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Marker-Assisted Introgression of Quantitative Resistance Gene pi21 Confers Broad Spectrum Resistance to Rice Blast

Rice science 2020年第2期27卷 113-123页

作者： Rosalyn B.ANGELES-SHIM Vincent P.REYES Marilyn Mdel VALLE Ruby S.LApiS Junghyun SHIM Hidehiko SUNOHARA Kshirod K.JENA Motoyuki ASHIKARI Kazuyuki DOI Plant Breeding Division International Rice Research InstituteDAPO Box 7777Metro Manilathe Philippines Bioscience and Biotechnology Center Nagoya UniversityChikusa-ku Furo-choNagoyaAichi 464-8601Japan Graduate School of Bioagricultural Sciences Nagoya UniversityChikusa-ku Furo-choNagoyaAichi 464-8601Japan Department of Plant and Soil Science College of Agricultural Sciences and Natural ResourcesTexas Tech UniversityLubbockTexas 79409USA

The quantitative resistance gene pi21 from Sensho was introgressed to an indica breeding line IR63307-4B-13-2,a pyramiding line IRBB4/5/13/21,and a tropical japonica line Kinandang Patong by marker-assisted backcrossing.A total of 192 improved lines at the BC4F3 and BC4F4 generations were developed and confirmed to have the gene introgression via genotyping using a pi21-specific InDel *** randomly selected improved lines,representing all the three genetic backgrounds,demonstrated resistance against leaf blast composites in the field and a broader spectrum resistance against individual isolates compared to the recurrent parents in the ***,the tested lines exhibited pi21-acquired resistance against 11 leaf blast isolates that elicited susceptible reactions from the recurrent *** the tested lines maintained a comparative heading date,and similar or improved panicle length,number of primary branches per panicle and number of total grains per panicle relative to the recurrent *** physical grain characteristics of the recurrent parents were also maintained in the 13 lines tested,although variability in the amylose content and chalkiness degree was *** successful marker-assisted introgression of pi21 in diverse genetic backgrounds and the resulting broader spectrum resistance of improved lines against leaf blast indicate the potential of pi21 for deployment in cultivars grown across other rice growing regions in Asia.

关键词： rice blast pi21 gene marker-assisted breeding disease resistance

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利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻pi21基因的效率分析

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中国水稻科学 2016年第5期30卷 469-478页

作者：王芳权范方军李文奇朱金燕王军仲维功杨杰江苏省农业科学院粮食作物研究所/国家水稻改良中心南京分中心/江苏省优质水稻工程技术研究中心南京210014 扬州大学江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心江苏扬州225009

利用CRISPR/Cas9技术,针对pi21基因的两个靶位点(靶位1和靶位2),构建基因敲除载体,转化水稻品种南粳9108。经PCR鉴定,获得了28株T0代阳性转基因植株。对靶位点酶切检测发现,靶位1突变效率为78.57%,靶位2突变效率为92.86%;靶位1和靶位2... 详细信息

利用CRISPR/Cas9技术,针对pi21基因的两个靶位点(靶位1和靶位2),构建基因敲除载体,转化水稻品种南粳9108。经PCR鉴定,获得了28株T0代阳性转基因植株。对靶位点酶切检测发现,靶位1突变效率为78.57%,靶位2突变效率为92.86%;靶位1和靶位2同时突变的效率为78.57%,突变效率较高。通过对靶位点进行测序,发现靶位点突变类型较多,包括碱基缺失、碱基插入、碱基缺失后插入其他碱基和大片段DNA缺失等类型。对突变株系进行氨基酸预测,发现大部分株系都存在移码突变现象而使基因突变彻底,少数株系表现为部分氨基酸的缺失或变异。成功敲除了水稻pi21基因,并对突变效率和类型进行了分析,为进一步验证pi21基因功能、培育广谱抗稻瘟病的水稻新品系奠定了基础。

关键词： CRISPR/Cas9 稻瘟病 pi21 基因敲除

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基于CRISPR/Cas9技术的水稻pi21基因编辑材料的创制及稻瘟病抗性鉴定

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分子植物育种 2017年第11期15卷 4451-4465页

作者：杨海河毕冬玲张玉邹小维高晓庆袁正杰曲海艳何海燕瞿绍洪浙江师范大学化学与生命科学学院金华321004 浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所杭州310021

利用CRISPR-Cas9技术,对水稻稻瘟病感病品种日本晴pi21基因进行定点突变,获得了抗稻瘟病的pi21隐性突变株系。基因编辑载体T0转化植株的检测结果表明,86.7%的T0植株的pi21基因靶序列发生了碱基缺失。通过T-DNA序列的PCR检测,剔除携带T-... 详细信息

利用CRISPR-Cas9技术,对水稻稻瘟病感病品种日本晴pi21基因进行定点突变,获得了抗稻瘟病的pi21隐性突变株系。基因编辑载体T0转化植株的检测结果表明,86.7%的T0植株的pi21基因靶序列发生了碱基缺失。通过T-DNA序列的PCR检测,剔除携带T-DNA的T1植株,从23个T1株系筛选获得107个不含T-DNA转基因序列的植株。然后对pi21的编辑位点进行酶切和测序分析,获得了21株pi21纯合突变体。对1个pi21突变株系进行稻瘟病菌孢子喷雾接种,与未转化日本晴相比,突变株系显著抗病。对接种水稻样品的6个病程相关基因进行q RT-PCR分析,与感病日本晴比较,pi21突变株系在接种稻瘟病菌后,病程相关基因诱导表达的速度更快,表达量更高。本研究利用基因编辑技术,实现了对感稻瘟病水稻的定点突变并提高了其稻瘟病抗性水平,为利用该技术培育持久抗稻瘟病水稻品种奠定了研究基础。

关键词： pi21 CRISPR/Cas9 水稻稻瘟病抗性病程相关基因 qRT-PCR

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Knock-out Efficiency Analysis of pi21 Gene in Rice using CRISPR/Cas9

Knock-out Efficiency Analysis of Pi21 Gene in Rice using CRI...

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江苏省遗传学会2016年学术年会

作者：王芳权 FAN Fang-jun LI Wen-qi ZHU Jin-yan WANG Jun ZHONG Wei-gong 杨杰 Institute of Food Crops Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Nanjing Branch of Chinese National Center for Rice Improvement/Jiangsu High Quality Rice R & D Center Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops Yangzhou University

Rice blast,bringing a great harm in rice yield and quality,is one of the main diseases in ***21 is a significant gene with broad-spectrum resistance to rice *** mutation of pi21 gene improves the blast resistance *** this study,we constructed a CRISPR/Cas9 vector,which contains two targets(Target1 and Target2) of pi21 gene,and transformed to rice variety ***-eight T transgenic lines were obtained and confirmed by T-DNA specific *** restriction digestion analysis,we detected a high mutant ratio,showing 78.57% mutant ratio in Target1 site,92.86% mutant ratio in Target2 site,and there is 78.57% ratio of lines containing both Target1 and Target2 mutant in transgenic *** sequencing analysis,the mutant types of targets,such as deletion of bases,insertion of bases,insertion behinds deletion of bases,and long fragment deletion of DNA,etc.,were ***,we found that most transgenic lines displayed frameshift mutation and caused lost function of pi21,and some of transgenic lines shown amino acid *** this way,a series of pi21-knock-out rice lines are obtained,and further,can use for functional analysis of pi21 and rice blast broad-spectrum resistant breeding.

关键词： CRISPR/Cas9 rice blast pi21 gene knock-out

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利用CRISPR/Cas9系统编辑pi21基因改良大粒香稻瘟病抗性

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分子植物育种 2022年

作者：彭强李佳丽徐海峰张习春张大双朱速松贵州省农业科学院水稻研究所

稻瘟病严重危害水稻产量，抗稻瘟病成为水稻新品种选育和大规模生产应用的前提。功能缺失的pi21基因具有稻瘟病抗性，为改良优质稻大粒香的稻瘟病抗性，本研究对pi21基因进行定向基因编辑。利用CRISPR/Cas9系统，pi21基因作为编辑靶基... 详细信息

稻瘟病严重危害水稻产量，抗稻瘟病成为水稻新品种选育和大规模生产应用的前提。功能缺失的pi21基因具有稻瘟病抗性，为改良优质稻大粒香的稻瘟病抗性，本研究对pi21基因进行定向基因编辑。利用CRISPR/Cas9系统，pi21基因作为编辑靶基因，构建基因编辑载体CRISPR-pi21，通过农杆菌介导方法转化优质稻大粒香愈伤组织。创建16份发生pi21基因编辑事件的CRISPR-pi21材料，获得了不含Cas9外源的pi21纯合突变植株。与表现为高感(综合指数为9.0)的对照大粒香相比，2份改良株系的叶瘟和穗瘟抗级显著降低，其稻瘟病抗性评价为中感(综合指数为4.5)。利用CRISPR/Cas9系统能有效地编辑目标基因pi21，提高改良株系的稻瘟病抗性，在水稻生物育种领域具有应用价值。

关键词：稻瘟病 pi21 基因编辑遗传转化

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水稻抗褐斑病品种资源筛选及广谱持久抗稻瘟病基因pi21和bsr-d1编辑材料的创建

水稻抗褐斑病品种资源筛选及广谱持久抗稻瘟病基因pi21和bsr-d1编...

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作者： Muhammad Usama Younas 扬州大学

学位级别：硕士

对于世界上不断增长的人口而言,水稻是最重要的口粮作物之一。人类消耗的大半卡路里源于诸如水稻、小麦和玉米等粮食作物。水稻是亚洲各国最重要的粮食作物,而诸如褐叶斑病、稻瘟病、白叶枯病等水稻病害引起的水稻减产是导致全球水稻产... 详细信息

对于世界上不断增长的人口而言,水稻是最重要的口粮作物之一。人类消耗的大半卡路里源于诸如水稻、小麦和玉米等粮食作物。水稻是亚洲各国最重要的粮食作物,而诸如褐叶斑病、稻瘟病、白叶枯病等水稻病害引起的水稻减产是导致全球水稻产量逐年减少的主要原因之一。由褐斑病菌引起的水稻褐叶斑病是水稻增产的主要制约因素之一,由于该病原菌能够通过空气传播并可潜伏于稻种中,导致褐叶斑病的蔓延十分迅速。对水稻生产威胁最大的病害是稻瘟病,而寻找并培育抗性品种是控制稻瘟病发生的最经济有效方式。本研究对25份水稻品种进行了水稻褐斑病抗性鉴定,并鉴定到多个含有2个稻瘟病抗性基因的水稻品种。主要结果如下:1)对来自巴基斯坦不同水稻种植区的25个不同水稻品种进行了褐叶斑病抗性鉴定,并测定了其叶绿素含量、株高、剑叶长、剑叶宽、穗长、穗数、颖花数和千粒重等农艺性状。抗性鉴定结果表明,没有品种对褐叶斑病存在免疫抗性,仅有2个品种(Winner和Diamond 121)达到高抗水平,12个品种达到中抗水平,其余品种均中感或高感褐叶斑病。此外,25个品种的相关农艺性状存在较大差异,表明本研究所选取的水稻品种具有较好的多样性。相比于接种前,23个品种在接种后的各农艺性状均显著降低,而2个抗性品种在接种处理后的相关农艺性状表现良好,进一步表明了培育抗病品种的重要性。2)利用78个SSR标记对25个品种进行基因分型,其中53个SSR标记存在多态性,各标记包含的等位变异在2-4之间,平均为2.359个;多态性信息含量(piC)在0.147～0.662之间,平均值为0.458利用上述标记的分型结果对25个品种进行聚类分析,发现这25个品种具有良好的遗传多样性。关联分析结果表明,6个SSR标记分别与穗数(RM1331)颖花数(RM3825、RM231)、株高(RM231)、剑叶长(RM267、RM424)和千粒重(RM561)显著相关,而标记RM542则与褐叶斑病发病率显著相关,且在该标记的3个等位变异中,含有等位变异ⅲ的品种的发病率显著高于含有其他2种等位变异的品种。这些相关标记位点上的优异等位变异可以进一步应用于相关性状的标记辅助育种中。3)在江苏著名商业化水稻品种南粳9108(NJ9108)背景下,利用CRISPR/Cas9技术,获得了含有广谱稻瘟病基因pi2 1和Bsr-d1的水稻品系。To代共获得25个转基因单株,经测序鉴定,有7个单株存在突变,其中,5个单株的bsr-d1发生突变,共计四种突变类型;2个单株的pi21发生突变,共计两种突变类型。通过加代后检测,最终在T1代获得了4种bsr-d1和3种pi21纯合敲除(NJ9108bsr-d1KO、NJ9108pi21KO)。进一步通过杂交,我们还获得了 4个双基因突变的F1单珠,后期将对上述转基因株系进行稻瘟病抗性鉴定。总的来说,本研究鉴定出两个高抗褐叶斑病的水稻品种,并创建了多个具有广谱抗稻瘟病基因的新品系,为后续的抗褐叶斑病基因挖掘及抗稻瘟病育种提供了益处。

关键词：水稻褐叶斑病稻瘟病 SSR标记 CRISPR/Cas9 pi21 bsr-d1

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对水稻BSR-D1、pi21和OSERF922基因编辑改良LK638S抗病性

对水稻BSR-D1、PI21和OSERF922基因编辑改良LK638S抗病性

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作者：许世冲华中农业大学

学位级别：硕士

隆科638S(LK638S)属中籼型温敏核不育系,其育性稳定、配合力强,但LK638S抗病性水平较弱,影响杂交水稻组合的推广和应用。已有研究表明Bsr-d1、pi21和Os ERF922的功能缺失可以增强抗病性,因此本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术突变LK6... 详细信息

隆科638S(LK638S)属中籼型温敏核不育系,其育性稳定、配合力强,但LK638S抗病性水平较弱,影响杂交水稻组合的推广和应用。已有研究表明Bsr-d1、pi21和Os ERF922的功能缺失可以增强抗病性,因此本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术突变LK638S的Bsr-d1、pi21和Os ERF92基因,改良LK638S的抗病性。主要研究结果如下:(1)本试验设计了由水稻U3启动子驱动、长20bp的guide RNA(g RNA)靶点,分别靶向编辑Bsr-d1第1、pi21第2和Os ERF922第1外显子,构建单基因和三基因编辑载体。在T代阳性转基因植株中,Bsr-d1、pi21和Os ERF922的单基因编辑位点的突变率分别为82%、68%和73%,其中纯合突变分别有7株、15株和8株,纯合突变率分别为25%、33%和24%;Bsr-d1、pi21和Os ERF922三基因都为纯合突变有3株。T代不含Cas9转基因元件的单株突变类型与T代一致。(2)自然病圃鉴定结果表明,单基因纯合突变株系bsr-d1-9、bsr-d1-12、pi21-1、pi21-2、erf922-1、erf922-2和三基因纯合突变株系bsr-d1pi21erf922-1、bsr-d1pi21erf922-2的稻瘟病病斑面积与LK638S相比显著降低,并且erf922突变体和三基因缺失突变体病斑面积比bsr-d1和pi21突变体显著减少。人工接种稻瘟病菌株试验结果表明与LK638S相比,突变体株系的病斑面积显著减少,并且erf922-1和bsr-d1pi21erf922-1突变体的病斑面积显著低于bsr-d1-9和pi21-1,与自然病圃鉴定结果一致。(3)突变体bsr-d1-9和bsr-d1-12中过氧化氢酶基因LOC＿Os01g73170、LOC＿Os05g04470和LOC＿Os10g39170的表达量显著降低,H2O2的含量显著增加。接种稻瘟病菌后突变体中SA和JA信号通路中防御相关基因在接种稻瘟病菌种24h后的表达水平显著高于LK638S。(4)此外,本研究还利用6个白叶枯病菌株鉴定突变体对白叶枯病的抗性。与LK638S相比,pi21-1对Fu J、PXO99、PXO61和PXO71四个生理小种抗性显著增强;erf922-1对Fu J、PXO86、PXO61和PXO71四个生理小种抗性显著增强;bsr-d1-9对六个生理小种抗性均无显著变化。我们推测LK638S背景下敲除pi21或Os ERF922基因可以提高LK638S对白叶枯病的抗性。基因表达分析显示接种白叶枯病菌72h后,pi21-1和erf922-1中SA和JA信号通路防御相关基因Os PR1a、Os PR1b、Os WRKY45和Os PR4表达均显著上调。这说明敲除pi21或Os ERF922增强了LK638S对白叶枯病的抗性,这可能与SA和JA信号通路相关防卫基因的激活有关。(5)对LK638S与突变体的农艺性状考察结果显示,三基因敲出突变体bsr-d1pi21erf922-1的株高和分蘖数显著低于LK638S,穗长和穗粒数无显著差异。单基因敲除突变体bsr-d1-9、pi21-1和erf922-1的株高、分蘖、穗长和穗粒数与LK638S相比差异不显著。

关键词：水稻 CRISPR/Cas9 稻瘟病白叶枯病 pi21 Bsr-d1 OsERF922

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水稻pi21基因RNAi植株的抗稻瘟病研究及转mCherry基因水稻的遗传分析

水稻Pi21基因RNAi植株的抗稻瘟病研究及转mCherry基因水稻的遗传...

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作者：李亚丽浙江师范大学

学位级别：硕士

稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea引起的广泛发生在世界各稻区的最重要水稻病害之一,也是限制水稻高产稳产的主要因素。目前,培育和利用抗病品种是经济、安全而且有效的措施。然而,稻瘟病是一种典型的寄主-病原菌共演化系统,其致病... 详细信息

稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea引起的广泛发生在世界各稻区的最重要水稻病害之一,也是限制水稻高产稳产的主要因素。目前,培育和利用抗病品种是经济、安全而且有效的措施。然而,稻瘟病是一种典型的寄主-病原菌共演化系统,其致病性变异和分化的结果往往造成垂直抗性的品种难以维持其抗病的持久性。因此,培育持久抗病品种成为目前水稻生产上的迫切要求。 pi21属于隐性遗传和数量性状抗病性,是第一个被定位的广谱持久抗稻瘟病基因。本研究以pi21基因3’端非编码区、终止子下游第17个碱基开始的275个碱基片段用于pi21干涉载体的构建（pLYL21）.将pLYL21载体转化到水稻日本晴胚性愈伤中,以sGFP作为报告基因获得了93个独立转化植株。对T0和T1代干涉株系进行pi21的半定量RT-PCR分析,结果表明相对于对照未转化日本晴,干涉株系中pi21的转录水平明显降低,且对稻瘟病表现抗性。接种稻瘟菌后分时段取样,对抗病相关基因进行半定量RT-PCR,结果显示,对照日本晴植株中OsWRKY28/ABC transporter-1和ABC transporter-2在12h后诱导表达,表达量增高,但在pi21干涉株系中的表达量明显降低,在干涉株系和未转化日本晴中,PR1、PAL和OsWRKY45基因在接种48h后得到诱导表达。另外,为了建立稻瘟菌与pi21-RNAi植株之间的可视化互作系统,本研究还通过PEG介导的方法将红色荧光蛋白基因转化到稻瘟菌菌株E2007-046A2中,并获得了稳定的转化子,为后续的实验提供材料。为了建立转基因水稻的高通量遗传分析系统,本研究还以粳稻成熟胚诱导的愈伤组织为受体材料,潮霉素磷酸转移酶（HPT）为抗性筛选标记,通过农杆菌介导的方法将红色荧光蛋白基因mCherry导入水稻。在水稻转化愈伤组织、转化植株（T0）和转基因后代（T1）均检测到红色荧光,证实mCherry在转基因水稻中稳定表达。139个独立转化株系的遗传分析表明,mCherry在转基因后代表现多种遗传模式,54%的转基因株系呈单位点遗传。TAIL-PCR进一步验证转基因整合到水稻基因组。根据T-DNA整合位点DNA序列分析结果,T-DNA左边界发生碱基缺失、增加和替换,右边界只发生碱基缺失,说明左边界比右边界有更多的碱基变异类型。此外,对T2代植株m Cherry和HPT的转录水平进行实时定量逆转录PCR分析,结果表明,m Cherry和HPT转录水平因T-DNA在水稻基因组中的整合位置而变化,表现位置效应。本研究在mCherry荧光蛋白和其它相关方法的基础上,为转基因水稻遗传及分子分析建立了一个高效的流程体系。

关键词：水稻稻瘟病 RNAi pi21 mCherry T-DNA

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利用RNA-Seq技术分析水稻稻瘟病持久抗性基因pi21的抗病机制

利用RNA-Seq技术分析水稻稻瘟病持久抗性基因pi21的抗病机制

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作者：赵建华浙江师范大学

学位级别：硕士

水稻(Oryza sativa)是世界上重要的粮食作物之一,而水稻稻瘟病等病害严重地制约着水稻的高产稳产。培育稻瘟病抗性品种尤其是持久抗性品种已成为治理水稻稻瘟病的主要方法之一。水稻稻瘟病持久抗性基因pi21在许多粳稻品种中存在,因此可... 详细信息

水稻(Oryza sativa)是世界上重要的粮食作物之一,而水稻稻瘟病等病害严重地制约着水稻的高产稳产。培育稻瘟病抗性品种尤其是持久抗性品种已成为治理水稻稻瘟病的主要方法之一。水稻稻瘟病持久抗性基因pi21在许多粳稻品种中存在,因此可以在世界范围内广泛使用,以提高水稻的稻瘟病抗性。本研究以受稻瘟病菌接种诱导的pi21-RNAi转基因系和日本晴为材料,利用RNA-Seq测序技术对水稻与稻瘟菌(Magnaporthe grisea)的互作进行研究,获得如下研究成果：1.本研究用两种稻瘟病菌生理小种(TMC-1和GUY11)分别接种pi21基因RNAi表达转基因系241材料(抗病)和日本晴(感病对照材料),并在接种后五个时间点(Oh、12h、24h、48h、72h)分别取样(叶片组织),共获得20份受稻瘟病菌诱导的材料。半定量RT-PCR分析病程相关基因(WRKY, ABC, Kinase, MYB, pathogen-related gene等五类基因)在接种材料中的表达量,发现抗感材料之间存在基因表达差异,并且材料在两种稻瘟菌诱导后表现出相似的表达量变化,说明稻瘟病菌接种实验效果较好,创制的材料能够反映pi21与稻瘟病菌之间的互作关系。2.采用RNA-Seq高通量测序技术对20个受稻瘟病菌诱导的水稻材料进行测序,共获得约217M的Clean Reads,占Raw Reads的比例高达97.41%。每个样品的Clean Reads数都在10M以上,测得的碱基数在500Mb以上。利用SOAP短序列比对软件将Clean Reads比对到水稻粳稻品种日本晴基因组序列上(允许两个碱基错配),结果显示,17个样品的比对比例在86.97%以上,另外3个样品TMC-Nip-72h (75.85%)、GUY-Nip-72h (68.54%)、TMC-241-72h (75.19%)的比对比例相对较低。将Clean Reads比对到日本晴基因序列上时,也获得一致的比对结果。测序饱和度分析显示,当Clean Reads数大于10M时,测序深度已达到饱和。序列在基因的5’-3’方向分布大致均匀,说明样品mRNA打断随机性好。这些指标均说明测序的数据质量比较高。3.利用RPKM法计算每个样品中43222个水稻基因的基因表达量,发现每个样品全部基因的RPKM平均值介于15.2～16.9之间,说明20个样品mRNA转录的总水平一致。在|log2Ratio|≥1且FDR≤0.001的条件下,对两两样品之间的差异表达基因进行筛选。这些差异基因为下一步筛选与pi21抗病相关的基因奠定了基础。4.本研究通过设置较为严格的差异表达基因筛选方法,在全基因组范围内筛选可能与pi21互作的基因。经过半定量RT-PCR以及qPCR验证,我们初步认为OspiG1基因在pi21介导的非小种特异性持久抗病反应途径中起到重要的作用。OspiG1基因的进一步研究可以为我们更好地了解pi21的抗病机制提供线索。

关键词：水稻稻瘟病抗性基因 pi21 RNA-Seq 机制

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水稻抗稻瘟病PTI相关基因的筛选及抗稻瘟病pi21基因编辑材料的创制

水稻抗稻瘟病PTI相关基因的筛选及抗稻瘟病pi21基因编辑材料的创制

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作者：杨海河浙江师范大学

学位级别：硕士

水稻稻瘟病是由稻瘟菌引起的具有破坏性的水稻病害之一,在全世界各稻区均有发生。主效抗病基因控制的稻瘟病抗性会随着稻瘟病菌菌系的改变而丧失抗性。因此,开发利用抗稻瘟病育种新策略和新技术,已成为水稻育种的迫切要求。本研究基于... 详细信息

水稻稻瘟病是由稻瘟菌引起的具有破坏性的水稻病害之一,在全世界各稻区均有发生。主效抗病基因控制的稻瘟病抗性会随着稻瘟病菌菌系的改变而丧失抗性。因此,开发利用抗稻瘟病育种新策略和新技术,已成为水稻育种的迫切要求。本研究基于病原相关分子模式诱导的植物免疫途径(pathogen associated molecular patterns(PAMP)-triggered immunity,PTI),利用候选水稻基因的 RNAi转基因株系,接种稻瘟病菌,筛选抗稻瘟病基因。同时,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,对水稻品种日本晴的pi21基因进行定点突变,获得抗稻瘟病水稻株系。主要研究结果为:(1)实验室以水稻品种TJ394为受体材料,创制出水稻稻瘟病应答基因的RNAi株系。本研究对TJ394进行苗期抗稻瘟病接种试验,鉴定出致病菌系98019A,TMC-1、RO1-1、ROR-1和318-2。其中TMC-1菌系产孢量高并且对TJ394致病,被选用于鉴定RNAi株系和TJ394的抗病差异。(2)利用“微室”喷雾接种技术,对34个水稻稻瘟病应答基因的RNAi株系进行稻瘟病抗性鉴定。通过多次稻瘟病菌接种试验,发现XY23的7个独立转化株系病级比TJ394低0.6-1.3级,并呈显著水平;XY14的3个独立转化株系病级比TJ394低0.7-1.1级,均呈显著差异。XY23和XY14 RNAi多个独立转化株系均提高了水稻对稻瘟病的抗性,说明XY23和XY14是水稻抗稻瘟病相关基因。(3)利用CRISPR-Cas9技术,对感稻瘟病品种日本晴pi21基因进行定点突变,获得了抗稻瘟病的pi21隐性突变株系。86.7%的To植株的pi21靶序列发生了碱基改变。通过T-DNA序列的PCR检测,剔除携带T-DNA的T1代分离植株,从23个T1转基因系中筛选获得107株不含T-DNA转基因序列的植株。然后对pi21的编辑位点进行酶切和测序分析,在107株中有21株pi21纯合突变体。对1个pi21突变株系进行稻瘟病菌孢子喷雾接种,与未转化日本晴相比,突变株系显著抗病。qRT-PCR分析结果显示,与日本晴比较,pi21突变株系在接种稻瘟病菌后,病程相关基因PR1b、PR2、PR3、PBZ1、E2F和PDR诱导表达的速度更快,表达量更高。

关键词：水稻稻瘟病 PTI 抗性基因 pi21 CRISPR/Cas9

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