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RNAi技术干扰人喉癌Hep-2细胞pttg1基因的初步研究

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实用医学杂志 2011年第16期27卷 2913-2917页

作者：王云龙孙新城徐桂超昌静峰李玉林王国强刘旺根董彩文河南省生物工程技术研究中心郑州市450001 郑州大学河南省新乡市453007 郑州职业技术学院 450121

目的:探索对人pttg1基因mRNA序列有较高干扰效率的位点,构建对pttg1基因的表达有较高抑制效率的重组质粒。方法:筛选、合成1对互补DNA单链,退火为双链后与双酶切后的质粒载体连接,构建了表达短发夹RNA的1种重组质粒plk0.1-puro/pttg1。... 详细信息

目的:探索对人pttg1基因mRNA序列有较高干扰效率的位点,构建对pttg1基因的表达有较高抑制效率的重组质粒。方法:筛选、合成1对互补DNA单链,退火为双链后与双酶切后的质粒载体连接,构建了表达短发夹RNA的1种重组质粒plk0.1-puro/pttg1。重组质粒以不同浓度转染,并于转染后不同时间收集细胞,以β-actin为内参,采用RT-PCR和Western blot技术分别检测pttg1基因的mRNA、蛋白质的相对表达水平。结果:与空白对照组相比,6孔板中每孔转染质粒plk0.1-puro/pttg 11000ng以上、转染超过12d时,pttg1基因mRNA、蛋白质的相对表达水平下降70%以上。结论:重组质粒plk0.1-puro/pttg1,在6孔细胞培养板中以1000ng/孔转染12d以上时,有效抑制了人pttg1基因的表达,在关于pttg1基因的研究中具有较好的应用价值。

关键词： RNAi pttg1基因 shRNA

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RNAi技术干扰Hep-2细胞pttg1基因的初步研究

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RNAi技术干扰Hep-2细胞PTTG1基因的初步研究

作者：徐桂超河南师范大学

学位级别：硕士

肿瘤是与多基因、多因素相关的疾病,大多数肿瘤的发生与原癌基因的突变、过度表达以及抑癌基因的突变、失活相关。抑制肿瘤相关基因的表达一直是研究新型抗肿瘤方法的重要思路。RNA干扰（RNA interference,RNAi）现象发现于1995年,是在... 详细信息

肿瘤是与多基因、多因素相关的疾病,大多数肿瘤的发生与原癌基因的突变、过度表达以及抑癌基因的突变、失活相关。抑制肿瘤相关基因的表达一直是研究新型抗肿瘤方法的重要思路。RNA干扰（RNA interference,RNAi）现象发现于1995年,是在转录后水平沉默相应基因表达的基因阻断新技术,是近几年基因治疗的热点。RNAi技术的原理是小干扰RNA（siRNA）利用碱基互补的原理,引导RNA诱导的沉默复合物（RISC）特异性识别并结合目的基因的mRNA,引发mRNA降解,抑制肿瘤相关蛋白质的生成,诱使肿瘤细胞凋亡或使其向成熟方向分化,从而抑制肿瘤增殖。垂体瘤转化基因（pttg）在正常细胞的增殖、分化及凋亡过程中起重要作用。研究表明,pttg1基因的高表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。利用RNAi技术沉默人喉癌Hep-2细胞中pttg1基因的表达,阻止或延缓肿瘤细胞的生长具有现实意义和潜在的临床应用价值。本研究根据GenBank中登录的人pttg1基因mRNA序列（NM04219.2）,利用美国Applied Biosystems公司提供的siRNA在线设计软件筛选了针对mRNA序列上2个不同靶位点的2对互补DNA单链,分别稀释为相同浓度后将互补单链分别等量混匀,退火为双链DNA分子,分别命名为pttg1a和pttg1b。两双链DNA分子5’端和3’端分别带有EcoRⅠ、BamHⅠ黏性末端。真核表达质粒载体plk0.1-puro经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后,回收6312bp的大片段,与pttg1a和pttg1b分别连接,构建了表达短发夹RNA（shRNA）的2种重组质粒。经双酶切鉴定和测序鉴定,2种重组质粒构建成功,分别命名为plk0.1-puro/pttg1a和plk0.1-puro/pttg1b。提质粒并经分光光度计测定,表明两种重组质粒溶液的纯度均较高,可应用于转染实验。同时,将嘌呤霉素稀释为8种不同浓度,加入到培养的人喉癌Hep-2细胞系,持续培养14d,观察嘌呤霉素对细胞存活的影响。重组质粒plk0.1-puro/pttg1a和plk0.1-puro/pttg1b均稀释为不同浓度,在脂质体LipofectamineTM2000介导下转染Hep-2细胞系,用嘌呤霉素筛选,于转染12d后收集细胞,分别提取总RNA、蛋白质,以β-actin为内参,采用RT-PCR和Western blot技术分别检测pttg1基因的mRNA、蛋白质的相对表达水平。结果显示,与空白对照组相比,随质粒浓度的增加,pttg1基因mRNA、蛋白质的相对表达水平均逐渐降低;6孔板中每孔转染1000ng、1200ng质粒时,plk0.1-puro/pttg1a对pttg1基因的抑制率可达70%以上,plk0.1-puro/pttg1b的抑制率则低于20%。故后续实验以plk0.1-puro/pttg1a进行操作。同一浓度（1000ng/孔）的重组质粒plk0.1-puro/pttg1a在脂质体介导下转染培养于6孔板的Hep-2细胞系,经嘌呤霉素筛选后,分别在转染后7d、12d、18d收集细胞,提取总RNA、蛋白质,以β-actin为内参,分别以RT-PCR、Western blot技术检测pttg1基因mRNA、蛋白质相对表达水平。结果显示,与空白对照组相比,随时间的延长,pttg1基因mRNA、蛋白质的相对表达水平均逐渐降低;转染超过12d时,pttg1基因mRNA、蛋白质的相对表达水平下降70%以上。一般,对目的基因的抑制效率达到70%以上的siRNA序列具有较好的应用前景。本实验构建的重组质粒plk0.1-puro/pttg1a,在六孔细胞培养板中以1000ng/孔转染12d以上时,人喉癌Hep-2细胞内pttg1 mRNA和蛋白质相对表达水平降低了70%以上,有效抑制了pttg1基因的表达,故重组质粒plk0.1-puro/pttg1a在关于pttg1基因的研究中具有较好的应用价值。

关键词： Hep-2细胞 RNA干扰 pttg1基因

沉默pttg1基因对弥漫大B淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响

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江西医药 2023年第4期58卷 391-394页

作者：刘海芸方全钢刘娜张水生江西省人民医院南昌医学院第一附属医院南昌330006

目的探讨小干扰RNA(siRNA)靶向沉默pttg1基因对弥漫大B淋巴瘤细胞株OCI-LY-19增殖和凋亡的影响。方法实验分3组:siRNA-pttg1组细胞分别转染sipttg1-415和sipttg1-686,siNC组细胞转染阴性siRNA,空白组细胞不转染。采用qRT-PCR和Western blotting法检测mRNA和蛋白质水平并评估pttg1沉默效率,CCK-8法检测细胞增殖活力,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率。结果sipttg1-415和sipttg1-686组OCI-LY-19细胞中pttg1 mRNA和蛋白表达水平与空白组和siNC组相比较明显降低(Ppttg1基因的表达,并抑制细胞增殖,促进凋亡。

关键词： pttg1基因弥漫性大B淋巴瘤细胞增殖细胞凋亡

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HCV感染通过Erk信号的激活上调pttg1的表达

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科技导报 2012年第13期30卷 25-30页

作者：冯丹丹杨硕李红霞顾娜闾军首都医科大学附属北京佑安医院肿瘤生物治疗科北京100069

为探讨丙型肝炎病毒(HCV)感染导致肝细胞癌发生的分子机制,利用前期研究建立的体外HCV细胞培养体系,将HCVJFH-1RNA转染CD81-Huh7细胞,确定能够获得感染性HCV后,收集HCV转染后10,50,100和150d的细胞,采用RealtimePCR及WesternBlot法检测... 详细信息

为探讨丙型肝炎病毒(HCV)感染导致肝细胞癌发生的分子机制,利用前期研究建立的体外HCV细胞培养体系,将HCVJFH-1RNA转染CD81-Huh7细胞,确定能够获得感染性HCV后,收集HCV转染后10,50,100和150d的细胞,采用RealtimePCR及WesternBlot法检测不同时间点细胞内垂体瘤转化基因1(pttg1)基因和蛋白水平的表达情况,同时检测总MAPK/Erk1/2,磷酸化Erk1/2(p-Erk1/2)蛋白的表达。随后,用干扰素抑制HCV的感染,再检测pttg1及MAPK/Erk1/2的表达情况,以及用MAPK/Erk抑制剂(PD98059)阻断MAPK/Erk1/2的磷酸化后,检测pttg1的表达情况。结果显示,HCV转染的细胞与未转染细胞比较,pttg1的mRNA和蛋白表达均显著增加,p-Erk1/2蛋白显著升高(Ppttg1的表达和MAPK/Erk1/2的磷酸化(Ppttg1基因和蛋白的表达(P基因pttg1的表达增加,这可能是慢性HCV感染导致HCV相关性肝细胞癌发生的分子机制之一。

关键词： HCV感染 CD81-Huh7细胞 MAPK/Erk信号通路 pttg1基因

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用全外显子组测序技术寻找一个类Olmsted综合征家系的致病基因

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用全外显子组测序技术寻找一个类Olmsted综合征家系的致病基因

作者：赵燕浙江大学

学位级别：硕士

研究背景：Olmsted综合征(Olmsted syndrome。OMIM:614594)是一种罕见的先天性遗传性皮肤病。本病主要表现为边界清晰的掌跖角化,指趾的缩窄或指趾端逐渐断离,以及口周角化斑块。其他的临床特征还包括甲营养不良和弥散的秃发。角化部位... 详细信息

研究背景：Olmsted综合征(Olmsted syndrome。OMIM:614594)是一种罕见的先天性遗传性皮肤病。本病主要表现为边界清晰的掌跖角化,指趾的缩窄或指趾端逐渐断离,以及口周角化斑块。其他的临床特征还包括甲营养不良和弥散的秃发。角化部位的皮肤可以出现感染和鳞状细胞癌。另外,Olmsted综合征还可能伴发一些罕见的症状,如无前臼齿,鱼鳞病,或听力丧失等。已发现的Olmsted综合征致病基因包括TRPV3、MBTPS2等。目标：在一个中国南方汉族类Olmsted综合征家系中寻找致病基因突变,为Olmsted综合征发病的分子机制提供理论依据;并为该家系的疾病确诊、产前诊断等奠定分子基础。方法：收集了所研究的类Olmsted综合征家系中的3例患者和1例正常个体的相关资料,以及外周抗凝血血样。为了鉴别诊断是否为可疑的Vohwinkel综合征、先天性大疱性鱼鳞病样红皮病(bullous congenital ichthyosiform erythroderma, BCIE)、表皮松解性掌跖角化症(epidermolytic palmoplantar keratoderma, EPPK)、Clouston综合征或Mal de Meleda病,首先对家系进行了TRPV3, LOR, GJB2, KRT1、KRT9、KRT10、GJB6和SLURP1等基因突变的筛查,但未发现相关基因突变。为了探查该家系的未知致病基因突变,对该家系样本进行了全外显子组测序(whole exome sequencing, WES)分析,并在进行Sanger DNA测序验证。结果与结论：在本类Olmsted综合征家系中,没有发现TRPV3、LOR、GJB2、 KRT1、KRT9、KRT10, GJB6和SLURP1等相关基因的突变。通过全外显子组测序和数据分析,逐渐缩小了本家系潜在的致病基因范围,即SLC22A14、pttg1、ATP1OB、 KCTD5、ZNF705A、Clorf168、ZNF595和CBWD3等其中一种基因的突变可能为本家系患者的致病突变,其中pttg1的***176Tyr突变的致病可能性最大。在迄今已报道的57个Olmsted综合征病例中,91.23%的患者为散发病例,均出现口周角化症状;59.65%的患者有甲营养不良,52.63%的患者出现断指,54.39%的患者有秃发现象。与文献所报道的Olmsted综合征病例不同的是,本家系患者没有断指或秃发症状,不存在TRPV3和MBTPS2基因突变,因而推测很可能为Olmsted综合征的一种新亚型。

关键词： Olmsted综合征全外显子组测序基因突变 pttg1基因掌跖角化症 SNV

基于GEO数据库的肝癌相关差异基因生物信息学分析及初步功能研究

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基于GEO数据库的肝癌相关差异基因生物信息学分析及初步功能研究

作者：陈思琪南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:基因表达谱芯片技术产生了大量的基因芯片及海量的生物学信息,利用众多实验室的基因芯片数据并理解其中蕴含的生物学含义是生物学工作者的挑战及目标。肝癌的发病率在我国位于肿瘤中的第4位,在全世界排名第7,并多与乙肝... 详细信息

研究背景和目的:基因表达谱芯片技术产生了大量的基因芯片及海量的生物学信息,利用众多实验室的基因芯片数据并理解其中蕴含的生物学含义是生物学工作者的挑战及目标。肝癌的发病率在我国位于肿瘤中的第4位,在全世界排名第7,并多与乙肝病毒感染有关。肝癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多基因的过程。对于肝癌发病分子机制的研究传统的方法以单基因为主,研究结果有一定局限性。而基因芯片研究能高通量表现基因的变化,对肝癌发病的分子机制研究有较大的优势。本研究拟对GEO数据库中的肝癌基因芯片作生物信息学数据分析,筛选出差异表达基因,然后对筛选出的差异表达基因进行生物学功能分析,进而对肝癌发病的分子机制予以探讨,并进行相应的初步功能试验验证。研究方法:1、从GEO数据库下载基因芯片数据GSE19665、GSE41804,使用GEO网站的GEO2R分析工具对基因芯片数据进行分析,筛选差异表达基因;利用Cytoscape软件处理STRING获得的PPI网络图,MCODE插件处理后获得显著基因模块,共有25个显著差异基因,利用UALCAN和GEPIA网站进一步验证这25个基因在肝癌患者和正常人群的表达差异性,最终得到20个显著差异基因;利用DAVID在线数据库查询这20个显著差异基因的GO和KEGG表达情况,并对获得的结果进行分析,得知其中4个显著差异基因在各条关键信号通路中均有涉及,对这4个基因进行GSEA分析,获得的结果进一步验证了前面的推断;2、对4个显著差异基因进行文献查询,并选定pttg1作为研究对象,构建该基因的肝癌稳定过表达细胞株Hep G2-pttg1和肝癌稳定干扰细胞株MHCC 97H-pttg1-shRNA1、MHCC97H-pttg1-shRNA2。随后进行体外细胞增殖能力检测实验MTT、平板克隆和softagar实验,迁移能力检测实验transwell实验,发现pttg1和肝癌细胞之间存在一定关系;查询数据库中pttg1在肝癌中的基因拷贝数和甲基化表达情况与肝癌发生发展的关系。研究结果:1、通过GEO数据库共筛选出197个差异表达基因,其中上调的差异基因数目为37个,下调的差异基因数目为160个;通过Cytoscape和MCODE筛选后获得25个显著差异基因,验证后获得20个显著差异基因,随后的KEGG信号通路分析显示,肝癌中影响最大的信号通路是卵母细胞减数分裂和细胞周期,其次为孕酮介导的卵母细胞成熟和p53通路;对涉及这4条通路的基因取交集,获得了 CCNB1、CCNB2、CDC25C和pttg1这4个基因,这些基因启动子低甲基化是导致其表达上调,进而促进肝癌的发生和演进;2、pttg1过表达促进肝癌细胞的增殖和迁移;干扰pttg1抑制肝癌细胞的增殖和迁移。结论:（1）卵母细胞减数分裂、细胞周期信号通路的异常活化及其通路相关基因pttg1、CCNB1、CCNB2、CDC25C表达上调在肝癌的发生和演进过程中发挥着重要的作用;（2）卵母细胞减数分裂、细胞周期信号通路相关基因pttg1过表达促进肝癌细胞的增殖和迁移,干扰pttg1抑制肝癌细胞的增殖和迁移;其表达受基因拷贝数和甲基化水平的调控。

关键词：肝癌 GEO数据库基因芯片卵母细胞减数分裂信号通路 pttg1基因