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Activation of cerebral Ras-related C3 botulinum toxin substrate(Rac) 1 promotes post-ischemic stroke functional recovery in aged mice

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Neural Regeneration Research 2024年第4期19卷 881-886页

作者： Fan Bu Jia-Wei Min Md Abdur Razzaque Ahmad El Hamamy Anthony Patrizz Li Qi Akihiko Urayama Jun Li Department of Neurology University of Texas Health Science Center Department of Neurology&Psychology The Fourth Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine

Brain functional impairment after stroke is common;however,the molecular mechanisms of post-stroke recovery remain unclear.It is well-recognized that age is the most important independent predictor of poor outcomes after stroke as older patients show poorer functional outcomes following stroke.Mounting evidence suggests that axonal regeneration and angiogenesis,the major forms of brain plasticity responsible for post-stroke recovery,diminished with advanced age.Previous studies suggest that Ras-related C3 botulinum toxin substrate(Rac)1 enhances stroke recovery as activation of Rac1 improved behavior recovery in a young mice stroke model.Here,we investigated the role of Rac1 signaling in long-term functional recovery and brain plasticity in an aged(male,18 to 22 months old C57BL/6J)brain after ischemic stroke.We found that as mice aged,Rac1 expression declined in the brain.Delayed overexpression of Rac1,using lentivirus encoding Rac1 injected day 1 after ischemic stroke,promoted cognitive(assessed using novel object recognition test)and sensorimotor(assessed using adhesive removal tests)recovery on days 14–28.This was accompanied by the increase of neurite and proliferative endothelial cells in the periinfarct zone assessed by immunostaining.In a reverse approach,pharmacological inhibition of Rac1 by intraperitoneal injection of Rac1 inhibitor NSC23766 for 14 successive days after ischemic stroke worsened the outcome with the reduction of neurite and proliferative endothelial cells.Furthermore,Rac1 inhibition reduced the activation of p21-activated kinase 1,the protein level of brain-derived neurotrophic factor,and increased the protein level of glial fibrillary acidic protein in the ischemic brain on day 28 after stroke.Our work provided insight into the mechanisms behind the diminished plasticity after cerebral ischemia in aged brains and identified Rac1 as a potential therapeutic target for improving functional recovery in the older adults after stroke.

关键词： aging angiogenesis brain-derived neurotrophic factor(BDNF) cerebral ischemia cognitive recovery neurite pak1 Rac1 sensorimotor recovery

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pak1在幽门螺杆菌联合MNNG诱导人食管上皮细胞分泌IL-8和GRO-α中的作用

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浙江临床医学 2024年第2期26卷 187-190页

作者：郭雨松李思瑶陈艳浙江中医药大学 310053 嘉兴学院医学院 314001

目的构建pak1低、高表达人食管上皮细胞(HEEC)稳定细胞株,探究pak1在幽门螺杆菌(HP)联合N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导HEEC分泌趋化因子IL-8和GRO-α中的作用,为食管癌发病机制提供理论依据。方法利用RNAi技术转染HEEC构建pak1... 详细信息

目的构建pak1低、高表达人食管上皮细胞(HEEC)稳定细胞株,探究pak1在幽门螺杆菌(HP)联合N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导HEEC分泌趋化因子IL-8和GRO-α中的作用,为食管癌发病机制提供理论依据。方法利用RNAi技术转染HEEC构建pak1低表达(pak1-KD)稳定细胞株,利用过表达慢病毒转染HEEC构建pak1高表达(pak1-OE)稳定细胞株;两种细胞分别分为HP+MNNG染毒组、HP染毒组和MNNG染毒组,并设立空白对照组。按感染复数(MOI)=100∶1,即细菌∶细胞=100∶1将HP加入细胞中进行共培养,采用CCK8法计算MNNG半数抑制浓度(IC50)。收集染毒后3 h、6 h和9 h的细胞上清液,采用ELISA法测定IL-8和GRO-α含量。结果相较于空载体对照组(pak1-NC),pak1-KD组pak1基因敲减效率达到84.1%(t=14.627,P=0.004),pak1-OE组pak1基因的表达丰度是pak1-NC组的1,101.646倍(t=16.104,P=0.004)。表明成功构建了pak1低、高表达HEEC稳定细胞株。在pak1-KD和pak1-OE细胞中,各染毒组细胞IL-8和GRO-α分泌含量均随染毒时间呈趋势性增加(均P1)。在pak1-KD和pak1-OE细胞中,相同染毒时间,各组细胞IL-8和GRO-α含量均出现联合染毒组>HP染毒组>MNNG染毒组>对照组,差异有统计学意义(均Ppak1低表达(pak1-KD)相比,pak1高表达(pak1-OE)显著促进联合染毒组、HP染毒组和MNNG染毒组细胞分泌IL-8和GRO-α,差异有统计学意义(均Ppak1作为幽门螺杆菌感染上皮信号通路关键因子,其高表达可促进HP联合MNNG染毒诱导人食管上皮细胞分泌趋化因子IL-8和GRO-α,在食管癌发生中起重要作用。

关键词： pak1 幽门螺杆菌 MNNG IL-8 GRO-α

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Identification of a novel pak1 inhibitor to treat pancreatic cancer

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2020年第4期10卷 603-614页

作者： Jiaqi Wang Yonghua Zhu Jiao Chen Yuhan Yang Lingxia Zhu Jiayu Zhao Yang Yang Xueting Cai Chunping Hu Rafael Rosell Xiaoyan Sun Peng Cao Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Nanjing University of Chinese MedicineNanjing 210028China Department of Pharmacology School of PharmacyNanjing University of Chinese MedicineNanjing 210023China Laboratory of Cellular and Molecular Biology Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese MedicineNanjing 210028China Fullshare Health College Nanjing University of Chinese MedicineNanjing 210023China Department of General Surgery Shanghai General HospitalShanghai Jiao Tong University School of MedicineShanghai 200080China Cancer Biology and Precision Medicine Program Germans Trias i Pujol University HospitalBadalonaBadalona 08916Spain Jiangsu Key Lab of Cancer Biomarkers Prevention and TreatmentJiangsu Collaborative Innovation Center For Cancer Personalized MedicineSchool of Public HealthNanjing Medical UniversityNanjing 211166China

Pancreatic cancer is one of the most aggressive cancers with poor prognosis and a low 5-year survival rate.The family of P21-activated kinases(paks)appears to modulate many signaling pathways that contribute to pancreatic carcinogenesis.In this work,we demonstrated that pak1 is a critical regulator in pancreatic cancer cell growth.pak1-targeted inhibition is therefore a new potential therapeutic strategy for pancreatic cancer.Our small molecule screening identified a relatively specific pak1-targeted inhibitor,CP734.Pharmacological and biochemical studies indicated that CP734 targets residue V342 of pak1 to inhibit its ATPase activity.Further in vitro and in vivo studies elucidated that CP734 suppresses pancreatic tumor growth through depleting pak1 kinase activity and its downstream signaling pathways.Little toxicity of CP734 was observed in murine models.Combined with gemcitabine or 5-fluorouracil,CP734 also showed synergistic effects on the anti-proliferation of pancreatic cancer cells.All these favorable results indicated that CP734 is a new potential therapeutic candidate for pancreatic cancer.

关键词： pak1 Pancreatic cancer Inhibitor Structure-based virtual screening Synergistic effect

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Disruption of the autism-related gene pak1 causes stereocilia disorganization,hair cell loss,and deafness in mice

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Journal of Genetics and Genomics 2021年第4期48卷 324-332页

作者： Cheng Cheng Yilin Hou Zhonghong Zhang Yanfei Wang Ling Lu Liyan Zhang Pei Jiang Song Gao Qiaojun Fang Chengwen Zhu Junyan Gao Xufeng Liu Wei Xie Zhengping Jia Zhigang Xu Xia Gao Renjie Chai Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical SchoolJiangsu Provincial Key Medical Discipline(Laboratory)NanjingJiangsu 210008China Research Institute of Otolaryngology NanjingJiangsu 210008China State Key Laboratory of Bioelectronics School of Life Sciences and TechnologyJiangsu Province High-Tech Key Laboratory for Bio-Medical ResearchSoutheast UniversityNanjingJiangsu 210096China Department of Military Psychology Fourth Military Medical UniversityXi'anShanxi 710032China Department of Ophthalmology Zhongda Hospital Southeast UniversityNanjingJiangsu 210009China Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cells and Developmental Biology Shandong University School of Life SciencesQingdaoShandong 266237China Jiangsu Rehabilitation Research Center for Hearing and Speech Impairment NanjingJiangsu 210004China Neurosciences&Mental Health The Hospital for Sick ChildrenTorontoOntario M5G 1X8Canada Department of Physiology Faculty of MedicineUniversity of TorontoTorontoOntario M5S 2E8Canada Co-Innovation Center of Neuroregeneration Nantong UniversityNantongJiangsu 226019China Institute for Stem Cell and Regeneration Chinese Academy of ScienceBeijing 100864China Beijing Key Laboratory of Neural Regeneration and Repair Capital Medical UniversityBeijing 100069China

Several clinical studies have reported that hearing loss is correlated with autism in children.However,little is known about the underlying mechanism between hearing loss and autism.p21-activated kinases(paks)are a family of serine/threonine kinases that can be activated by multiple signaling molecules,particularly the Rho family of small GTPases.Previous studies have shown that pak1 mutations are associated with autism.In the present study,we take advantage of pak1 knockout(pak1a/a)mice to investigate the role of pak1 in hearing function.We find that pak1 is highly expressed in the postnatal mouse cochlea and that pak1 deficiency leads to hair cell(HC)apoptosis and severe hearing loss.Further investigation indicates that pak1 deficiency downregulates the phosphorylation of cofilin and ezrin-radixin-moesin and the expression of b II-spectrin,which further decreases the HC synapse density in the basal turn of cochlea and disorganized the HC stereocilia in all three turns of cochlea in pak1à/àmice.Overall,our work demonstrates that the autism-related gene pak1 plays a crucial role in hearing function.As the first candidate gene linking autism and hearing loss,pak1 may serve as a potential target for the clinical diagnosis of autism-related hearing loss.

关键词： pak1 Hearing loss Synapse Hair bundle ERM

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Isolation of a New pak1 Gene from Sea Cucumber(Apostichopus japonicus) and Its Expression Analysis and Function Characterization

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Journal of Ocean University of China 2019年第5期18卷 1147-1157页

作者： REN Liyuan LI Kaiquan ZHAN Yaoyao WANG Yi YU Yao CHEN Yang LIN Kai SONG Jian CHANG Yaqing Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea of Ministry of Agriculture and Rural Affairs Dalian Ocean UniversityDalian 116023China State Key Laboratory of Marine Environmental Science Xiamen UniversityXiamen 361102China The University of New South Wales SydneyNew South Wales 2052Australia

The p21-activated kinase 1(pak1)is a downstream serine/threonine kinase effector of Rac1/Cdc42 that regulates various biological processes including those associating with pathological inflammation.To investigate the function of pak1 in echinoderms,we isolated a new pak1 from sea cucumber Apostichopus japonicus(Ajpak1)by transcriptome database mining and with rapid amplification of cDNA ends(RACE).The full-length cDNA Ajpak1 was 2303 bp in length,containing a 1587 bp ORF encoding 528 amino acid residues.The deduced Ajpak1 contained a p21-Rho-binding domain(PBD)and a serine/threonine protein kinase catalytic domain(S_TKc),which was similar to the pak1 of crown-of-thorns starfish Acanthaster planci and other eukaryotes.Ajpak1 expressed in all tissues of adult A.japonicus analyzed with the highest transcript anumdance detected in coelomocytes.Significant change in Ajpak1 abundance was observed at 4,24,48 and 72 h after Vibrio splendidus infection.Silencing Ajpak1 induced a significant reduction of lysozyme content in coelomic fluid and relative transcript abundances of AjRac1 and AjMKK3/6 in A.japonicus coelomocytes.These results should aid to characterize pak1 of sea cucumber and decipher its immune function.

关键词： Apostichopus japonicus pak1 expression analysis Vibrio splendidus infection

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pak1和pak4在不同毛色绵羊皮肤中的表达与定位

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中国畜牧杂志 2022年第11期58卷 112-116,122页

作者：赵红霞王志鹏王天元赛务加甫庞全海山西农业大学动物医学学院山西太谷030801 山西中国辐射研究院山西太原030000 山西省柳林县动物疫病预防控制中心山西柳林033300 石河子大学动物科技学院新疆石河子832003

本研究通过研究p21活化激酶1(p21-Activated Kinase 1,pak1)、p21活化激酶4(p21-Activated Kinase 4,pak4)在不同毛色绵羊皮肤的表达与定位,探索pak1、pak4在绵羊毛色形成中的作用。选取黑色、棕色和白色哈萨克绵羊各3只,取背部皮肤组织... 详细信息

本研究通过研究p21活化激酶1(p21-Activated Kinase 1,pak1)、p21活化激酶4(p21-Activated Kinase 4,pak4)在不同毛色绵羊皮肤的表达与定位,探索pak1、pak4在绵羊毛色形成中的作用。选取黑色、棕色和白色哈萨克绵羊各3只,取背部皮肤组织,qRT-PCR检测不同毛色皮肤中pak1和pak4 mRNA相对表达量,Western Blotting研究pak1和pak4蛋白在不同毛色绵羊皮肤中的相对表达量,免疫组化技术对pak1和pak4在绵羊皮肤组织中表达情况进行定位分析。结果表明,pak1基因在黑色绵羊皮肤中的mRNA相对表达量极显著高于棕色和白色绵羊,棕色绵羊的表达极显著高于白色绵羊。pak4基因在黑色绵羊皮肤中的mRNA相对表达量极显著高于棕色和白色绵羊,棕色绵羊的表达显著高于白色绵羊;黑色绵羊的皮肤中pak1和pak4蛋白表达量极显著高于棕色和白色绵羊,棕色绵羊中pak4蛋白表达量极显著高于白色绵羊;pak1蛋白在白色绵羊的表皮、根鞘、毛干表达,在黑色绵羊的表皮、根鞘、毛球表达,在棕色绵羊的表皮、根鞘表达。pak4蛋白在白色,黑色和棕色绵羊的表皮、根鞘、毛基质中均有表达。综上表明,pak1和pak4可能通过诱导黑色素的生成进而调控哈萨克绵羊毛色生成过程。

关键词： pak1 pak4 毛色绵羊

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miR-513a-5p通过靶向调控pak1抑制子宫颈癌细胞增殖和侵袭

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实用肿瘤杂志 2023年第1期38卷 17-25页

作者：林雪芳周建维浙江大学医学院附属第二医院妇科浙江杭州310000 丽水市人民医院妇科浙江丽水323000

目的研究miR-513a-5p通过靶向调控p21活化激酶1(p21-activated kinase 1,pak1)抑制子宫颈癌细胞增殖和侵袭的机制。方法通过分析高通量基因表达(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库GSE145372数据集的数据确认miR-513a-5p在子宫颈癌组织和正常子宫颈组织中的表达差异。采用实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测miR-513a-5p和pak1在子宫颈癌细胞株(HT3、C-33A和HeLa)和人子宫颈内膜上皮细胞株(End1/E6E7)中的表达情况。在miR-513a-5p表达最低的细胞株HT3和C-33A中分别转染miR-513a-5p mimics(miR-513a-5p mimics组)和NC mimics(NC mimics组)。在HT3和C-33A细胞中分别转染pcDNA3.1-pak1和空载pcDNA3.1-NC用于后续功能拯救实验。采用EdU实验和transwell实验分别检测miR-513a-5p和pak1对子宫颈癌细胞增殖和侵袭能力的影响。荧光素酶报告实验验证miR-513a-5p和pak1之间的相互作用。结果miR-513a-5p在子宫颈癌细胞株HT3、C-33A和HeLa中的表达均低于人子宫颈内膜上皮细胞株End1/E6E7(均P1)。与转染NC mimics的HT3和C-33A细胞比较,转染miR-513a-5p mimics后48 h,HT3和C-33A细胞株增殖和侵袭能力均减弱(均P1)。荧光素酶实验结果显示,miR-513a-5p可以和pak1结合。拯救实验结果表明,与单独转染miR-513a-5p mimics的HT3和C-33A细胞比较,共转染miR-513a-5p mimics和pcDNA3.1-pak1能恢复HT3和C-33A细胞的增殖和侵袭能力(均P1)。结论miR-513a-5p通过靶向调控pak1抑制子宫颈癌细胞增殖和侵袭。

关键词：子宫颈癌 miR-513a-5p pak1 增殖侵袭

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LncRNA TUG1调控pak1在幽门螺杆菌协同MNNG致食管上皮细胞恶性转化中的作用

LncRNA TUG1调控PAK1在幽门螺杆菌协同MNNG致食管上皮细胞恶性转...

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作者：雷毅新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:构建Lnc RNA TUG1低表达人正常食管上皮细胞(HEEC)稳定株,探讨长链非编码RNA(Lnc RNA)在幽门螺杆菌协同MNNG在食管上皮细胞恶性转化中的作用,为防治食管癌提供理论依据。方法:利用以慢病毒为载体的RNAi技术,构建Lnc RNA TUG1低表... 详细信息

目的:构建Lnc RNA TUG1低表达人正常食管上皮细胞(HEEC)稳定株,探讨长链非编码RNA(Lnc RNA)在幽门螺杆菌协同MNNG在食管上皮细胞恶性转化中的作用,为防治食管癌提供理论依据。方法:利用以慢病毒为载体的RNAi技术,构建Lnc RNA TUG1低表达人食管上皮细胞稳定株。实验分组为Lnc RNA TUG1低表达组(Lnc RNA TUG1-KD组)、Lnc RNA TUG1空载体组(Lnc RNA TUG1-NC组)和对照组(人食管上皮细胞)。CCK8法测得MNNG的IC值。幽门螺杆菌以MOI=100:1(细菌:细胞=100:1)协同MNNG染毒致细胞发生恶性转化。通过细胞形态学观察、细胞增殖实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验观察各组细胞在染毒后不同时期指标的变化;采用彗星实验观察各组细胞在染毒后不同时期DNA损伤情况;采用RT-RCR、Western Bolt和ELISA技术检测不同染毒时间细胞pak1基因和蛋白表达水平以及IL-8、GRO-α含量;以软琼脂生长出细胞克隆团界定细胞的恶性转化。结果:(1)成功构建Lnc RNA TUG1低表达人食管上皮细胞稳定株,且经实时荧光定量PCR检测,Lnc RNA TUG1敲减效率达51.1%,t=11.98,P1。(2)细胞形态学发现在染毒早、中期各组细胞形态变化较小,染毒至晚期,Lnc RNA TUG1-KD组细胞少数出现细胞拉长现象,而Lnc RNA TUG1-NC组细胞形态变化较大,细胞拉伸变长,排列不规则等。(3)细胞增殖实验发现,各组细胞在早期和中期,Lnc RNA TUG1-KD组与Lnc RNA TUG1-NC组细胞增殖速度小于对照组(均有P1)。染毒晚期各组细胞增殖有差异(F=6.873,P=0.028),且Lnc RNA TUG1-NC组细胞增殖速度高于Lnc RNA TUG1-KD(P1)。(4)细胞周期实验发现,在不同染毒时期的Lnc RNA TUG1-KD组与Lnc RNA TUG1-NC组均出现G0/G1期减小的现象(均有P1-KD组与Lnc RNA TUG1-NC组细胞总凋亡率均高于对照组(均有P1-KD组与Lnc RNA TUG1-NC组均出现DNA损伤,且Lnc RNA TUG1-NC组DNA损伤情况更严重(P1)。(7)pak1在染毒后不同时期出现Lnc RNA TUG1-NC组蛋白表达高于Lnc RNA TUG1-KD组(均有P1),且在基因检测水平发现相同趋势;其下游因子IL-8和GRO-α含量均比对照组显著增加,且Lnc RNA TUG1-KD组IL-8和GRO-α含量均小于Lnc RNA TUG1-NC(均有P1)。(8)细胞染毒至35代,Lnc RNA TUG1-NC组细胞出现明显克隆,且克隆形成率高于Lnc RNA TUG1-KD组(P1)。结论:(1)人食管上皮细胞中低表达的Lnc RNA TUG1在幽门螺杆菌协同MNNG染毒过程中能抑制细胞增殖、扰乱细胞周期分布并降低细胞凋亡。(2)幽门螺杆菌协同MNNG染毒中,降低Lnc RNA TUG1的表达能使细胞Olive尾矩减小并减轻细胞DNA损伤。(3)人食管上皮细胞中低表达的Lnc RNA TUG1能降低pak1的表达从而减小下游炎症因子IL-8、GRO-α的产生;(4)低表达的Lnc RNA TUG1人食管上皮细胞软琼脂克隆形成率减少,细胞恶性程度降低。

关键词：食管癌 LncRNA TUG1 pak1 幽门螺杆菌 MNNG

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日本七鳃鳗pak1分子的克隆表达、抗体制备及相关免疫学研究

日本七鳃鳗PAK1分子的克隆表达、抗体制备及相关免疫学研究

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作者：杨晨辽宁师范大学

学位级别：硕士

适应性免疫和先天性免疫作为脊椎动物的两种免疫途径,承载着机体防御保护的作用。T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)、B细胞抗原受体(B cell receptor,BCR)和主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)在有颌类脊... 详细信息

适应性免疫和先天性免疫作为脊椎动物的两种免疫途径,承载着机体防御保护的作用。T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)、B细胞抗原受体(B cell receptor,BCR)和主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)在有颌类脊椎动物的适应性免疫系统中起重要作用。p21蛋白激活激酶1(p21-activated kinase 1,pak1)是一类丝氨酸/苏氨酸激酶,之前的研究发现酪氨酸激酶衔接蛋白非催化区1(noncatalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 1,NCK1)可以作为TCR和细胞骨架的衔接蛋白,而pak1则已经被证明可以通过其氨基末端的第一个富含脯氨酸的SH3结合基序与NCK上的第二个SH3结构域结合,从而参与TCR信号通路。通过前期的研究,本研究首次在日本七鳃鳗(Lampetra japonica)转录组中发现了一个pak1分子,并对其进行了生物信息学分析,并将其命名为Lja-pak1。Lja-pak1的ORF区共1497bp,编码翻译498个氨基酸,发现该分子的功能结构域也与高等脊椎动物的pak1分子家族一致,由P21结合结构域(P21 Binding Domain,PBD)和丝氨酸/苏氨酸激酶催化结构域(serine/threonine kinase catalytic domain,S＿TKc)组成。在将Lja-pak1的氨基酸序列与人(Homo sapies)等一些脊椎和无脊椎动物的pak1、pak2及pak3序列进行序列比对并构建进化树,发现该分子与高等脊椎动物pak1的序列一致性明显高于其与这些物种pak2和pak3的序列一致性,在进化树中也能够清晰的从遗传距离上看出其亲缘性更接近于其他脊椎动物的pak1分子序列,并且其与海七鳃鳗的亲缘性更加接近,至此,本研究确定在无颌类脊椎动物七鳃鳗存在pak1同源基因。为制备Lja-pak1蛋白抗体,本研究分析了Lja-pak1基因cDNA序列的酶切位点,选用了pET-32a(+)表达载体成功构建了原核表达重组质粒,将重组质粒导入E.coli Rosetta感受态细胞中并诱导其进行原核表达,并使用Ni柱亲和层析法纯化出Lja-pak1重组蛋白。使用纯化后的重组蛋白作为抗原通过多次免疫刺激大鼠(Rattus norvegicus)制备多克隆抗体,得到了效价1:16 000的鼠抗Lja-pak1多克隆抗体。为了研究Lja-pak1在无颌类脊椎动物七鳃鳗免疫途径中的作用,通过使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和免疫印迹实验(Western blotting assay,WB)实验方法分别在转录水平和蛋白水平检测了Lja-pak1基因在混合菌刺激后在日本七鳃鳗免疫相关组织中的相对表达量。通过qPCR的结果发现,在混合菌的刺激下,与空白对照组相比,Lja-pak1在淋巴细胞、鳃囊和髓样小体中的相对表达量明显上调;通过分析,免疫印迹的结果也与qPCR保持一致,说明七鳃鳗Lja-pak1分子参与了七鳃鳗抗菌免疫应答反应。本研究使用qPCR和免疫印迹实验分别测定Lja-pak1被T细胞丝裂原植物凝集素(phytohemagglutinin,PHA)和B细胞丝裂原脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)免疫刺激后在转录水平和蛋白水平上表达量的变化,并以此来确认其与日本七鳃鳗适应性免疫系统中哪种淋巴细胞类群免疫应答反应有关。通过对实验结果的分析,发现Lja-pak1可能在VLRB细胞中参与免疫反应。通过免疫荧光实验发现Lja-pak1与VLRB分子有共定位现象,并且混合菌群对这种共定位现象有明显的影响作用。最后通过免疫共沉淀实验,发现Lja-pak1还与其他几种蛋白相互作用,但对于蛋白类型的鉴定尚需进一步的研究。我们的研究为之后探究Lja-pak1分子参与VLRA、VLRB和VLRC淋巴细胞亚群的免疫应答反应的作用机制奠定了重要的基础。

关键词：日本七鳃鳗 pak1 抗体制备免疫应答可变淋巴细胞受体

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丙戊酸钠对慢性不可预知应激诱导斑马鱼抑郁模型的改善作用及机制研究

丙戊酸钠对慢性不可预知应激诱导斑马鱼抑郁模型的改善作用及机制...

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作者：胡国俊西南大学

学位级别：硕士

研究背景:抑郁症是最常见的和致残的精神疾病之一,其病因复杂,涉及社会环境、遗传、心理等诸多因素,存在发病率逐年上升、诊断率低、缺乏安全有效的治疗方法等问题。目前,已有许多研究表明,p21活化激酶(p21-activated kinase,paks)信号... 详细信息

研究背景:抑郁症是最常见的和致残的精神疾病之一,其病因复杂,涉及社会环境、遗传、心理等诸多因素,存在发病率逐年上升、诊断率低、缺乏安全有效的治疗方法等问题。目前,已有许多研究表明,p21活化激酶(p21-activated kinase,paks)信号在神经元生理学中有着重要参与,其中pak1和pak5与抑郁症的发病机理密切相关。同时,组蛋白乙酰化修饰通过调控基因的表达从而参与抑郁症的病理生理学和治疗已得到了广泛的证实。丙戊酸钠作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor,HDACis),可逆转组蛋白低乙酰化水平,上调相关基因的表达进而发挥神经保护作用,但其参与特定靶基因的表达从而治疗抑郁症的具体机制仍需进一步阐明。研究目的:通过慢性不可预知应激(Chronic unpredictable stress,CUS)程序诱导斑马鱼抑郁模型,检测组蛋白去乙酰化酶4(Histone deacetylase,HDAC4)m RNA与蛋白表达,并观察pak1、pak5基因启动子区组蛋白H3和H4乙酰化水平及其基因表达的变化,探讨丙戊酸钠是否通过组蛋白修饰调控pak1、pak5基因的表达进而影响抑郁症的发生。研究方法:1.将斑马鱼随机分为对照组(CG)和模型组(MG),MG组采用五周CUS建立斑马鱼抑郁模型。通过行为学测试如新型水箱测试(Noval tank test,NTT)、明暗箱测试(Light dark box test,LDB)和浅滩测试(Shoaling test,SLT)评价抑郁斑马鱼的行为学改变,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定外周促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin releasing hormone,CRH)、促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)以及皮质醇水平变化,高效液相色谱(HPLC)测定脑内单胺类神经递质5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)含量变化,以上指标可评价斑马鱼抑郁模型的造模是否成功。2.基于上述结果,将斑马鱼随机分为四组:对照组(CG)、模型组(MG)、对照给药组(VCG)和模型给药组(VMG)。MG和VMG组进行五周CUS程序,建模最后一周,每日对VCG和VMG组进行丙戊酸钠水溶液(200 mg/L)20 min浸泡给药,其余组置于养殖水中。造模完成后,分别进行体质指数(BMI)测定以及NTT、LDB、SLT测试,对斑马鱼进行行为学评价。之后取斑马鱼脑组织,采用苏木精-伊红(HE)染色法以及透射电镜观察脑结构形态学表型变化。3.采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)测定斑马鱼脑的pak1、pak5以及HDAC4 m RNA表达水平,蛋白免疫印迹(Western-Bloting,WB)法测定HDAC4的蛋白表达水平,染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)法检测pak1和pak5基因启动子区组蛋白H3和H4乙酰化水平的变化。研究结果:1.经过五周CUS后,模型组(MG)斑马鱼表现出明显的抑郁样行为。在NTT实验中,较CG组,MG组斑马鱼向顶部的探索行为减少,冻结僵化时间增加;在LDB实验中,MG组斑马鱼趋暗性显著增加;SLT实验中,MG组斑马鱼表现出明显的浅滩凝聚力。同时MG组斑马鱼全身CRH、ACTH和皮质醇含量显著升高,斑马鱼脑5-HT和NE含量显著降低,进一步反映了斑马鱼抑郁模型的成功。2.行为学测试结果显示,MG组斑马鱼表现出明显的抑郁样行为,且其BMI较CG组显著降低。HE染色结果显示,与CG组相比,MG组斑马鱼中脑区炎性细胞数量增多,细胞核固缩,脑区损伤情况较为严重。丙戊酸钠的治疗可有效改善斑马鱼行为缺陷和中脑神经元损伤。且电镜结果显示,MG组斑马鱼中脑神经元超微结构出现明显损伤,线粒体肿胀、空泡化,突触结构模糊不清且突触小泡减少,而丙戊酸钠干预可使其改善。3.q RT-PCR结果显示,与CG组相比,MG组斑马鱼脑pak1 m RNA水平显著降低,HDAC4 m RNA水平显著升高,丙戊酸钠可明显逆转pak1和HDAC4 m RNA表达,pak5的表达无明显变化。Western-Bloting结果显示,MG组斑马鱼脑HDAC4蛋白表达显著升高,与q RT-PCR结果一样,丙戊酸钠可显著降低HDAC4蛋白表达。4.CHIP结果显示,与CG组相比,MG组斑马鱼脑组织pak1基因启动子区组蛋白H4乙酰化水平显著降低,丙戊酸钠可明显逆转由CUS引起的pak1基因启动子区组蛋白H4乙酰化水平的改变。pak5基因启动子组蛋白H3和H4乙酰化水平无明显变化。结论:1.CUS可成功构建斑马鱼抑郁模型,引起斑马鱼的

关键词：慢性应激抑郁症 pak1 组蛋白乙酰化丙戊酸钠

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