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生物医学工程学杂志 2005年第2期22卷 371-373页

作者：李培旭李尚为彭芝兰马黔红黄仲英李蕾唐宗蓉韩字研四川大学华西第二医院妇产科成都610041

探索简单、适用的体外分离睾丸组织中成熟精子的方法,以用于男性无精子症病人行卵母细胞内单精子注射受精-胚胎移植为目的。用含不同浓度透明质酸酶的10 %人血白蛋白人类输卵管液培养人睾丸曲细精管组织匀浆2 4 h,再用percoll梯度离心... 详细信息

探索简单、适用的体外分离睾丸组织中成熟精子的方法,以用于男性无精子症病人行卵母细胞内单精子注射受精-胚胎移植为目的。用含不同浓度透明质酸酶的10 %人血白蛋白人类输卵管液培养人睾丸曲细精管组织匀浆2 4 h,再用percoll梯度离心法洗涤后计算所获各级精子的总数,并设置前后对照和空白对照进行比较。用不同浓度透明质酸酶处理后的4个实验组分别与2个对照组比较,实验组所获得的各级精子的总数高于对照组,有显著差异(P0 .0 5 )。而用浓度为2 0 0 u/ ml的10 %人血白蛋白人类输卵管液处理组获得的各级精子的总数与其它浓度处理组之间比较存在统计学差异(Ppercoll梯度离心可从人睾丸曲细精管组织匀浆中分离出较多更纯的成熟精子,但过高浓度的透明质酸酶可能会影响分离出的精子的活动能力。

关键词：睾丸精子透明质酸酶 percoll梯度离心成熟精子睾丸组织 percoll梯度离心法分离方法卵母细胞内单精子注射睾丸曲细精管人血白蛋白

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小鼠睾丸精子细胞的分离与鉴定

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中华男科学杂志 2002年第1期8卷 28-31页

作者：朱培元黄宇烽徐建平南京医科大学病原生物学和免疫学学系江苏南京210029 南京军区南京总医院生殖遗传研究室江苏南京210002

目的 :建立一种简单、可有效分离小鼠睾丸精子细胞的方法。　方法 :用组合酶消化成年小鼠睾丸制备睾丸细胞悬液 ,然后经 6层非连续percoll梯度 (15 %、2 2 %、30 %、4 0 %、5 0 %和 6 0 % )离心法分离 ,通过形态学和流式细胞术鉴定各个P... 详细信息

目的 :建立一种简单、可有效分离小鼠睾丸精子细胞的方法。　方法 :用组合酶消化成年小鼠睾丸制备睾丸细胞悬液 ,然后经 6层非连续percoll梯度 (15 %、2 2 %、30 %、4 0 %、5 0 %和 6 0 % )离心法分离 ,通过形态学和流式细胞术鉴定各个percoll梯度中精子细胞的含量 ,并以伊红Y排斥试验测定细胞的存活率。　结果 :组合酶消化后获得的睾丸细胞悬液中 ,97%以上细胞仍然存活。经percoll梯度离心 ,共形成 6条细胞带 ,其中 2 2 %梯度中主要为精子细胞 (平均 86 .7% ,P 梯度中细胞密度最高 (P percoll梯度离心法。

关键词：精子细胞 percoll梯度离心睾丸分离鉴定组合酶消化

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不育病人精液中精子细胞的分离与鉴定

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中华男科学杂志 2002年第6期8卷 404-407页

作者：朱培元黄宇烽崔英霞胡毓安徐建平南京军区南京总医院生殖遗传研究室江苏南京210002

目的 :建立一种可从不育病人精液中分离出较多、较纯精子细胞的新方法。　方法 :收集 15例含细胞成分的不育病人精液 ,利用一种改良的非连续percoll梯度 (15 %、2 2 %、30 %、4 0 %、5 0 %和 6 0 % )离心法分离精子细胞。于 18℃ 2 0 0 ... 详细信息

目的 :建立一种可从不育病人精液中分离出较多、较纯精子细胞的新方法。　方法 :收集 15例含细胞成分的不育病人精液 ,利用一种改良的非连续percoll梯度 (15 %、2 2 %、30 %、4 0 %、5 0 %和 6 0 % )离心法分离精子细胞。于 18℃ 2 0 0 0r/min离心 30min后 ,精液细胞被分成单个的细胞组分 ;然后通过细胞计数、形态学、流式细胞术 (FCM )和免疫细胞化学等方法进行分析 ,选择含精子细胞纯度最高的组分。　结果 :经percoll梯度离心后获得6个细胞组分 ,形态学和FCM分析表明 ,2 2 %组分中主要为精子细胞 [(91.85± 5 .18) % ,P percoll梯度离心法 ,可从不育病人的精液中分离到较多。

关键词：精液精子细胞 percoll梯度离心男性不育

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小鼠睾丸及不育患者精液中精子细胞的分离与鉴定

小鼠睾丸及不育患者精液中精子细胞的分离与鉴定

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作者：朱培元南京医科大学

学位级别：硕士

1995年，人类首次利用圆形精子细胞和长形精子细胞体外授精获得成功后，预示着精子细胞显微注射授精可用于治疗临床无法治愈的男性不育患者。目前，完全不能产生精子的非梗阻性无精子症（non-obstmctive azoospermia,NOA）患者可采用卵... 详细信息

1995年，人类首次利用圆形精子细胞和长形精子细胞体外授精获得成功后，预示着精子细胞显微注射授精可用于治疗临床无法治愈的男性不育患者。目前，完全不能产生精子的非梗阻性无精子症（non-obstmctive azoospermia,NOA）患者可采用卵胞质内圆形精子细胞注射（round spermatid injection,ROSI）或长形精子细胞注射（elongated spermatid inection,ELSI）治疗，精子细胞可从精液或从睾丸活检组织中获取。甚至已经有采用冻融睾丸组织中精子细胞行ROSI后获得持续妊娠的报告。但精子细胞的受精率和妊娠率令人失望，限制这项技术成功和阻碍其临床应用的许多问题仍然没有解决。除精子细胞的核蛋白不完全成熟及卵子激活不足等因素外，如何正确选择存活精子细胞是个难题，如圆形精子细胞与精母细胞、单核细胞和多形核白细胞等其他圆形细胞的区分就比较困难。另一方面，已经报道了多种不同的方法可从睾丸中分离精子细胞。最常用的是机械方法，即利用细针将活检获得的小块睾丸组织撕开，释放出精子细胞;也可利用酶将睾丸组织消化成细胞悬液，其中包含所有类型的生精细胞。然后在显微镜下从中手工选择精子细胞供立即穿刺使用，但不可能获得大量纯化的精子细胞，而反复活检获取精子细胞将进一步损伤患者已有缺陷的睾丸精曲小管（seminiferous tubules）。因此，有必要建立一种比较简单的、可获取大量纯化精子细胞的方法，不但可满足立即使用所需，也可进行冷冻保存用于以后的治疗周期。在第一部分试验中，首先利用连续3次组合酶消化成年小鼠睾丸制备睾丸细胞悬液，然后经6层非连续percoll梯度离心法（15％、22％、30％、40％、50％和60％）分离，通过形态学和流式细胞术鉴定南京医科大学硕士学位论文各个percoll组分中精子细胞的含量，并以伊红Y排斥试验测定细胞的存活率。结果组合酶消化后获得的睾丸细胞悬液中，97％以上的细胞仍然存活。经k。u梯度离。c后形成的6个组分中，22％Percu 组分主要含精子细胞（平均占86．7oho．05）85．5％以上细胞存活;6 30Opercoll组分中细胞密度最高po0．05)，含有各级来成熟生精细胞，存活细胞超过92％。因此采用组合酶消化结合非连续percoll 梯度离。G法，可有效地从小鼠睾丸中分离到较多较纯的存活精子细胞。将获得的小鼠精子细胞进行卵胞质内注射，共穿刺32个小鼠卵子，15个行 ROSI和 17个行 ELSI。结果在培养的 3 d中，ROSI的卵子没有发生卵裂，＆ ELSI的卵子中有 3个服至 2细胞期O7．6O)。在第H部分试验中，利用这种非连续 percoll梯度离。c法，对 15 例各种类型不育患者的精液细胞进行分离，并利用瑞－姬染色法、流式细胞术、免疫细胞化学和荧光原位杂交oISffi等方法，从细胞形态特征、DNA倍体、细胞表面标i己与分化抗原，以及原位杂交信号的数目和位置结合细胞核特有的形态等方面加以鉴定。结果效果更好，可分离出足够数量的精子细胞，还可将精子和白细胞与禾成熟生精细胞分离。其中 22％percoll组分中单倍体（In）精子细胞平均占四．85 t 5．18)％，显著高于其他组分(＜0．005X 平均密度为（l．010 i 0．786） xlo’／ml;而精子和白细胞王要位于 60％的 percoll组分中。

关键词：精子细胞非连续 percoll梯度离心小鼠男性不育精液免疫细胞化学流式细胞术荧光原位杂交

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