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Ets-2 deletion in myeloid cells attenuates IL-1α-mediated inflammatory disease caused by a ptpn6 point mutation

Cellular & Molecular Immunology 2021年第7期18卷 1798-1808页

作者： Sarang Tartey Prajwal Gurung Rajendra Karki Amanda Burton Paul Hertzog Thirumala-Devi Kanneganti Department of Immunology St.Jude Children’s Research HospitalMemphisTN38105USA Inflammation Program University of IowaIowa CityIA52241USA Centre for Innate Immunity&Infectious Diseases Hudson Institute of Medical ResearchDepartment of Molecular and Translational SciencesMonash UniversityClaytonVictoria3168Australia

The SHP-1 protein encoded by the ptpn6 gene has been extensively studied in hematopoietic cells in the context of inflammation.A point mutation in this gene(ptpn6spin)causes spontaneous inflammation in mice,which has a striking similarity to neutrophilic dermatoses in *** findings highlighted the role of signaling adapters and kinases in promoting inflammation in ptpn6spin mice;however,the underlying transcriptional regulation is poorly ***,we report that SYK is important for driving neutrophil infiltration and initiating wound healing responses in ptpn6spin ***,we found that deletion of the transcription factor Ets2 in myeloid cells ameliorates cutaneous inflammatory disease in ptpn6spin mice through transcriptional regulation of its target inflammatory ***,Ets-2 drives IL-1α-mediated inflammatory signaling in neutrophils of ptpn6spin ***,in addition to its well-known role in driving inflammation in cancer,Ets-2 plays a major role in regulating IL-1α-driven ptpn6spin-mediated neutrophilic dermatoses.

关键词： Autoinflammation ETS-2 IL-1α Neutrophilic dermatoses ptpn6 SHP-1

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ptpn6重组蛋白的真核表达纯化及功能鉴定

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生物技术 2017年第5期27卷 428-433页

作者：熊玉锋陈洁盈钱雯郝文波南方医科大学检验与生物技术学院抗体工程研究所广东广州510515 中山大学中山医学院干细胞与组织工程研究中心广东广州510515

[目的]构建真核表达载体pENTER-ptpn6,在HEK293T细胞中表达并纯化,并初步探讨ptpn6对肺癌细胞系A549细胞增殖能力的影响。[方法]构建真核表达载体pENTER-ptpn6,利用jetPRIME分别转染HEK293T和A549细胞,用Western Blot检测ptpn6在细胞中... 详细信息

[目的]构建真核表达载体pENTER-ptpn6,在HEK293T细胞中表达并纯化,并初步探讨ptpn6对肺癌细胞系A549细胞增殖能力的影响。[方法]构建真核表达载体pENTER-ptpn6,利用jetPRIME分别转染HEK293T和A549细胞,用Western Blot检测ptpn6在细胞中的表达情况,并通过磁珠纯化ptpn6蛋白,最后利用CCK-8法检测ptpn6对A549的增殖影响并绘制细胞生长曲线。[结果]Western Blot结果显示转染细胞内有ptpn6的高表达,磁珠纯化得到高纯度的目标蛋白,而且转染后的肺癌细胞A549增殖能力较对照组显著下降。[结论]成功构建了真核表达质粒pENTER-ptpn6并在真核表达系统中表达和纯化,重组ptpn6具有抑制A549细胞的增殖的作用,为进一步探讨ptpn6基因的功能及寻找治疗肺癌新方向奠定了基础。

关键词： ptpn6 A549 真核表达增殖

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去甲基化药物联合去乙酰化酶抑制剂对THP-1细胞中ptpn6表达的作用

去甲基化药物联合去乙酰化酶抑制剂对THP-1细胞中PTPN6表达的作用

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作者：房成河北医科大学

学位级别：硕士

目的:观察联合去甲基化药物与去乙酰化酶抑制剂对抑癌基因ptpn6表达的影响,通过对白血病细胞株的观察间接了解两药联合是否能增强抗白血病作用。方法:1.应用甲基化PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)检测THP-1细胞株ptpn6基因的甲基化... 详细信息

目的:观察联合去甲基化药物与去乙酰化酶抑制剂对抑癌基因ptpn6表达的影响,通过对白血病细胞株的观察间接了解两药联合是否能增强抗白血病作用。方法:1.应用甲基化PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)检测THP-1细胞株ptpn6基因的甲基化状态。2.以不同浓度的去甲基化药物(阿扎胞苷)与组蛋白去乙酰化酶抑制剂(西达本胺和帕比司他)单独或联合应用于细胞株,应用qt-PCR方法检测ptpn6m RNA表达的变化,应用Western Blot技术检测ptpn6蛋白水平的变化。结果:***-1细胞株DNA中ptpn6基因存在甲基化。2.阿扎胞苷可剂量-时间依赖性影响THP-1细胞株ptpn6m RNA的表达(Pptpn6m RNA的影响存在时间依赖性(Pptpn6表达,并优于二者单独应用,且联用效果大于两药单用效应总和(Pptpn6的表达水平,抑制肿瘤细胞株的增殖。2.联合应用去甲基化药物和去乙酰化酶抑制剂能明显增加白血病细胞株THP-1细胞中抑癌基因ptpn6表达,其作用优于单药应用,且联用效应超过二者单用效应的总和。

关键词：阿扎胞苷西达本胺帕比司他 THP-1 ptpn6

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ptpn6通过抑制SP1/p38 MAPK信号通路促进前列腺癌细胞的化疗敏感性

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现代肿瘤医学 2020年第16期28卷 2764-2769页

作者：吾甫尔·卡德尔王磊多尔坤·沙衣热木新疆医科大学附属哈密市中心医院泌尿外科新疆哈密839000

目的:研究ptpn6对前列腺癌细胞PC3的作用及其作用机制。方法:RT-PCR和Western blot实验检测前列腺癌组织和细胞以及癌旁组织和人前列腺上皮细胞中ptpn6的表达量;CCK-8和EDU染色实验检测ptpn6对前列腺癌细胞PC3增殖的影响;Western blot... 详细信息

目的:研究ptpn6对前列腺癌细胞PC3的作用及其作用机制。方法:RT-PCR和Western blot实验检测前列腺癌组织和细胞以及癌旁组织和人前列腺上皮细胞中ptpn6的表达量;CCK-8和EDU染色实验检测ptpn6对前列腺癌细胞PC3增殖的影响;Western blot实验检测耐药相关蛋白P-gp和MRP-1的蛋白表达水平。结果:RT-PCR和Western blot结果显示,ptpn6在前列腺癌组织和细胞中的表达量显著低于癌旁组织和人前列腺上皮细胞中的表达量;过表达ptpn6显著抑制前列腺癌PC3细胞的增殖,并降低PC3细胞的耐药性;进一步的研究结果表明ptpn6可通过抑制SP1,并抑制p38 MAPK通路抑制PC3细胞的增殖和耐药。结论:ptpn6能够抑制前列腺癌细胞PC3的增殖和耐药,提高其化疗敏感性,作用机制是通过调控SP1/p38 MAPK信号通路来实现的,这一结果能够为临床上前列腺癌的诊断和治疗提供分子基础。

关键词： ptpn6 前列腺癌细胞PC3 SP1/p38 MAPK 耐药

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PI3K抑制剂PI-103对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞增殖的影响及其机制的研究

PI3K抑制剂PI-103对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞增殖的影响及其机制...

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作者：李凤扬州大学

学位级别：硕士

淋巴瘤(Lymphoma)是一组原发于淋巴结和结外淋巴组织的恶性肿瘤,根据病理学分类,可以将其分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’slymphoma,HL)以及非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)。弥漫性大 B 细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymp... 详细信息

淋巴瘤(Lymphoma)是一组原发于淋巴结和结外淋巴组织的恶性肿瘤,根据病理学分类,可以将其分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’slymphoma,HL)以及非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)。弥漫性大 B 细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是最常见的一种非霍奇金淋巴瘤,也是成人最常见的恶性淋巴肿瘤。虽然,60%的DLBCL患者可以通过R-CHOP(利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、强的松)的治疗方案获得缓解,但是临床研究显示,这部分病人中仍有三分之一的患者存在复发的可能性。同时,还有部分难治性患者对此治疗方案并不敏感。磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)通路在多种肿瘤中高度且频繁激活,它通过产生磷脂、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸影响肿瘤细胞的生长、增殖、存活、侵袭和血管生成。磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(Protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路在调节包括DLBCL在内的多种恶性肿瘤细胞的增殖和存活上发挥着重大作用。因此PI3K有望成为DLBCL一种潜在治疗靶点,而抑制PI3K活性有望成为DLBCL的一种有效的治疗方法。目的本课题主要利用人DLBCL细胞系OCI-LY10、OCI-LY7、HBL-1、SC-1等,研究PI3K抑制剂PI-103对人DLBCL细胞系增殖的影响。同时采用高通量测序以及生物信息学的方法,探索PI-103作用的分子机制,旨在为PI-103的临床应用提供新的依据。方法(1)采用台盼蓝活细胞计数的方法,用PI-103及DMSO对照连续处理人DLBCL细胞系96 h,每24 h计数一次,检测不同处理时间以及不同药物浓度对细胞增殖的影响。(2)采用细胞活力检测(CCK-8)的方法,用PI-103及DMSO对照连续处理人DLBCL细胞系96h,检测不同药物浓度对细胞增殖的影响,同时检测该药物对DLBCL细胞系的半抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。(3)采用小鼠皮下荷瘤的方法,检测PI-103在体内对DLBCL细胞系增殖的影响。(4)用碘化丙啶染色和流式细胞术检测在PI-103及DMSO对照处理下,人DLBCL细胞系周期的变化。(5)用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)染色和流式细胞术检测在PI-103及DMSO对照处理下,人DLBCL细胞系周期的变化。(6)用Annexin V和流式细胞术的方法检测在PI-103及DMSO对照处理下,人DLBCL细胞系凋亡的变化。(7)通过RNA-seq的方法检测PI-103对相关基因的表达的影响,并通过生信分析的方法寻找PI-103调控的基因以及信号通路。(8)通过Real-time qPCR的方法,检测不同浓度的PI-103处理下的人DLBCL细胞系中ptpn6基因转录水平的变化。(9)通过蛋白免疫印迹(Western blot,WB)的方法,检测不同浓度PI-103处理下的人DLBCL细胞系中ptpn6蛋白水平的变化。(10)通过WB的方法,检测不同浓度PI-103处理下的人DLBCL细胞系中AKT磷酸化水平的变化。(11)将ptpn6克隆到MSCVPIG载体上,构建过表达ptpn6质粒,并用逆转录病毒感染到人DLBCL细胞株OCI-LY10上,过表达ptpn6,同时检测PI-103对过表达细胞系增殖以及周期的影响。结果(1)活细胞计数实验以及CCK-8实验结果显示,PI-103对人DLBCL细胞系增殖的抑制呈现剂量和时间的依赖,随着药物浓度以及药物处理时间的增加,活细胞的数目明显减少。(2)小鼠皮下荷瘤实验结果显示,PI-103在体内可以抑制人DLBCL细胞的增殖。(3)细胞周期实验结果显示,PI-103可以将人DLBCL细胞系阻滞在G1期,同时,随着药物浓度的增加,G1期的阻滞越明显。(4)细胞凋亡实验结果显示,PI-103并不能增加人DLBCL细胞系中早期凋亡以及晚期凋亡细胞的比例。(5)生信分析结果显示,在OCI-LY10细胞中,PI-103处理后使得九百多基因表达上调,两百多基因表达下调。其中,ptpn6为下调最为显著的基因之一。GSEA分析提示,PI-103可能直接参与细胞周期的调控。(6)Real-time qPCR验证结果显示,在人DLBCL细胞系中,PI-103可以抑制PT PN6在转录水平的表达。(7)WB的验证结

关键词： DLBCL PI-103 ptpn6 P-AKT 细胞增殖

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功能性转录组学分析揭示细颗粒物暴露调控的肺泡上皮细胞关键分子通路

功能性转录组学分析揭示细颗粒物暴露调控的肺泡上皮细胞关键分子...

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中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛

作者：卞倩梁婕陈东亚凌敏江苏省疾病预防控制中心毒理与功能评价所

【目的】近年来,转录组学分析技术的迅速发展,为从更加全面的角度理解化合物的生物效应提供了有益的帮助。本研究旨在应用RNA microarray技术结合高通量数据分析,对细颗粒物（PM2.5）引起的肺泡上皮细胞模型（A549）转录组改变及其生物... 详细信息

【目的】近年来,转录组学分析技术的迅速发展,为从更加全面的角度理解化合物的生物效应提供了有益的帮助。本研究旨在应用RNA microarray技术结合高通量数据分析,对细颗粒物（PM2.5）引起的肺泡上皮细胞模型（A549）转录组改变及其生物效应进行研究。【材料和方法】100μg/mL PM2.5处理A549细胞24h,采用mRNA microarray技术分析转录组差异性表达;G0分类发现差异表达基因的功能性富集。随后通过qRT—PCR技术对差异表达基因进行细胞学验证,并对经过细胞实验验证的差异表达基因进行基因-转录因子调控网络分析。A549细胞分别暴露于100和500μg/mL PM2.5 24h,测定其细胞周期和细胞凋亡水平。【结果】PM2.5处理A549细胞,引起464个基因表达上调及107个基因表达下调。G0分析发现其中30个差异表达基因参与细胞周期调控,30个差异表达基因参与细胞死亡过程调控,是最为显著的GO富集分类。ptpn6在该调控网络中发挥重要调控作用,其表达水平显著下调。A549细胞暴露于100和500μg/mL PM2.5 24h,引起A549细胞周期G2期阻滞;且死亡细胞比例分别为22.69±0.39%和70.31±0.57%,较对照组显著升高,表现出很强的细胞毒性作用。采用脂质体转染ptpn6质粒,使其在A549细胞内的表达恢复至对照水平,再经PM2.5处理,可显著降低细胞周期的阻滞以及死亡细胞的比例。【结论】通过以上研究发现,高通量技术不同于传统的毒理学分析方法,能够全面地揭示外源化合物的细胞生物学效应,促进发现新的关键分子通路。ptpn6在PM2.5产生的肺上皮细胞毒性作用中,可能发挥重要的保护性作用。

关键词：细颗粒物PM2.5 转录组学高通量技术 ptpn6

来源： cnki会议评论

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EP300参与舒尼替尼耐药的机制研究

EP300参与舒尼替尼耐药的机制研究

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作者：张才天津医科大学

学位级别：硕士

目的肿瘤的复发和耐药是临床治疗失败的主要因素,针对肾癌复发或者VI期晚期肾癌患者,NCCN指南推荐以抗血管新生药物为主的治疗方案,在临床实践中发现,对抗血管新生药物治疗的患者很快就会发生耐药,为了探索抗血管新生药物舒尼替尼在肾... 详细信息

目的肿瘤的复发和耐药是临床治疗失败的主要因素,针对肾癌复发或者VI期晚期肾癌患者,NCCN指南推荐以抗血管新生药物为主的治疗方案,在临床实践中发现,对抗血管新生药物治疗的患者很快就会发生耐药,为了探索抗血管新生药物舒尼替尼在肾癌治疗中耐药的原因,发现潜在的耐药靶点,揭示sunitinib耐药的机制,寻找逆转耐药的治疗策略。我们对本课题组的三对control和treatment组的细胞进行了全外显子和RNA-seq的测序,通过全外显子的突变检测分析导致获得性耐药表型出现的重要突变基因;对RNA-seq的差异表达的基因进行GO和KEGG富集分析,对细胞的功能、参与的生物途径及细胞中的定位以及受影响显著的信号通路进行注释。结合生物信息学样本数据库的信息,预测其可能的耐药调控机制,并通过分子生物学的方法来进行验证。方法1.对全外显子的测序数据进行质量评估、序列比对、突变检测分析,对发现的突变基因进行信号通路注释,并对发现的EP300的突变位点进行注释和可视化分析,应用c Bio Portal和GEPIA在线数据库对EP300突变和表达量做预后分析。2.对转录组表达谱的测序数据进行质量评估、序列比对、差异表达分析和转录组的一致性评价;应用DAVID网站对差异表达的基因进行GO和KEGG富集分析,并对富集结果进行可视化分析。3.对富集分析发现的受影响显著的信号通路上游调控基因进行挖掘,应用c Bio Portal在线分析网站对发现的调控基因进行共表达分析。4.应用EP300抑制剂C646和敲减的方法来验证EP300是否调控ptpn6的表达以及能否导致肿瘤细胞对sunitinib的耐药进行探索性分析。结果1.通过全外显子测序数据的变异检测分析,突变的EP300通过KEGG信号通路注释发现对信号通路的功能影响显著;EP300突变在肾透明细胞癌中的发生率不高;肾透明细胞癌中癌和癌旁组织的EP300的表达量没有差异,EP300表达量和患者的OS和PFS呈正相关性。2.样本间的Person相关系数（R2＞0.9）、层次聚类分析和PCA的方法结果表明样本间基因表达差异性很小;通过差异表达基因的聚类分析,能够将control组和treatment组明显分开;差异表达基因的GO和KEGG富集分析,分子功能（MF）富集在蛋白二聚体的活性,细胞组分（CC）富集在胞浆膜,生物学功能（BP）富集在信号转导,KEGG富集在肿瘤的信号通路。3.c Bio Portal共表达分析结果发现EP300和KIT、EP300和ptpn6表达之间具有弱相关性;和对照组相比较,EP300和KIT基因在treatment组中表达上调,ptpn6表达下调。4.敲减或抑制EP300以后,和对照组相比,KIT基因表达量明显上调,ptpn6的表达量没有差异;抑制EP300,对照组和处理组的IC50没有差异;敲减EP300后,处理组的IC50值大约是对照组的2倍。结论1.通过全外显子测序我们发现了EP300发生截短突变,通过信号通路的注释分析,发现EP300突变对下游众多的信号通路影响显著,可能是sunitinib耐药基因。2.通过RNA-seq数据差异表达基因的GO和KEGG富集分析,下游信号通路的改变可能是诱导肿瘤细胞对sunitinib耐药的原因。***300没有调控ptpn6的表达;EP300和KIT基因的表达之间可能具有相关性,敲减EP300可以诱发ACHN细胞对sunitinib的耐药。

关键词： EP300 ptpn6 KIT 舒尼替尼耐药全外显子测序 RNA-Seq

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