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作者：史河秀福建医科大学

学位级别：硕士

目的:观察抗氧化酶peroxiredoxinⅰ和Ⅱ( PrxⅠ和Ⅱ)在昆明小鼠输卵管和子宫的分布及其周期性变化。观察PrxⅡ对昆明小鼠植入前胚发育和克服2-细胞阻滞的作用。方法:1.免疫组织化学方法观察PrxⅠ和Ⅱ在昆明小鼠输卵管和子宫的分布。2.... 详细信息

目的:观察抗氧化酶peroxiredoxinⅰ和Ⅱ( PrxⅠ和Ⅱ)在昆明小鼠输卵管和子宫的分布及其周期性变化。观察PrxⅡ对昆明小鼠植入前胚发育和克服2-细胞阻滞的作用。方法:1.免疫组织化学方法观察PrxⅠ和Ⅱ在昆明小鼠输卵管和子宫的分布。2.蛋白免疫印迹技术检测PrxⅠ和Ⅱ在小鼠动情期和动情间期的表达变化。3.收集昆明小鼠1-细胞胚,采用微滴培养法连续培养,观察在M16培养液中添加PrxⅡ蛋白对植入前胚发育的影响,观察其是否能克服2-细胞阻滞。4.收集昆明小鼠(阻滞品系小鼠)和B6C3F1小鼠(非阻滞品系小鼠)1-细胞胚,采用微滴培养法连续培养,观察在M16培养液(37℃、5%CO2和饱和湿度培养条件下)各自的发育情况。5.应用激光共聚焦扫描显微镜技术结合特异性荧光探针2’, 7’二氯荧光黄双乙酸酯,检测昆明小鼠体外培养与体内发育2-细胞胚以及昆明小鼠与B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚内活性氧自由基(ROS)水平差异。结果:1.在输卵管中,PrxⅠ和Ⅱ免疫阳性反应见于输卵管上皮;而子宫内,PrxⅠ免疫阳性反应分布于内膜上皮、腺体上皮和内膜基质内细胞,而PrxⅡ主要见于内膜基质内细胞。2.蛋白免疫印迹技术也显示这两型蛋白在输卵管和子宫均表达,动情期和动情间期这两型蛋白在输卵管和子宫中的表达水平无显著性差异。3.昆明小鼠1-细胞胚在添加PrxⅡ蛋白的M16培养液中培养,其4-细胞胚发育率与对照组无显著性差异。4.昆明小鼠1-细胞胚在M16中培养多数停滞于2-细胞期,基本无法发育至囊胚;而B6C3F1小鼠1-细胞胚发育良好,绝大多数可越过2-细胞期且大多数可发育至囊胚,两者的4-细胞胚和囊胚发育率均有显著性差异。5.昆明小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平显著低于体内发育2-细胞胚,差别有显著性意义;亦低于B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚内ROS水平,但差别无显著性意义。结论:抗氧化酶PrxⅠ与Ⅱ在输卵管和子宫中表达稳定,可能为受精和胚胎发育提供抗氧化的良好微环境。但是PrxⅡ对昆明小鼠植入前胚发育无明显作用,不能克服2-细胞阻滞,这可能是体外培养2-细胞胚内ROS并不高的缘故,提示正常培养条件下,胚内ROS水平升高或许并不是引起昆明小鼠2-细胞阻滞的主要原因。

关键词： peroxiredoxinⅰ peroxiredoxinⅡ 输卵管子宫 2-细胞阻滞植入前胚 ROS 小鼠

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人源抗peroxiredoxinⅰ肺腺癌噬菌体抗体的制备及鉴定

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南方医科大学学报 2010年第1期30卷 30-34页

作者：罗弋庞华李淑杰曹辉李少林樊春波王洁重庆医科大学放射医学教研室重庆400016 重庆医科大学附属第一医院核医学科重庆400016

目的构建人源噬菌体抗体库,从中筛选出抗peroxiredoxinⅰ(PrxⅠ)肺腺癌人源单链抗体。方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗... 详细信息

目的构建人源噬菌体抗体库,从中筛选出抗peroxiredoxinⅰ(PrxⅠ)肺腺癌人源单链抗体。方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗体(ScFv);将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。PCR检测TG1中ScFv基因插入率;1%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;以肺腺癌细胞株D549及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxI为靶抗原对抗体库进行筛选富集。将阳性克隆用IPTG诱导表达。用SDS-PAGE及Westernblotting鉴定该抗体;用ELISA法、免疫细胞化学法鉴定该抗体与人肺腺癌细胞的结合特异性。结果成功构建噬菌体单链抗体库。ScFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为60%。SDS-PAGE及Westernblotting证实抗体得到可溶表达。ELISA及免疫细胞化学检测表明抗体能相对特异地与肺腺癌细胞结合。结论成功构建肺腺癌人源噬菌体抗体库,并从中筛选得到能相对特异地与高表达PrxI的肺腺癌细胞D549结合的单链抗体。

关键词：噬菌体抗体库单链抗体 peroxiredoxinⅰ 肺腺癌

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靶向peroxiredoxinⅰ基因的shRNA真核表达载体的构建及生物学功能鉴定

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第三军医大学学报 2011年第2期33卷 132-136页

作者：郭启帅黄曦张俊李少林重庆医科大学放射医学教研室重庆400016 重庆市合川区人民医院肿瘤科重庆401520

目的构建针对peroxiredoxinⅰ(PrxⅠ)基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,观察下调PrxⅠ基因表达后对乳腺癌MCF-7细胞生物学功能的影响。方法构建针对PrxⅠ基因的shRNA真核表达载体,经酶切和测序鉴定正确后,转染入... 详细信息

目的构建针对peroxiredoxinⅰ(PrxⅠ)基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,观察下调PrxⅠ基因表达后对乳腺癌MCF-7细胞生物学功能的影响。方法构建针对PrxⅠ基因的shRNA真核表达载体,经酶切和测序鉴定正确后,转染入乳腺癌MCF-7细胞。流式细胞术检测细胞转染效率,RT-PCR及Western blot分别检测干扰前后PrxⅠmRNA和蛋白表达,MTT法及流式细胞术检测干扰前后乳腺癌MCF-7细胞体外的增殖情况及细胞周期和细胞凋亡。结果成功构建真核表达载体pGPU6-HK、pGPU6-Prx1、pGPU6-Prx2、pGPU6-Prx3、pGPU6-Prx4,并转染入乳腺癌MCF-7细胞中,转染率为80%左右,RT-PCR及Westernblot分析表明转染pGPU6-Prx1、pGPU6-Prx2、pGPU6-Prx3、pG-PU6-Prx4后的细胞EGFR mRNA和蛋白表达均不同程度地受抑,以pGPU6-Prx3为甚,其mRNA和蛋白表达抑制率分别为82.6%和80.5%。与未转染组和pGPU6-HK组相比,pGPU6-Prx3组的细胞生长明显延迟(P<0.05),细胞凋亡率显著增加,G1期细胞明显增多,而S期细胞减少(P<0.05)。结论靶向PrxⅠ基因的shRNA真核表达载体构建成功,能够特异性下调乳腺癌MCF-7细胞的PrxⅠ基因的表达,并明显抑制乳腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,调控细胞周期再分布。

关键词： RNA干扰 peroxiredoxinⅰ 乳腺癌

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沉默peroxiredoxinⅰ基因增强乳腺癌细胞放射敏感性及其作用机制的实验研究

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第三军医大学学报 2011年第16期33卷 1682-1686页

作者：郭启帅黄曦李少林重庆医科大学放射医学教研室重庆400016 重庆市合川区人民医院肿瘤血液科重庆401520

目的采用RNA干扰技术沉默过氧化物酶Ⅰ(peroxiredoxinⅰ,PrxⅠ)基因,观察乳腺癌MCF-7细胞对X线敏感性变化,探讨其作用机制。方法将PrxⅠshRNA真核表达载体pGPU6-PrxⅠ和阴性对照质粒pGPU6-HK转染入乳腺癌MCF-7细胞中,经G418稳定筛选后RT... 详细信息

目的采用RNA干扰技术沉默过氧化物酶Ⅰ(peroxiredoxinⅰ,PrxⅠ)基因,观察乳腺癌MCF-7细胞对X线敏感性变化,探讨其作用机制。方法将PrxⅠshRNA真核表达载体pGPU6-PrxⅠ和阴性对照质粒pGPU6-HK转染入乳腺癌MCF-7细胞中,经G418稳定筛选后RT-PCR和Western blot检测PrxⅠ表达变化。6 MV X线照射6 Gy后48 h,流式细胞术检测细胞的活性氧水平、细胞周期和细胞凋亡;MTT法测定细胞增殖能力;克隆形成实验观察克隆形成率,计算Do、N、Dq、SF2及放射增敏比(sensitive enhancement ratio,SER)等放射生物学参数,Western blot法检测Rad51及γ-H2AX蛋白变化。结果获得2个稳定转染细胞株:pGPU6-HK和pGPU6-PrxⅠ。RT-PCR和Western bolt检测显示pGPU6-PrxⅠ组中PrxⅠmRNA和蛋白表达均明显抑制。6 Gy的X线照射48 h后,pGPU6-PrxⅠ及联合照射(ionizing radiation,IR)组细胞中的活性氧水平、G1期细胞和细胞凋亡明显增加,而细胞增殖能力和S期细胞明显降低,Western blot分析表明Rad51蛋白表达降低,而γ-H2AX蛋白表达升高(P<0.05),以pGPU6-PrxⅠ+IR组变化最显著,其Rad51蛋白表达下降了79.3%,而γ-H2AX蛋白表达升高了3.7倍。pGPU6-PrxⅠ组细胞的Do、N、Dq和SF2值分别为1.354、3.106、1.547和0.504,均低于pG-PU6-HK组,SF2时的SER为1.353。结论下调PrxⅠ基因表达可提高乳腺癌MCF-7细胞的放射敏感性,其作用机制与细胞内活性氧清除能力减弱、DNA双链断裂增加及DNA损伤后修复能力降低有关。PrxⅠ可能是1个理想的肿瘤放射增敏分子靶点。

关键词： peroxiredoxinⅰ 放射敏感性活性氧基因沉默

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Cloning and expression of mouse peroxiredoxin I in 1EC-6 Cells

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World Journal of Gastroenterology 2004年第14期10卷 2109-2112页

作者： BoZhang Yong-PingSu TaoWang Feng-ChaoWang Guo-PingAi HuiXu Jun-PingWang Yue-ShengHuang Jian-XinJiang InstituteofCombinedInjuryofPLA StateKeyLaboratoryofTraumaBurnsandCombinedInjuryThirdMilitaryMedicalUniversityChongqing400038China

AIM: To clone and express mouse peroxiredoxin Ⅰ in IEC-6 ***: Total RNAs were isolated from cultured IEC-6 cells, and the coding region of peroxiredoxin I was amplified by RT-PCR. After it was cloned into T-vector and sequenced,pSG5 was used to transiently express peroxiredoxin I in IEC-6 by liposome-mediated transfection, and the expression of peroxiredoxin I was evaluated by RT-PCRand Western blot. RESULTS: A DNA fragment about 750 bp was amplified from total RNAs of IEC-6 cells using specific primers of peroxiredoxin Ⅰ. The sequencing confirmed the coding region was successfully cloned into T-vector, which was completely coincident with the sequence in GeneBank. After the EcoRI-BamHI fragment of T-vector containing peroxiredoxin I was inserted into pSG5, the recombinant plasmid was transferred to IEC-6 cells. RT-PCR assay showed that a DNA fragment of 930 bp could be amplified,which indicated the transcription of pSG5-Prx. Western blot confirmed the expression of peroxiredoxin Ⅰ in IEC-6 ***: Mouse peroxiredoxin I can be successfully expressed in IEC-6 cells.

关键词：无性繁殖基因表达老鼠 peroxiredoxinⅰ IEC-6细胞重组器官

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