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peli1与PLK1相互作用在骨肉瘤进展中的机制研究

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PELI1与PLK1相互作用在骨肉瘤进展中的机制研究

作者：郭宇宏南昌大学

学位级别：硕士

目的:大量研究发现peli1在肿瘤发生和发展的过程中起到重要作用,它涉及到多个通路的交叉和激活,然而,peli1在骨肉瘤中的作用机制尚不确切。本研究的主要目的是探索peli1在骨肉瘤进展中的具体作用和调控机制,为骨肉瘤的诊疗提供新的思路... 详细信息

目的:大量研究发现peli1在肿瘤发生和发展的过程中起到重要作用,它涉及到多个通路的交叉和激活,然而,peli1在骨肉瘤中的作用机制尚不确切。本研究的主要目的是探索peli1在骨肉瘤进展中的具体作用和调控机制,为骨肉瘤的诊疗提供新的思路,最终应用于临床。方法:首先通过免疫组织化学技术检测骨肉瘤组织与癌旁组织中peli1的表达情况,然后使用实时荧光定量PCR技术检测peli1在不同骨肉瘤细胞系中的表达水平,挑选143B（基因敲低）、U2R（过表达）、U2OS、MG63这四种细胞株进行peli1的功能研究。我们在不同骨肉瘤细胞系中敲低或过表达peli1,通过一系列的细胞功能实验:包括MTT比色法、细胞划痕实验、Transwell实验、克隆形成实验以及流式检测细胞周期和凋亡等,研究peli1在骨肉瘤细胞增殖和迁移过程中所发挥的作用。之后使用GEPIA数据库分析peli1在肉瘤组织中的表达情况,对peli1进行串联亲和纯化质谱分析（TAP-MS）,筛选出与peli1具有相互作用的基因,在体外通过免疫共沉淀进一步确定peli1与之的相互作用。选用293T细胞探究peli1和筛选出的基因（Polo-like kinase1:PLK1）对各自蛋白表达水平的影响和调控;在293T细胞中阐明调控机制后,改用骨肉瘤细胞系检测各蛋白的内源性变化情况,以此来研究peli1的翻译后调控机制。结果:本研究发现peli1在骨肉瘤组织中的表达水平明显低于癌旁组织;高表达peli1抑制了骨肉瘤细胞的增殖和迁移能力,并促进其凋亡的发生,在骨肉瘤细胞中敲低peli1则产生相反的作用。而通过蛋白质谱结果,我们筛选出PLK1并验证了其与peli1具有相互作用;PLK1对内源及外源性peli1具有明显的调控作用,高表达PLK1使peli1蛋白表达水平下降。机制上来讲,我们确定了peli1可以影响骨肉瘤细胞的增殖、转移和凋亡,其表达水平受到PLK1的调控,peli1的表达与PLK1呈负相关,peli1可以和PLK1相互作用从而在骨肉瘤的进展中发挥功能。结论:peli1能够抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移并诱导细胞凋亡,而且在此过程中被PLK1调控其表达。这一发现可能为骨肉瘤的临床治疗及改善患者预后提供新的策略。

关键词：骨肉瘤 peli1 PLK1 细胞增殖转移

peli1在骨关节炎进展过程中的作用和机制研究

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Peli1在骨关节炎进展过程中的作用和机制研究

作者：莫昊坤华中科技大学

学位级别：硕士

目的:据报道,peli1可调节多种炎症性疾病的发生和发展。本研究旨在探讨peli1在骨关节炎(Osteoarthritis,OA)进展过程中的作用以及所涉及的分子机制,为OA的治疗寻找新的靶点。方法:使用si RNA抑制软骨细胞peli1表达后,用白细胞介素-1β(I... 详细信息

目的:据报道,peli1可调节多种炎症性疾病的发生和发展。本研究旨在探讨peli1在骨关节炎(Osteoarthritis,OA)进展过程中的作用以及所涉及的分子机制,为OA的治疗寻找新的靶点。方法:使用si RNA抑制软骨细胞peli1表达后,用白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)模拟炎症反应,检测合成、分解、炎症、凋亡等OA相关指标。Western Blot检测Toll样受体(Toll like receptor,TLR)和核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路。用si RNA抑制巨噬细胞Raw 264.7中peli1的表达,并用脂多糖干预后,检测巨噬细胞的极化指数。提取巨噬细胞培养液上清液作为条件培养基作用于软骨细胞,检测软骨细胞凋亡指数。采用不稳定内侧半月板(Destabilized medial meniscus,DMM)手术建立小鼠OA模型,在小鼠膝关节腔内注射腺病毒降低peli1的表达,采用苏木素-伊红染色、番红-固绿染色和免疫组化染色评价软骨破坏程度和滑膜炎症情况。结果:在软骨细胞中,抑制peli1的表达可通过靶向TLR和NF-κB信号通路产生抗炎和抗凋亡作用。在巨噬细胞中,抑制peli1的表达可抑制巨噬细胞M1型极化。此外,相应的巨噬细胞条件培养基应用于软骨细胞也能产生抗凋亡作用。动物实验表明,小鼠DMM手术后,抑制peli1的表达能够减少软骨破坏,降低软骨细胞诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitricoxide synthase,i NOS)和基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinase 13,MMP13)的表达。抑制peli1的表达也能够减轻滑膜炎症,降低滑膜细胞i NOS和CD86的表达。结论:抑制peli1的表达对OA有治疗作用,是OA的潜在治疗靶点。

关键词：骨关节炎软骨细胞巨噬细胞极化 peli1

棕榈酸通过TLR4/TRIF-peli1-pNF-κB信号通路促进黑素瘤的肺转移

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棕榈酸通过TLR4/TRIF-Peli1-pNF-κB信号通路促进黑素瘤的肺转移

作者：张雪丹昆明医科大学

学位级别：硕士

【目的】黑素瘤具有高度恶性、进展迅速、早期转移、对放疗和化疗不敏感以及高死亡率等特点。转移性黑素瘤患者的生存率极低,深入研究黑素瘤转移的分子机制是提高疗效的关键。越来越多的证据表明,棕榈酸(palmitic acid,PA)参与肿瘤发生... 详细信息

【目的】黑素瘤具有高度恶性、进展迅速、早期转移、对放疗和化疗不敏感以及高死亡率等特点。转移性黑素瘤患者的生存率极低,深入研究黑素瘤转移的分子机制是提高疗效的关键。越来越多的证据表明,棕榈酸(palmitic acid,PA)参与肿瘤发生发展过程,而Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)在肿瘤信号转导过程中同样发挥重要作用。然而,在人和小鼠黑素瘤中,PA是否能介导TLR4以及下游信号未见相关报道。故本课题旨在研究PA是否激活TLR4介导其下游信号影响小鼠黑素瘤肺转移,为阐明高PA饮食促进肿瘤的发生发展提供科学依据,为后期临床治疗提供理论依据以及新的方向。【方法】1.随机将20只雄性C57BL/6小鼠(6 W龄)分为正常饮食组、高PA饮食组,饮食干预8 W后,检测小鼠血清胆固醇以及甘油三酯水平。尾静脉注射B16细胞,构建黑素瘤的肺转移模型。用HE染色检测肺转移灶的大小以及数量;用Western Blot检测肺转移灶组织的E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白表达情况,用Western Blot以及免疫荧光检测小鼠肺转移灶组织的TLR4、TRIF、peli1和p NF-κB蛋白表达。2.选用人黑素瘤A375细胞、小鼠黑素瘤B16细胞进行CCK-8实验,筛选PA促进黑素瘤细胞增殖的最佳浓度(12.5μM、25μM和50μM)。用最佳PA(25μM)浓度作用A375及B16细胞,通过Transwell实验及Western Blot检测E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白表达水平,评估细胞侵袭能力。使用Western Blot以及免疫荧光检测PA处理细胞后TLR4、TRIF、peli1、p NF-κB蛋白表达。3.使用TAK-242(TLR4抑制剂)和/或PA处理细胞,采用CCK-8检测细胞增殖能力。Western Blot检测TAK-242处理细胞后对E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白表达的影响,用Western Blot以及免疫荧光检测TAK-242处理对TLR4、TRIF、peli1、p NF-κB蛋白表达的影响。4.使用靶向peli1的si-RNA和/或PA处理细胞,通过CCK-8检测细胞增殖能力,用Western Blot检测沉默peli1对黑素瘤细胞的E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白表达影响,进一步通过Western Blot以及免疫荧光检测TLR4、TRIF、peli1、p NF-κB蛋白的表达水平。【结果】1.与正常饮食组相比,高PA饮食组小鼠血清胆固醇水平升高了48%。高PA饮食组小鼠肺转移灶数量明显增多、体积明显增大,转移灶组织中TLR4、TRIF、peli1和p P65蛋白的表达升高,同时E-cadherin表达下调,MMP2和Vimentin的表达上调。2.梯度浓度PA作用A375和B16细胞后,PA(25μM)具有最佳的促增殖效果,分别为46%(A375细胞)和20%(B16细胞)。PA(25μM)作用A375和B16细胞后,A375和B16细胞的侵袭能力分别提升了58%和54%,同时E-cadherin表达下调、MMP2和Vimentin的表达上调,并伴随着TLR4、TRIF、peli1、p P65蛋白的表达上调。3.TAK-242(TLR4抑制剂)剂量依赖性地抑制了A375细胞和B16细胞的增殖,最佳抑制浓度为50 n M,分别抑制了44%(A375细胞)和39%(B16细胞)。TAK-242(50 n M)单独作用A375和B16细胞后,E-cadherin的表达上调,Vimentin、MMP2的表达下调,以及TRIF、peli1、p P65蛋白的表达下调。此外,TAK-242(50 n M)也可显著减少PA(25μM)诱导的细胞增殖,不同程度逆转了MMP2、Vimentin、TRIF、peli1、p P65的高表达以及E-cadherin的低表达。4.3条靶向peli1的si-RNA作用A375和B16细胞24h后,序列1号具有最佳的沉默效果,分别为65%(A375细胞)和45%(B16细胞)。si-RNA(序列1号)单独作用A375和B16细胞后,细胞增殖减少、E-cadherin表达上调,Vimentin、MMP2以及p P65蛋白的表达下调,而TLR4和TRIF表达不变。此外,si-RNA(序列1号)也可显著减轻PA(25μM)诱导的细胞增殖,不同程度逆转了MMP2、Vimentin和p P65高表达以及E-cadherin低表达,但不能逆转TLR4和TRIF的高表达。【结论】PA通过激活TLR4/TRIF-peli1-p P65信号通路从而促进小鼠黑素瘤肺转移以及黑素瘤细胞的增殖以及侵袭。

关键词：黑素瘤 PA TLR4/TRIF peli1 pP65 肺转移

免疫性早发性卵巢功能不全患者血清miR-21及外周血单核细胞peli1的表达及意义

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解放军医学杂志 2021年第3期46卷 252-257页

作者：马闻擎李欣然谢嘉欣王袁杨雨涛付霞霏南方医科大学珠江医院妇产科广州510282

目的探讨免疫性早发性卵巢功能不全(aPOI)患者血清miR-21及外周血单核细胞(PBMC)中peli1的表达水平及临床意义。方法选取南方医科大学珠江医院2018年4月-2019年10月未经治疗的初诊为aPOI的26例患者(aPOI组)及30名健康青年女性(对照组)... 详细信息

目的探讨免疫性早发性卵巢功能不全(aPOI)患者血清miR-21及外周血单核细胞(PBMC)中peli1的表达水平及临床意义。方法选取南方医科大学珠江医院2018年4月-2019年10月未经治疗的初诊为aPOI的26例患者(aPOI组)及30名健康青年女性(对照组)为研究对象。记录两组的一般资料,检测血清miR-21、PBMC peli1 mRNA表达水平,测定血清性激素、抗苗勒管激素(AMH)、甲状腺功能、免疫相关指标,超声检测并记录子宫及卵巢的各项指标并进行分析。结果aPOI组血清miR-21及PBMC peli1 mRNA表达水平(分别为0.60±0.14、0.30±0.14)均明显低于对照组(分别为1.01±0.07、1.63±0.54,P1),且二者呈正相关(r=0.719,P1、peli1 mRNA均与E_(2)、AMH、子宫及卵巢体积呈正相关,与FSH、LH、免疫指标阳性数量呈负相关。结论aPOI患者血清miR-21与PBMC peli1表达水平降低呈正相关;miR-21及peli1可能参与了aPOI的发病机制,对aPOI的辅助诊断有一定价值。

关键词：微小RNA-21 peli1 早发性卵巢功能不全自身免疫

甲基苯丙胺引起BV2小胶质细胞炎性反应:基于Toll样受体-peli1信号通路的研究

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南京医科大学学报（自然科学版） 2021年第3期41卷 324-330页

作者：须怀沙王易欣陈旭锋蒋雷王军张久平南京鼓楼医院医学心理科江苏南京210008 南京医科大学公共卫生学院卫生毒理系江苏南京211166 南京医科大学第一附属医院急诊科江苏南京210029 南京医科大学附属脑科医院儿童心理卫生研究中心江苏南京210029

目的:探讨Toll样受体(Toll like receptor,TLR)-E3泛素连接酶Pellino 1(peli1)介导的炎性通路在甲基苯丙胺(methamphetamine,Meth)引起BV2小胶质细胞炎性反应中的作用。方法:利用Western blot观察Meth作用后Toll样家族中多种TLR的表达及其下游接头蛋白髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domaincontaining adaptor inducing interferon-β,TRIF)水平的改变,同时观察上述接头蛋白下游peli1蛋白的表达,利用ELISA、实时定量PCR(real time-PCR)及Western blot观察peli1调节的下游炎性因子及信号通路的改变。结果:Meth作用于BV2细胞后,TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR11在特定时间内表达明显上调,同时下游MyD88及TRIF蛋白表达显著增加,其中TRIF具有浓度依赖效应。Meth作用后亦可引起泛素化蛋白peli1的表达,而利用RNA干扰的方法将peli1下调后,炎性因子诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin-6,IL)-6表达下降,核因子(nuclear factor,NF)-κB的激活明显缓解。结论:TLR介导的炎性信号在Meth引起BV2细胞炎性反应过程中发挥重要作用。因此,基于TLRs-peli1靶信号轴的干预可能为Meth神经毒性的干预提供靶点,具有潜在的应用意义。

关键词：甲基苯丙胺 Toll样受体家族 peli1 神经炎性反应 BV2细胞

peli1调节系统性红斑狼疮疾病的分子机制研究

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Peli1调节系统性红斑狼疮疾病的分子机制研究

作者：袁嘉上海交通大学

学位级别：硕士

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种具有广泛临床表现的系统性自身免疫疾病。SLE发病与B细胞耐受丧失以及持续的自身抗体产生有很大关系,而Tfh细胞与B细胞在生发中心(GC)相互作用对于GC的活化十分重要。非经典NF-... 详细信息

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种具有广泛临床表现的系统性自身免疫疾病。SLE发病与B细胞耐受丧失以及持续的自身抗体产生有很大关系,而Tfh细胞与B细胞在生发中心(GC)相互作用对于GC的活化十分重要。非经典NF-κB信号介导了B细胞活化和抗体的产生,我们在之前的研究中发现E3泛素连接酶peli1可以抑制非经典NF-κB的激活并且抑制狼疮样自身免疫病的发生。在本文的研究中明确了Poly(I:C)作为peli1的有效诱导剂,诱导表达的peli1可以显著抑制RelB和P52入核,从而抑制非经典NF-κB信号。并且由Poly(I:C)预处理后的B细胞与BM12小鼠的CD4T细胞一起转移到μMT小鼠中不能正常诱导狼疮样疾病,自身抗体的产生明显受到抑制。我们还发现SLE病人外周血单核细胞PBMCs中Tfh细胞比例明显高于正常人,而且在peli1缺陷的小鼠体内发现Tfh细胞分化增加,peli1的缺失可以促进Tfh细胞分化。由此我们得出结论,peli1不仅可以通过抑制非经典NF-κB信号来抑制B细胞激活和自身抗体的产生,也同时调节Tfh细胞的分化,从多细胞多方面来对系统性红斑狼疮疾病的发展起到调控作用。

关键词：系统性红斑狼疮 peli1 B细胞 Tfh细胞

peli1在自身免疫性早发性卵巢功能不全中的表达及对Treg生物学特性的影响

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Peli1在自身免疫性早发性卵巢功能不全中的表达及对Treg生物学特...

作者：汪庆如南方医科大学

学位级别：硕士

目的早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency,POI)是妇科内分泌领域的常见疾病,免疫异常是引起发病的常见原因。POI的抗原靶标和自身抗体尚未完全明确,具体发病机制仍需深入研究。调节性T淋巴细胞(T regulatory cells,Treg... 详细信息

目的早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency,POI)是妇科内分泌领域的常见疾病,免疫异常是引起发病的常见原因。POI的抗原靶标和自身抗体尚未完全明确,具体发病机制仍需深入研究。调节性T淋巴细胞(T regulatory cells,Treg)具有维持免疫平衡、限制过度免疫的作用。在自身免疫性POI中,Treg及细胞因子IL-10、TGF-β1下降,表明Treg及其细胞因子IL-10、TGF-β1参与自身免疫性POI的发生发展。peli1负调节T淋巴细胞的活化,参与调节免疫细胞的增生、活化,参与多种自身免疫性疾病的发生。但peli1是否参与自身免疫性POI的发病,peli1对Treg是否具有调控作用,目前尚未有文章报道。因此,本课题拟研究peli1在自身免疫性POI中的表达,探究peli1对Treg生物学特性的影响,为进一步探索自身免疫性POI的发病机制及后续治疗提供理论依据。第一章 peli1在自身免疫性早发性卵巢功能不全模型小鼠外周血PBMC及脾脏Treg中的表达研究方法采用透明带3多肽(zonapellucida3 peptides,pZP3)构建自身免疫性POI小鼠模型,分离小鼠外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)及脾脏Treg细胞,检测PBMC及Treg中peli1的表达水平,探究peli1在自身免疫性POI小鼠模型中的表达。研究结果1、与正常组相比,模型组小鼠外周血E2和AMH下降、FSH升高,卵巢各级卵泡计数减少,卵巢匀浆IL-10水平降低、IFN-γ升高,表明自身免疫性POI小鼠模型构建成功。2、与正常组相比,模型组小鼠外周血PBMC及脾脏Treg中peli1 mRNA及蛋白表达水平下降。第二章 peli1在自身免疫性早发性卵巢功能不全患者外周血PBMC中的表达研究方法临床收集自身免疫性POI患者外周血并分离出PBMC,检测患者PBMC中peli1的表达水平,探索peli1在自身免疫性POI患者中的表达。研究结果1、与正常组相比,免疫性POI组患者血清E2和AMH下降、FSH和LH升高,84.6%的患者有至少两个免疫指标阳性。2、与正常组相比,免疫性POI组患者外周血PBMC中peli1 mRNA及蛋白表达水平下降。第三章 peli1对Treg细胞生物学特性的影响研究方法构建过表达peli1的慢病毒表达载体,通过慢病毒转染小鼠脾脏Treg细胞,检测Treg增殖、凋亡及免疫抑制功能的变化,探究peli1对Treg细胞生物学特性的影响。研究结果1、成功构建过表达peli1的慢病毒表达载体LV-peli1,转染后正常上调组与模型上调组Treg中peli1表达水平升高。2、与正常空白组及正常空载组相比,正常上调组Treg在48h、72h和96h细胞增殖水平升高、凋亡率下降、免疫抑制功能升高、细胞培养上清液中IL-10及TGF-β水平升高。3、与模型空白组及模型空载组相比,模型上调组Treg在48h、72h和96h细胞增殖水平升高、凋亡率下降、免疫抑制功能升高、细胞培养上清液中IL-10及TGF-β水平升高。全文研究结论1、自身免疫性POI模型小鼠外周血PBMC及脾脏Treg中peli表达下降;2、自身免疫牲POI患者外周血PBMC中peli1表达下降;3、过表达peli1可促进Treg细胞增殖,抑制Treg凋亡,增强其免疫抑制功能。

关键词： peli1 早发性卵巢功能不全自身免疫 Treg细胞

Poly(I:C)预处理通过诱导peli1的表达抑制B细胞介导的狼疮样自身免疫病

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Poly(I:C)预处理通过诱导Peli1的表达抑制B细胞介导的狼疮样自身...

作者：王艳上海交通大学

学位级别：硕士

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种多因素、全身性的自身免疫疾病,其特点为患者体内大量致病性自身抗体与自身抗原结合形成的免疫复合物沉积,造成组织损伤及多个脏器病变。非经典NF-κB信号通路是调控B细胞活化... 详细信息

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种多因素、全身性的自身免疫疾病,其特点为患者体内大量致病性自身抗体与自身抗原结合形成的免疫复合物沉积,造成组织损伤及多个脏器病变。非经典NF-κB信号通路是调控B细胞活化和抗体产生的重要途径,因而介导了B细胞在SLE发病中的关键性作用。在先前的研究中我们已经证明peli1可以负调控非经典NF-κB信号通路活化和狼疮自身免疫的发展。在本研究中我们发现Poly(I:C)是小鼠脾脏B细胞中peli1蛋白的强效诱导剂,其诱导效果呈现Poly(I:C)剂量和处理时间的依赖性。而且,Poly(I:C)诱导的peli1蛋白可以显著地抑制非经典NF-κB信号通路的活化。除此之外,Poly(I:C)预处理的B细胞无法在BM12 CD4+T细胞免疫的μMT小鼠中诱导狼疮样疾病。相应地,在过继性转移了Poly(I:C)预处理的B细胞的μMT小鼠中,具有抗体分泌功能的浆细胞和生发中心B细胞(germinal center B cells,GC B)的诱导以及自身抗体的产生都严重受阻。我们的研究结果证明Poly(I:C)诱导的peli1蛋白负向调控B细胞中非经典NF-κB信号通路的活化,从而抑制狼疮样疾病的发病过程。

关键词：系统性红斑狼疮非经典NF-κB信号通路 B淋巴细胞 Poly(I:C) peli1

TLR4-peli1信号通路在甲基苯丙胺诱导小胶质细胞炎性反应中的作用

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TLR4-Peli1信号通路在甲基苯丙胺诱导小胶质细胞炎性反应中的作用

作者：臧松松南京医科大学

学位级别：硕士

研究背景:甲基苯丙胺（Methamphetamine,Meth）,俗称冰毒,是目前最为常见的精神兴奋剂之一,其中神经系统是Meth作用的主要靶系统之一,近年来,随着分子生物学技术及在体成像技术的广泛应用,中枢炎症在Meth神经损伤中的作用日益凸显。神... 详细信息

研究背景:甲基苯丙胺（Methamphetamine,Meth）,俗称冰毒,是目前最为常见的精神兴奋剂之一,其中神经系统是Meth作用的主要靶系统之一,近年来,随着分子生物学技术及在体成像技术的广泛应用,中枢炎症在Meth神经损伤中的作用日益凸显。神经炎症主要是由脑内小胶质细胞过度激活引起的生理反应。peli1蛋白具有E3泛素化连接酶的作用,在小胶质细胞炎性反应中具有特异性。TLR4是小胶质细胞表面的主要受体,可以活化MyD88和TRIF两条通路,激活NF-κB通路促进炎性因子的表达。有文献报道,peli1激活TRIF依赖性TLR信号通路,促进炎性因子的释放。我们前期的实验发现,Meth可以激活小胶质细胞,TLR4,peli1蛋白表达升高,诱导MAPKs和NF-κB通路激活,引起炎性因子的释放,产生炎性反应,因此我们推测TLR4-peli1可能作为关键信号轴在Meth引起的神经炎性反应中起重要作用。研究目的:探讨TLR4-peli1信号通路在Meth诱导小胶质细胞炎性反应中的作用。研究方法:建立Meth急性染毒的小鼠模型,随机分为三个剂量组,每组17只,对照组（生理盐水）,低剂量Meth组（10 mg/kg）和高剂量Meth组（30 mg/kg）,采用腹腔注射的给药方式,一天内连续给药四次,时间点分别是上午八点、十点、十二点、下午两点。给药后高剂量Meth组（30 mg/kg）死亡4只。在小鼠海马组织中利用western blot技术检测TLR4、peli1、MyD88和TRIF等蛋白的变化情况,同时检测MAPKs和NF-κB通路激活情况。通过慢病毒转染技术,在BV2细胞上低表达peli1,观察MAPKs和NF-κB通路的变化情况,和细胞因子IL-6、IL-12P70和TNF-α分泌水平的变化。利用CCK-8试剂盒测定TLR4抑制剂TAK242对BV2细胞活力的影响,在不影响细胞活力的前提下筛选TAK242最佳作用剂量。通过对TLR4抑制及敲减的方法,观察Meth作用小胶质细胞后,peli1、TRIF和MyD88蛋白和下游MAPK、NF-κB通路磷酸化蛋白表达和炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的变化情况。在BV2细胞上通过si RNA干扰技术对TRIF和MyD88分别进行基因水平敲减,通过RT-PCR和western blot技术观察peli1蛋白的变化情况。结果:1.甲基苯丙胺对小鼠海马TLR4、peli1及信号通路影响TLR4、MyD88、TRIF和peli1在低剂量Meth组（10 mg/kg）和高剂量Meth组（30 mg/kg）蛋白表达量均出现显著上调。与对照组比较,Meth低剂量组（10mg/kg）及高剂量组（30 mg/kg）均可促进MAPK通路的不同程度的激活,表现为p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白表达升高。NF-κB磷酸化蛋白水平表达显著升高。2.peli1在甲基苯丙胺诱导小胶质细胞炎症反应中的作用peli1敲减组中peli1蛋白表达量明显低于空载体组,Meth（300μM）作用下,对比空载体组,peli1敲减后Meth给药组NF-κB磷酸化水平显著降低。peli1低表达后,Meth（300μM）作用下,对比空载体转染组,ERK磷酸化水平明显降低,peli1转染组p38的磷酸化水平显著低于空载体组（p＜0.01）,peli1转染组JNK磷酸化水平也发生降低（p＜0.05）。peli1敲减Meth处理组,与空载体组Meth处理组相比,细胞IL-6、IL-12P70和TNF-α分泌水平表达均下降。3.TLR4抑制剂TAK242对Meth诱导小胶质细胞TLR4蛋白及其下游信号通路的影响20μM的TAK242开始对BV2细胞具有损伤作用,30μM的TAK242作用剂量显著降低细胞活力。不同浓度的TAK242对TLR4的表达均具明显的抑制效果,尤其15μM的浓度作用下,TLR4抑制效果最明显,下游MyD88和TRIF亦出现不同程度的降低,TLR4抑制后,MAPKs通路（ERK、p38、JNK）磷酸化水平均出现不同程度降低,NF-κB磷酸化水平亦明显下调。筛选TAK242（15μM）作用后,TLR4蛋白表达量显著下降,MyD88、TRIF和peli1也出现降低的趋势,且MAPKs通路（ERK、p38、JNK MAPK）磷酸化水平均出现不同程度降低,NF-κB磷酸化水平降低。预先加入TAK242（15μM）后,与Meth单独处理组比较,Meth引起的IL-6、TNF-α和IL-1β等细胞炎性因子的表达显著降低。4.siRNA干扰TLR4后对Meth诱导小胶质细胞炎性反应及其下游信号蛋白的影响TLR4干扰组的蛋白水平明显低于空载体组,说明干扰效果较好。与单独Meth处理组比较,TLR4干扰组Meth作用后MyD88、TRIF及下游peli1的表达下降。TLR4干扰组MAPKs通路（ERK、p38 MAPK

关键词：甲基苯丙胺 peli1 TLR4 小胶质细胞炎性反应