pin1 氧反常凋亡 p-BimEL Bax Δψm 胚脑皮质神经元

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肽基脯氨酰异构酶pin1对磷酸化底物调控机理的研究

肽基脯氨酰异构酶Pin1对磷酸化底物调控机理的研究

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作者：史琪大连工业大学

学位级别：硕士

肽基脯氨酰顺反异构酶pin1由163个氨基酸残基组成,包含N端负责特异性识别并结合磷酸化底物的WW结构域和C端负责对磷酸化底物进行催化异构化的PPIase结构域,其是一种相对较小的酶。pin1能够特异的识别和结合含有p Ser/Thr-Pro基序的蛋白... 详细信息

肽基脯氨酰顺反异构酶pin1由163个氨基酸残基组成,包含N端负责特异性识别并结合磷酸化底物的WW结构域和C端负责对磷酸化底物进行催化异构化的PPIase结构域,其是一种相对较小的酶。pin1能够特异的识别和结合含有p Ser/Thr-Pro基序的蛋白,并对其催化异构化。同时,pin1参与多条信号通路的调控,在致癌信号通路中发挥着整合、翻译和放大等作用,并且在多种肿瘤细胞中过表达。越来越多的研究表明抑制pin1可以抑制多条致癌信号通路,因此pin1有望成为新的肿瘤诊断和治疗的理想靶标。c-Jun是二聚体转录因子激活蛋白1(AP-1)的主要成分,它参与许多细胞活动,例如增殖、凋亡、存活、肿瘤发生和形态组织发生。c-Jun丰度和活性的失调与多种类型的癌症相关。有研究表明,pin1介导的脯氨酰顺反异构化会影响底物稳定性,pin1会保护c-Jun免受泛素介导的降解。因此,了解pin1对磷酸化c-Jun的作用机理,就有望基于此催化机理找到抑制pin1的方法。本文利用配有超低温探头的700MHz液体核磁共振仪,以pin1和单/多位点磷酸化多肽c-Jun为对象,探究pin1对其磷酸化底物c-Jun的结合和催化机理。在25℃条件下,通过二维H-N HSQC化学位移扰动滴定实验,研究pin1两个结构域与单/多位点磷酸化多肽c-Jun的结合活性位点;二维H-H ROESY实验,研究PPIase结构域对单/多位点磷酸化多肽c-Jun催化异构化效率;二维NOE实验,判断pin1结构骨架的刚性,推测pin1对多位点磷酸化c-Jun的催化机理,具体内容如下:(1)提出了pin1与多位点磷酸化c-Jun的四态结合模型。将pin1 WW结构域蛋白、pin1 PPIase结构域蛋白和pin1全长蛋白分别与单位点磷酸化多肽c-Jun p Ser 63、c-Jun p Ser 73和双位点磷酸化多肽c-Jun p Ser 63-p Ser 73进行滴定实验。首次在pin1全长蛋白上同时观测到WW结构域和PPIase结构域上与底物的结合活性位点,发现pin1蛋白与单/多位点磷酸化多肽c-Jun结合时单独的WW结构域与磷酸化底物c-Jun结合的亲和力要低于单独的PPIase结构域对磷酸化底物c-Jun的亲和力;而当两个结构域同时存在时,WW结构域对磷酸化底物c-Jun的亲和力大幅提升,同时WW结构域还会一定程度上与PPIase竞争结合底物;多位点磷酸化底物c-Jun在与pin1蛋白相互作用时亲和力则得到了显著提升,并确定了pin1与多位点磷酸化多肽的四态结合模型。(2)推测了pin1对多位磷酸化c-Jun的催化机理。将pin1 PPIase结构域蛋白和pin1全长蛋白分别与单位点磷酸化多肽c-Jun p Ser 63、c-Jun p Ser 73、c-Jun D 63-p Ser73和双位点磷酸化多肽c-Jun p Ser 63-p Ser 73进行H-H ROESY实验,并通过NOE实验确定了PPIase结构域为刚性骨架。得到单位点磷酸化多肽c-Jun在与pin1蛋白催化异构化时,WW结构域的存在会削弱PPIase结构域对底物肽键催化异构化的效率,且p Ser73底物具有极低的催化异构化效率。c-Jun D 63-p Ser 73多肽与蛋白催化异构化时,p Ser73异构化速率大大提升,c-Jun p Ser63-p Ser73与蛋白催化异构化时,p Ser 73异构化速率进一步提升。因此,底物中63位残基的存在及p Ser 63的异构化会促进73位残基的催化异构化。推测了pin1与底物结合会促进催化异构化的可能原因为结合可能具有记忆性。本论文所提出的pin1与多位点磷酸化多肽c-Jun的结合及催化异构化机理,为进一步对pin1支链结构参与多位点磷酸化多肽c-Jun催化过程的研究提供了基础,同时也为pin1针对不同磷酸化底物的催化机理提供了思路。

关键词： pin1 c-Jun 多位点磷酸化催化异构化液体核磁共振

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Real-time PCR法检测非小细胞肺癌患者围手术期循环血中pin1 mRNA的表达及意义

Real-time PCR法检测非小细胞肺癌患者围手术期循环血中Pin1 mRNA...

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作者：艾正华中南大学

学位级别：硕士

背景:蛋白分子中丝/苏-脯氨酸基序(ser/thr—pro)的磷酸化是一个重要的细胞内信号转导机制。pin1是一种高度保守的、特异的多肽脯氨酰基顺/反异构酶,仅特异性地催化磷酸化的丝/苏-脯氨酸基序发生异构。这种磷酸化后的异构导致底物蛋白... 详细信息

背景:蛋白分子中丝/苏-脯氨酸基序(ser/thr—pro)的磷酸化是一个重要的细胞内信号转导机制。pin1是一种高度保守的、特异的多肽脯氨酰基顺/反异构酶,仅特异性地催化磷酸化的丝/苏-脯氨酸基序发生异构。这种磷酸化后的异构导致底物蛋白构象的改变,从而调节它们的功能。因此pin1的催化反应是一条新的改变磷酸化蛋白功能的信号通道,并且在肿瘤的发生中起着重要作用。研究显示,pin1在许多肿瘤组织中过度表达,促进细胞的异常增殖和肿瘤的发生,被称为肿瘤发生的催化分子,成为肿瘤发生发展的标志。本文定量检测了pin1 mRNA在NSCLC患者围手术期循环中的表达情况。目的:1.pin1 mRNA在非小细胞肺癌围手术期的表达及意义。2.肺血管处理顺序的不同对pin1 mRNA在非小细胞肺癌患者循环血中表达影响及意义。方法:接受根治性手术的原发性NSCLC患者26例,按预定的结扎血管顺序术前将病例随机分为先结扎肺静脉组(PV-first ligation group)和先结扎肺动脉组(PA-first ligation group)。分别采集其术前(麻醉后)外周血标本、术中结扎肺静脉后近心端和远心端血标本及术后第7日外周血标本。选择10例需手术治疗的肺部良性疾病患者作为对照。以10例健康人作为阴性对照,以pin1作为检测标志物,运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法定量检测患者循环中的pin1 mRNA表达情况。结果:(1)肺癌患者循环中pin1 mRNA表达量显著高于肺部良性病变患者和正常人,并且其表达量和患者癌症分期、淋巴结是否转移相关(p＜0.05);(2)肺静脉远心端pin1 mRNA的表达量高于近心端的表达量(p=0.019);PV-first Group的pin1 mRNA在肺静脉近心端的表达量低于PA-first Group(p=0.106),而其远心端则高于PA-firstGroup.(p=0.082)(3)手术后一周pin1 mRNA的表达情况显著低于术前(p=0.031)。结论:(1)pin1在NSCLC患者血液循环中有高表达,或许可以成为一个在肺癌早期诊断和治疗的有潜力的肿瘤标志物。(2)肺癌根治术术中操作可导致癌细胞入血;肺癌根治术术中先结扎肺静脉,可在一定程度上阻止癌细胞入血。

关键词： pin1 非小细胞肺癌 real-time PCR

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成人鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤中pin1和CyclinD1的表达及意义

成人鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤中Pin1和CyclinD1的表达及意义

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作者：卢珊青岛大学

学位级别：硕士

目的在许多疾病及肿瘤中,肽基脯氨酰顺反异构酶1(Peptidylprolyl cis/trans isomerase,NIMA-interacting 1,pin1)上调细胞周期蛋白D1(Cell cycle proteinD1,CyclinD1)的表达。检测pin1与CyclinD1在成人鼻腔、鼻窦内翻性乳头状瘤(Sinonasal inverted papilloma,SNIP)、SNIP伴不典型增生及SNIP恶变中的表达情况,探讨pin1和CyclinD1在SNIP及其恶变的发生、发展过程中的作用及二者的相关性,从而指导临床治疗。方法实验组:成人SNIP组织24例,SNIP伴不典型增生(包括10例轻度和7例中、重度不典型增生)组织17例,SNIP恶变组织5例,共计46例。对照组:成人诊断为鼻中隔偏曲,发生一侧下鼻甲代偿性肥大,而行下鼻甲部分切除术的下鼻甲黏膜组织标本20例。实验方法用实时荧光定量PCR法和免疫组化法,检测pin1与CyclinD1mRNA和蛋白的表达情况,并进行相关分析,探讨各实验组中pin1和CyclinD1表达情况与临床病理特征的关系。计数资料用χ检验、Fisher确切概率法,计量资料用t检验、Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis H法,相关性分析用Spearman秩相关分析和双变量相关性分析。P1.pin1 mRNA表达量在SNIP组高于对照组、SNIP伴不典型增生组低于对照组,差异无统计学意义(P>0.05);SNIP恶变组低于对照组,差异有统计学意义(PSNIP伴不典型增生>SNIP恶变组,仅SNIP组与SNIP恶变组之间表达差别有意义(Ppin1 mRNA在大于55岁患者中表达量高于小于55岁患者,差异有统计学意义(P1 mRNA在SNIP、SNIP伴不典型增生组、SNIP恶变组中表达均高于对照组,差异有统计学意义(PSNIP伴不典型增生>SNIP组,各组间差别有意义(P1 mRNA在不同性别、年龄、临床分期中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。3.各实验组中pin1 mRNA与CyclinD1 mRNA表达无明显相关性(P>0.05)。4.pin1蛋白在SNIP组表达阳性率高于对照组,差异有统计学意义(χ=8.312,Ppin1蛋白阳性表达率SNIP>SNIP伴不典型增生>SNIP恶变组,SNIP组与SNIP伴不典型增生组、SNIP组与SNIP恶变组之间差异有统计学意义(Ppin1蛋白在不同临床分期中表达阳性率T4>T2>T1>T3,且差异有统计学意义(P1蛋白在SNIP伴不典型增生组和恶变组阳性率高于对照组,差异均有统计学意义(P1蛋白阳性表达率SNIP恶变>SNIP伴不典型增生>SNIP组,SNIP组与SNIP伴不典型增生组、SNIP组与SNIP恶变组间差异有统计学意义(P1蛋白阳性率与患者不同的性别、年龄、临床分期无明显相关性(P>0.05)。6.pin1蛋白与CyclinD1蛋白的表达呈负相关(Rs=-0.717,P=0.045)。结论1.随着SNIP的发生、发展,pin1 mRNA和pin1蛋白表达量逐级减低,其低表达与SNIP发展进程及恶变的发生密切相关,可能在SNIP的恶变过程中发挥了一定的抑制作用。2.随着SNIP的发生、发展,CyclinD1 mRNA和CyclinD1蛋白表达量逐级增加,其过表达与SNIP的发生、发展及恶变密切相关,提示其可能在SNIP恶变过程中有着一定的促进作用。3.pin1蛋白和CyclinD1蛋白在SNIP肿瘤组织中表达呈负相关,提示pin1和CyclinD1在SNIP的发生、发展中可能起到拮抗作用。

关键词：鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤恶变 pin1 CyclinD1 相关性

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miR-200c调控pin1对喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响

miR-200c调控PIN1对喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响

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作者：温行中国医科大学

学位级别：硕士

前言:喉癌是头颈部常见恶性肿瘤之一,约95%为鳞状细胞癌,主要起源于喉粘膜上皮组织,喉鳞状细胞癌具有较高的死亡率和预后不良。目前,喉癌的发生发展及预后的众多分子机制尚不完全清楚。因此,探究喉癌发生发展的分子机制,寻找其诊断及预... 详细信息

前言:喉癌是头颈部常见恶性肿瘤之一,约95%为鳞状细胞癌,主要起源于喉粘膜上皮组织,喉鳞状细胞癌具有较高的死亡率和预后不良。目前,喉癌的发生发展及预后的众多分子机制尚不完全清楚。因此,探究喉癌发生发展的分子机制,寻找其诊断及预后的生物分子标记物至关重要。miRNAs(microRNAs)是近年来发现的一类长度约为22个核苷酸的单链非编码RNA,通过特异性地结合靶基因mRNA的3'UTR而发挥作用。研究表明,mi RNA既可以作为癌基因下调抑癌基因的活性,也可以作为抑癌基因下调癌基因的活性。miR-200c是miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-429和miR-141)成员之一,位于12号染色体上。研究表明,miR-200c在多种类型的癌中对上皮-间充质细胞转化、细胞侵袭、转移、增殖、凋亡、自噬和抗治疗过程都起到决定性的作用,而且在不同肿瘤中发挥不同的作用。目前,miR-200c是否参与喉癌的发生和发展尚不明确。前期工作中,我们发现过表达pin1加剧了中心体扩增、细胞异常分裂和细胞迁移。通过Targetscan等软件预测发现,pin1是miR-200c的潜在靶基因之一。本研究中,我们将应用相关分子生物学技术探究miR-200c对喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响以及miR-200c是否通过pin1在喉癌中发挥其生物学功能。材料与方法一、实验材料(一)喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系。(二)组织标本:取自中国医科大学第一附属医院耳鼻喉科喉癌患者,全部病人术前未进行放化疗。标本保存于-80°C冰箱中,所有标本均经病理学检查确诊,并经医学伦理委员会批准及患者知情同意。(三)主要分子生物学相关试剂:RPMI1640培养基,Serana胎牛血清,RNAiso Plus RNA提取试剂,Takara定量试剂和RNA反转录试剂盒,SDS-PAGE凝胶试剂盒,兔抗pin1单克隆抗体,鼠抗β-actin单克隆抗体,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG,辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG,小鼠抗γ-Tubulin单克隆抗体,Dylight 488标记抗小鼠IgG,TIANGEN质粒提取试剂盒,FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I等。二、实验方法1、荧光素酶报告基因活性检测2、细胞培养3、基因瞬时转染实验4、qRT-PCR检测5、Western Blot检测6、CCK8检测7、Transwell小室检测法8、免疫荧光实验9、流式细胞术检测10、统计分析实验结果1、Real-time PCR结果显示,miR-200c在喉癌组织中的表达水平较癌旁组织增高(P0.05)。3、Transwell实验结果显示,miR-200c mimics转染组穿过小室的Hep-2细胞数显著低于对照组,而miR-200c inhibitor转染组中穿过小室的Hep-2细胞数多于对照组(P0.05)。6、TargetScan等软件预测结果显示,在pin1的3'UTR存在miR-200c的结合位点,提示pin1是miR-200c的潜在靶基因之一。7、荧光素酶报告基因结果显示,共转染pin1野生型报告载体和miR-200c mimics组荧光素酶活性与其他对照组相比显著降低(Ppin1是miR-200c的靶基因。8、Real-time PCR和Western Blot结果显示,miR-200c mimics转染组中pin1蛋白表达水平与对照组相比降低,miR-200c inhibitor转染组中pin1蛋白表达水平较对照组增高(P0.05),提示miR-200c在翻译水平抑制pin1的

关键词：喉癌 pin1 miR-200c 迁移中心体

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VitD/pin1轴调控糖尿病血管内皮衰老的机制研究

VitD/pin1轴调控糖尿病血管内皮衰老的机制研究

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作者：游卓福建医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究通过动物实验观察维生素D和pin1抑制剂胡桃醌对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病SD大鼠主动脉结构和内皮舒张功能的影响,以及pin1、SIRT1、P66shc及衰老相关蛋白表达的影响;细胞实验观察VitD和胡桃醌对高糖诱导的脐静脉内皮(HUVE... 详细信息

目的:本研究通过动物实验观察维生素D和pin1抑制剂胡桃醌对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病SD大鼠主动脉结构和内皮舒张功能的影响,以及pin1、SIRT1、P66shc及衰老相关蛋白表达的影响;细胞实验观察VitD和胡桃醌对高糖诱导的脐静脉内皮(HUVECs)衰老的影响及探讨VitD/pin1轴失衡调节糖尿病内皮衰老的可能机制。方法:动物实验:通过STZ腹腔注射SD大鼠建立糖尿病大鼠模型,动物分组:Ctr组(空白对照组),DM组(STZ组),VitD组(STZ+VitD灌胃组),胡桃醌组(STZ+胡桃醌腹腔注射组),联合用药组(STZ+VitD灌胃+胡桃醌腹腔注射组);每组10只。葡萄糖氧化酶法测定大鼠空腹血糖水平;H-E染色观察SD大鼠主动脉结构,离体血管环实验检测胸主动脉血管舒张功能,WB检测细胞衰老相关蛋白分子表达水平。细胞实验:体外胶原酶消化法提取人脐静脉内皮细胞,通过细胞形态学,蛋白质免疫印迹法进行HUVECs细胞鉴定。用33mM葡萄糖溶液建立高糖诱导细胞衰老模型,分为Ctr组,高糖组(33mM葡萄糖),vit D组(高糖+vit D),胡桃醌组(高糖+胡桃醌);联合用药组(高糖+vit D+胡桃醌);通过β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞;流式细胞技术检测细胞周期;免疫印迹法(Western blot)检测衰老相关蛋白表达水平;免疫荧光检测活细胞内ROS水平,JC-1法检测细胞线粒体膜电位水平。结果:动物实验:1)与Ctr组相比,DM组大鼠空腹血糖明显升高,VitD组、胡桃醌组及联合用药组大鼠空腹血糖有明显降低,VitD组、胡桃醌组及联合用药组之间空腹血糖无明显差异。2)HE染色显示:Ctr组SD大鼠胸主动脉内膜结构完整,光滑,中膜厚度均匀,血管平滑细胞排列规则;DM组SD大鼠主动脉内膜凹凸不平,中膜厚度不均,部分有缺损;VitD组、胡桃醌组及联合用药组SD大鼠,内膜结构较完整,中膜结构较均匀,血管平滑细胞结构较规则。3)与Ctr组大鼠相比,DM组SD大鼠胸主动脉ACH内皮依赖性与SNP非内皮依赖性舒张功能明显降低,当ACH浓度为10M,SNP10M两组舒张功能有显著差异,与DM组相比,VitD组、胡桃醌组及联合用药组SD大鼠胸主动脉内皮依赖性及非内皮依赖性舒张功能明显改善,组间无明显差异。4)糖尿病可显著增加SD大鼠胸主动脉pin1蛋白,线粒体氧化调控蛋白P66Shc及衰老相关标记分子P21蛋白表达水平,降低线粒体氧化调控蛋白SIRT1表达水平;与DM组相比,VitD组、胡桃醌组及联合用药组均能抑制糖尿病小鼠胸主动脉pin1、P66Shc、SIRT1及P21蛋白表达,组间无明显差异。细胞实验:1)与Ctr组相比,高糖组衰老染色细胞明显增多,与高糖组相比,VitD组、胡桃醌组及联合用药组染色细胞明显减少,而VitD组(10M)、胡桃醌组(10M),联合用药组之间无明显差异。2)与ctr组相比,高糖组HUVECs细胞G1期细胞比例明显增多;与高糖组相比,VitD、胡桃醌及联合药物干预,可使G1期细胞比例减少,而VitD组(10M)、胡桃醌组(10M),联合用药组之间无明显差异。3)与Ctr组相比,高糖(33mM)可明显可增强细胞内ROS的产生,表现为荧光明显增强,与高糖组相比,VitD组(10M)、胡桃醌组(10M)及联合用药组可以抑制高糖条件下细胞产生的荧光强度,而VitD组(10M)、胡桃醌组(10M),联合用药组之间无明显差异4)与Ctr组相比,高糖(33mM)可使线粒体膜电位下降,VitD(10M)及胡桃醌(10M)可明显抑制高糖诱导的线粒体膜电位下降,与HG组相比,VitD组、胡桃醌组及联合用药组,线粒体膜电位明显降低,而VitD组(10M)、胡桃醌组(10M),联合用药组之间无明显差异。5)与Ctr组相比,高糖(33mM)能诱导HUVECs细胞pin1、线粒体氧化调控蛋白P66Shc及衰老相关分子P21表达水平,抑制线粒体氧化调控蛋白SIRT1表达水平,与高糖组相比,VitD(10M)组及胡桃醌组(10M)能降低高糖诱导HUVECs细胞pin1、P66Shc及P21表达水平,VitD能明显改善高糖诱导的SIRT1表达降低;联合用药组能明显降低SIRT1,P66Shc及P21的表达水平。结论:1)VitD及胡桃醌均可抑制糖尿病诱发大鼠胸主动脉损伤,改善血管功能;2)VitD及胡桃醌可抑制糖尿病大鼠胸主动脉pin1、SIRT1、P66Shc及P21蛋白表达水平;3)VitD及胡桃醌均可抑制HUVECs氧化应激和细胞周期阻滞;4)VitD及胡桃醌可能通过调控SIRT1/P66Shc失衡,延缓内皮细胞衰老。

关键词：糖尿病内皮细胞衰老 pin1 SIRT1

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