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EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡及其凋亡相关蛋白变化的研究

EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡及其凋亡相关蛋白变化的研究

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作者：李刚广西医科大学

学位级别：硕士

原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma,PHC)是世界流行最广的恶性肿瘤之一,其在所有癌症中恶性程度高,治疗最困难,恶性发展速度最快,生存时间最短。2007年全世界的肝癌死亡例数为680 000,在全球肿瘤死因中位列第三。而我国由于肝炎和... 详细信息

原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma,PHC)是世界流行最广的恶性肿瘤之一,其在所有癌症中恶性程度高,治疗最困难,恶性发展速度最快,生存时间最短。2007年全世界的肝癌死亡例数为680 000,在全球肿瘤死因中位列第三。而我国由于肝炎和肝炎转肝硬化的病人众多,致使肝癌在我国的发病率和死亡率均高于世界平均水平。我国每年死于肝癌人数占全世界肝癌死亡人数的55%以上,目前尚缺乏有效的治疗药物。因此为降低其发病率和死亡率,诸多学者长期致力于防治肝癌的研究。细胞凋亡比例明显失调是肿瘤发生发展中的重要因素,如能诱导肿瘤细胞凋亡,使其凋亡的比例增加,则可能遏制肿瘤的发生发展。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是绿茶多酚提取物儿茶素(catechin)的主要成分,具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。但是较高浓度的EGCG可直接导致细胞坏死,所以及早发现细胞的早期凋亡,控制EGCG的剂量,是减少药物对细胞损伤的最有效的方法。多数有关EGCG诱导肿瘤细胞凋亡的研究,是依据流式细胞术(FCM)的凋亡细胞峰(亚G1细胞峰)来做出评价的。然而,亚G1细胞群的出现并非是凋亡细胞的特异变化。因此,本研究建立了一种检测细胞早期凋亡的新方法—psab-va∕el法,来检测EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡的发生。同时,运用SelDI-TOF-MS和MALDI-TOF/TOF蛋白质谱技术检测与EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡相关的关键蛋白,探讨EGCG诱导人肝癌细胞早期凋亡的可能机制。第一章psab-va∕el法检测细胞早期凋亡方法的建立目的:建立一种经济实用且特异性高的细胞早期凋亡检测新方法,并与常用的Annexin V-FITC/PI法比较。方法:1、以不同质量浓度的EGCG作用Jurkat细胞,采用Annexin V-FITC/PI法检测Jurkat细胞凋亡率,并以此作为细胞凋亡模型;2、尝试用不同的标记有荧光染料的psab抗体和核酸荧光染料来检测此细胞凋亡模型。结果:1、经Annexin V-FITC/PI法检测,Jurkat细胞随着EGCG浓度的增加,正常细胞比例不断下降,而晚期凋亡细胞的百分比明显升高,同时早期凋亡细胞保持在10%左右;2、对各种标记有荧光染料的psab抗体和核酸荧光染料比较后,发现psab- va和el搭配使用,能较好地检测细胞凋亡。结论:1、psab-va∕el法和Annexin V-FITC/PI法在检测细胞凋亡各个阶段的百分比时,其结果的变化趋势一致;2、psab-va∕el法可能是一种比较灵敏的细胞早期凋亡检测方法。第二章EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡的变化规律。方法:1、通过MTT法初步筛选EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用浓度;2、利用psab-va∕el法(第一章所述),通过流式细胞仪检测EGCG对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用和早期凋亡的诱导效应。结果:EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡的最佳作用剂量是100mg/L,早期凋亡率达48.16%。随着EGCG浓度增加(125～175mg/L),早期凋亡率明显下降,而晚期凋亡细胞的百分比明显升高。结论:EGCG有明显的诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡的作用,且呈剂量依赖性,小剂量起诱导凋亡作用,而大剂量则对细胞株具有杀伤作用,直接导致细胞坏死。第三章EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡后的相关蛋白变化及鉴定研究目的:利用蛋白质谱技术检测与EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡相关的关键蛋白,探讨EGCG诱导人肝癌细胞早期凋亡的可能机制。方法:1、运用SelDI-TOF-MS技术筛选人肝癌血清和人肝癌SMMC-7721细胞裂解液中共同存在的蛋白;2、运用SelDI-TOF-MS技术检测EGCG诱导SMMC-7721细胞凋亡后的细胞裂解液中存在的蛋白;3、检测在肝癌血清、SMMC-7721细胞裂解液以及EGCG作用后的SMMC-7721细胞裂解液中,共有的关键蛋白;4、运用MALDI-TOF/TOF质谱技术平台,并结合iTRAQ蛋白质定量试剂的使用,对上述关键蛋白标志物进行鉴定。结果:1、人肝癌血清和人肝癌SMMC-7721细胞裂解液中共同存在的蛋白有23个;2、SMMC-7721细胞裂解液与EGCG诱导后的SMMC

关键词： EGCG 人肝癌SMMC-7721细胞 psab-va∕el法细胞早期凋亡 SelDI-TOF-MS MALDI-TOF/TOF

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