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基于prrsv orf2a基因等温扩增检测方法的建立及其N-糖基化位点突变体的构建

基于PRRSV ORF2a基因等温扩增检测方法的建立及其N-糖基化位点突...

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作者：陈素贞新疆农业大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,prrsv)自上世纪90年代初期开始在我国流行至今,作为影响猪养殖业的重要传染病,该病给全球各地的猪养殖产业造成了程度不一的经济损失。由于prrsv的传播速... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,prrsv)自上世纪90年代初期开始在我国流行至今,作为影响猪养殖业的重要传染病,该病给全球各地的猪养殖产业造成了程度不一的经济损失。由于prrsv的传播速度较快和毒株易突变重组的特性,商品化疫苗不能对变异毒株提供有效的保护,对本病的防控依然面临着许多障碍。本研究基于prrsv orf2a基因,设计含有探针的特异性引物组,使用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)或重组酶介导扩增技术(Recombinase aided amplification,RAA)与M-MLV逆转录酶和荧光定量PCR仪或侧流层析试纸条结合,分别建立了RT-RPA(荧光型)和RT-RAA-LF两种等温扩增检测方法,只需在短时间内恒温扩增,通过扩增曲线的出峰和试纸条检测线的条带显示,即可判定检测结果。以prrsv XH-GD全长质粒为模板,克隆构建了p MD18-T-orf2a真核表达质粒,质粒的拷贝数经连续10倍稀释,检测RT-RPA(荧光型)方法和RT-RAA-LF方法的敏感性,结果表明:RT-RPA(荧光型)方法的最低检测限为1.6×10～1copies/μL,RT-RAA-LF方法的最低检测限1.6×10～2copies/μL。选择相关猪传染病病原毒株与prrsv(经典毒株、高致病性毒株和NADC30类毒株)进行特异性检测,结果表示两种等温检测方法RT-RPA(荧光型)和RT-RAA-LF仅对prrsv具有特异性,均能检测到三种类型的prrsv毒株。从海南省不同市县的猪场共采集160份临床样本,等温检测方法与PCR方法对比验证,RT-RPA(荧光型)方法检测的敏感性和特异性分别为100%和97.9%,RT-RAA-LF方法检测的敏感性和特异性分别为100%和96.8%。同时对实验室常用核酸富集方法与构建的RT-RPA方法搭配比较,其中Vazyme的核酸提取试剂盒及核酸提取仪与等温检测方法较合适在临床检测中应用。基于prrsv orf2a基因建立RT-RPA(荧光型)和RT-RAA-LF两种等温扩增检测方法,具有灵敏性高、特异性强及检测效率高的优点,适宜临床现场的应用。进一步研究由prrsv orf2a基因表达的GP2a蛋白的作用机制,构建了prrsv GP2a蛋白N-糖基化突变体,初步探究N-糖基化突变对GP2a蛋白与受体CD163之间的影响。构建p EGFP-GP2a及其突变体和p Ds Red-CD163真核表达质粒,通过激光共聚焦显微镜验证所有prrsv GP2a N-糖基化突变体均能在细胞质中与CD163共定位,并且GP2a蛋白出现在细胞核内表达的现象。以上为继续研究GP2a蛋白与prrsv入侵机制的关系提供理论基础。

关键词： prrsv orf2a GP2a RPA RAA N-糖基化突变 CD163

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