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南京农业大学学报 2015年第4期38卷 645-649页

作者：王曼祁克宗涂健周秀红刘红梅王惠珂尹磊安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036

[目的]建立检测禽致病性大肠杆菌phop蛋白调控宿主菌DNA的方法,为进一步研究phop蛋白的调控因子奠定基础。[方法]将pho P基因克隆至p MD19-T载体,序列鉴定正确后转至表达载体pET32a,将重组质粒pET32a-phop导入感受态细菌BL21(DE3),IPTG... 详细信息

[目的]建立检测禽致病性大肠杆菌phop蛋白调控宿主菌DNA的方法,为进一步研究phop蛋白的调控因子奠定基础。[方法]将pho P基因克隆至p MD19-T载体,序列鉴定正确后转至表达载体pET32a,将重组质粒pET32a-phop导入感受态细菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的大小,用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组phop蛋白。通过生物信息学分析法对phop蛋白与DNA的结合基序进行预测,利用凝胶迁移试验(EMSA)鉴定该蛋白的结合活性。[结果]酶切及测序结果表明原核表达质粒构建正确;SDS-PAGE结果表明目的基因得到表达;重组目的蛋白相对分子质量约为42.9×103;用Ni-NTA亲和层析柱成功纯化获得了纯度大于90%的目的蛋白;凝胶迁移试验结果表明phop蛋白能够结合血清毒力基因iss和溶血基因hly F启动子区。[结论]禽致病性大肠杆菌phop重组蛋白成功表达且有结合iss和hly F基因启动子区的功能活性,说明phop蛋白能够调控iss和hly F的表达。

关键词：禽致病性大肠杆菌 phop蛋白宿主菌DNA 检测方法

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结核分枝杆菌Rv0757基因的原核表达及其编码蛋白对巨噬细胞功能的影响

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四川大学学报（医学版） 2015年第3期46卷 359-362页

作者：杨玉涛鲍朗谷冬晴陈卫四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室成都610041

目的构建结核杆菌Rv0757基因原核表达重组质粒pET28a-Rv0757,并研究表达的目标蛋白对小鼠骨髓巨噬细胞株ANA-1细胞的作用。方法将扩增出的Rv0757基因重组到原核表达质粒pET28a(+),并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定诱导表达的目的蛋白... 详细信息

目的构建结核杆菌Rv0757基因原核表达重组质粒pET28a-Rv0757,并研究表达的目标蛋白对小鼠骨髓巨噬细胞株ANA-1细胞的作用。方法将扩增出的Rv0757基因重组到原核表达质粒pET28a(+),并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定诱导表达的目的蛋白。纯化目标蛋白后将目标蛋白phop作用于小鼠ANA-1细胞,检测活细胞数、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、一氧化氮(NO)和细胞凋亡指标。结果成功构建出pET28a-Rv0757原核表达质粒,诱导表达的目标蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定分析,其相对分子质量约为32×103。目的蛋白作用于小鼠ANA-1细胞后对活细胞数和细胞上清LDH活力无明显影响,但可以明显抑制细胞释放NO和细胞凋亡。结论本研究成功构建了原核表达载体pET28a-Rv0757,并成功表达出目标蛋白,该蛋白对小鼠ANA-1细胞没有毒性损伤,但可以抑制细胞释放NO和细胞的凋亡。

关键词：结核分枝杆菌 Rv0757基因 phop蛋白巨噬细胞功能

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结核分枝杆菌phop-PhoR双组分系统研究进展

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中国畜牧兽医 2018年第11期45卷 3253-3260页

作者：郭佳成任宁宁郭爱珍陈颖钰华中农业大学动物医学院武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 湖北省兽医流行病学国际科技合作基地武汉430070

双组分信号转导系统广泛存在于各种原核生物中,其基本结构为1个组氨酸激酶(HK)和1个反应调节剂(RR),该系统能够感知外界刺激并作出反应,使细菌能适应各种不利环境且能增强细菌在宿主体内的生存能力,对细菌的毒力和生长至关重要。文章概... 详细信息

双组分信号转导系统广泛存在于各种原核生物中,其基本结构为1个组氨酸激酶(HK)和1个反应调节剂(RR),该系统能够感知外界刺激并作出反应,使细菌能适应各种不利环境且能增强细菌在宿主体内的生存能力,对细菌的毒力和生长至关重要。文章概述了结核分枝杆菌DosS/DosT-DosR、MprA-MprB、PrrA-PrrB、phopPhoR等12个双组分系统,重点介绍了phop-PhoR双组分系统的结构与功能。phop-PhoR是结核分枝杆菌最基本、最重要的双组分系统之一,由感受器PhoR和效应器phop组成,其中PhoR可以接受Mg2+、Cl-或H+等外界刺激,进而驱动phop对靶基因的转录表达进行调控。phop作为一种效应蛋白,经过晶体结构解析发现,其可通过与DNA结合来实现对靶基因的调控,具体包括对细胞壁组成的控制、对脂类代谢和pH的调节、对结核分枝杆菌毒力网络的调控。此外,文章还介绍了phop突变株作为疫苗候选株所具有的优势,包括phop突变株在小鼠模型中毒力减弱,并且免疫恒河猴及豚鼠后均有一定的免疫保护性等,表明phop突变株具有较好的疫苗开发潜力。作者通过对phop-PhoR双组分系统的结构与功能,以及phop突变株作为疫苗候选株的研究进行综述,旨在为结核分枝杆菌的毒力机制和人类结核病疫苗的研究提供理论依据。

关键词：结核分枝杆菌 phop-PhoR双组分系统 phop蛋白 phop突变体

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禽致病性大肠杆菌ybjX、pagp缺失株生物学特性及其与phop的相关性研究

禽致病性大肠杆菌ybjX、pagp缺失株生物学特性及其与PhoP的相关性...

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作者：李春晓安徽农业大学

学位级别：硕士

phop/Q二元调控系统广泛存在于禽致病性大肠杆菌中,其可通过调控与内毒素(LPS)相关基因的表达诱导应答基因的防御性表达。而应答基因的表达水平与APEC的自身致病力有很大关系。抗抗菌肽基因(AMPR)通过直接或间接修饰LPS,改变细菌的外膜... 详细信息

phop/Q二元调控系统广泛存在于禽致病性大肠杆菌中,其可通过调控与内毒素(LPS)相关基因的表达诱导应答基因的防御性表达。而应答基因的表达水平与APEC的自身致病力有很大关系。抗抗菌肽基因(AMPR)通过直接或间接修饰LPS,改变细菌的外膜结构加强细菌抵抗宿主抗微生物因子的渗透能力,从而有助于对抗菌肽的抵抗。本研究在前期基因芯片的基础上筛选出可能与抗抗菌肽相关的基因ybjX、pagp,探究ybjX、pagp基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性及两个基因与phop相关性的研究。通过引物设计,PCR扩增结果表明,成功克隆出菌株中的ybjX、pagp序列并利用Red同源重组系统成功构建ybjX、pagp缺失株。在此基础上利用质粒pSTV28a构建了基因回复株。并对AE17与ybjX、pagp基因缺失株和回复株的生物学特性展开研究。在了解ybjX和pagp缺失对其生物学研究的基础上进一步研究ybjX,pagp受phop的调控机制、以及对阳离子抗菌肽的抗性。具体研究内容和结果如下:1.禽致病性大肠杆菌ybjX和pagp基因缺失株及回复株的构建AE17(对氯霉素和氨苄青霉素敏感)为本实验室保存的O2血清型禽致病性大肠杆菌菌株。本实验利用Red同源重组技术对分别对ybjX基因和pagp基因进行缺失,成功构建两株单基因缺失株(ΔybjX和Δpagp)并使用低拷贝质粒pSTV-28a对两株基因缺失株进行基因回复,成功构建基因回复株CybjX、Cpagp。2.ybjX和pagp基因缺失其生物学特性的评价本实验通过生长曲线的测定、运动性能力的检测、环境耐受试验和生物被膜形成能力检测、外膜渗透性试验、CEF细胞黏附和入侵试验和LD50的测定,探索pagp和ybjX基因缺失株对APEC生物学特性的影响。在LB液体培养基中的生长性能ybjX基因缺失株和回复株较野生株未发生明显改变;而相同条件下pagp基因缺失株和野生株生长性能比较发生明显改变。运动性能力的检测结果表明ybjX和pagp基因的缺失未能影响AE17的运动性能力。环境耐受试验表明ybjX、pagp缺失株对酸性环境的抵抗力较野生株分别降低2.2倍(pphop蛋白的相关性分析重组BL21-pET32a/phop表达重组蛋白鉴定分子量为42.9 KDa与其理论分子量相一致。并对表达的蛋白通过Ni-NTA亲和层析柱纯化进行纯化。在Genbank上查找APEC O1血清型的ybjX和pagp基因序列,利用Promoter prediction网站,预测ybjX、pagp两个基因对应的启动子序列,利用EMSA验证phop蛋白是否能够结合上述两个基因的启动子。研究结果显示ybjX、pagp受phop蛋白的间接调控。4.AE17与ybjX和pagp缺失株对阳离子抗菌肽抗性的比较本研究比较野生株、ybjX和pagp缺失株对多粘菌素B、AVBD2的敏感性。记录抑菌圈的直径结果表明两个缺失株对多粘菌素B、AVBD2的抵抗能力都显著降低。通过以上实验成功构建APEC ybjX和pagp单基因缺失株,结果显示ybjX和pagp基因的缺失对CEF细胞和机体致病力均下降。证明了phop调控子对ybjX和pagp不能直接调控;ybjX和pagp缺失使AE17对抗菌肽的敏感性增强。初步证明了这些基因在禽致病性大肠杆菌中极可能参与抵抗宿主的先天性免疫防御,对生长代谢等的调控,如脂多糖的合成,细胞膜的形成以及药物敏感性

关键词：禽致病性大肠杆菌 ybjX pagp 基因缺失生物学特性 phop蛋白

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