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Fusion expression of pedA gene to obtain biologically active pediocin pa-1 in Escherichia coli

Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology) 2011年第1期12卷 65-71页

作者： Shan-na LIU Ye HAN Zhi-jiang ZHOU School of Chemical Engineering and Technology Tianjin University Tianjin 300072 China

Two heterologous expression systems using thioredoxin (trxA) as a gene fusion part in Escherichia coli were developed to produce recombinant pediocin *** pa-1 structural gene pedA was isolated from Pediococcus acidilactici pa003 by the method of polymerase chain reaction (PCR),then cloned into vector pET32a(+),and expressed as thioredoxin-PedA fusion protein in the host strain *** BL21 (DE3).The fusion protein was in the form of inclusion body and was refolded before purification by nickel-iminodiacetic acid (Ni-IDA) agarose resin *** activity of recombinant pediocin pa-1 was analyzed after cleavage of the fusion protein by *** diffusion test revealed that 512-arbitrary unit (AU) recombinant pediocin pa-1 was obtained from 1 ml culture medium of *** (ppa003PED1) using Listeria monocytogenes as the indicator ***-PedA fusion gene was further cloned into pET20b(+).Thioredoxin-PedA fusion protein was detected in both the periplasmic and cytoplasmic *** recombinant pediocin pa-1 from the soluble fraction attained 384 AU from 1 ml culture medium of *** (ppa003PED2).Therefore,biologically active pediocin pa-1 could be obtained by these two hybrid gene expression methods.

关键词： Bacteriocin Fusion expression Inclusion body pediocin pa-1 Thioredoxin

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Ⅱa类乳酸菌细菌素的克隆表达研究

Ⅱa类乳酸菌细菌素的克隆表达研究

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作者：李硕江南大学

学位级别：硕士

乳酸菌细菌素是由乳酸菌产生的一类具有抗菌活性的多肽或蛋白质。在低浓度下就能对有害菌产生不可逆地杀灭作用。它们可被人体生物降解和消化,对健康无害。大部分乳酸菌细菌素对热稳定,具有高等电点和亲水特性。乳酸菌细菌素中的Ⅱa类... 详细信息

乳酸菌细菌素是由乳酸菌产生的一类具有抗菌活性的多肽或蛋白质。在低浓度下就能对有害菌产生不可逆地杀灭作用。它们可被人体生物降解和消化,对健康无害。大部分乳酸菌细菌素对热稳定,具有高等电点和亲水特性。乳酸菌细菌素中的Ⅱa类乳酸菌细菌素是很大的一类,这类细菌素数量众多且抑菌活性较广,同时它们对单核增生李斯特氏菌有较强的抑菌活性。它们的理化性质也比较稳定,尤其是它们的氨基酸序列结构有很大的同源性,因而Ⅱa类乳酸菌细菌素成为近年来的研究热点。有报道指出每一种乳酸菌至少产生一种或几种细菌素,而到目前为止发现了29种Ⅱa类乳酸菌细菌素,其中大多数是在上个世纪九十年代被发现,近几年发现的Ⅱa类乳酸菌细菌素很少;传统的筛菌方法也有一定的弊端,采用这种方法可能很难再迅速挖掘出新的Ⅱa类乳酸菌细菌素。鉴于这类细菌素序列保守,我们尝试采用生物信息学和分子生物学手段来继续对Ⅱa类乳酸菌细菌素进行深入研究。本文旨在利用分子生物学手段建立一条乳酸菌细菌素从基因到蛋白的研究通路,首先选取近年来报道的Ⅱa类乳酸菌细菌素sakacin P作为研究对象,其具有很强的抗食品途径传播的病原菌单核增生李斯特氏菌的活性,同时选取已有克隆表达报道的Ⅱa乳酸菌细菌素的典型代表乳酸片球菌素pediocin pa-1作为阳性对照。通过sakacin P和阳性对照pediocinpa-1基因的克隆载体、表达载体成功构建,再将表达载体转化入表达宿主后进行诱导表达并进行生物活性鉴定实验,结果发现pediocinpa-1和sakacin P均能在大肠杆菌中成功表达,且其对单核增生李斯特氏菌抑菌活性明显。基本建立了乳酸菌细菌素的基因克隆与表达的一整套方法。Sakacin P的全基因合成、重组表达的成功,为潜在Ⅱa类乳酸菌细菌素的研究提供了参考。鉴于大量乳酸菌基因组测序的完成,可以利用生物信息学筛选到与Ⅱa类乳酸菌细菌素同源性很高的核苷酸序列。本文对从乳酸菌基因组数据库中搜索的一条潜在Ⅱa类乳酸菌细菌素核苷酸序列(NB-C1)进行克隆表达。首先人工合成NB-C1的全基因序列,通过成功构建该基因的克隆载体、表达载体,再将表达载体转化入表达宿主后进行诱导表达及活性鉴定实验,结果表明重组蛋白NB-C1能在大肠杆菌中成功表达,且其对单核增生李斯特氏菌抑菌活性明显。从而说明NB-C1是一个新的Ⅱa类乳酸菌细菌素。本文建立了一条Ⅱa类乳酸菌细菌素从基因克隆、表达到活性检测的通路,并且借助这条通路鉴定了一个新的Ⅱa类乳酸菌细菌素NB-C1。同时为新型Ⅱa类乳酸菌细菌素的筛选研究打下了基础。

关键词： Ⅱa类乳酸菌细菌素 sakacin P pediocin pa-1 克隆表达

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