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人类细胞自噬相关基因prr7的功能研究

人类细胞自噬相关基因PRR7的功能研究

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作者：郝东霞河北联合大学

学位级别：硕士

细胞的死亡与增殖是有机体生命过程中对立统一的两个方面,共同维持着体内细胞的动态平衡及其内环境的稳定。程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)与有丝分裂相互协调,调控胚胎生长,器官发育与退化,免疫,造血等生理过程。目的: ... 详细信息

细胞的死亡与增殖是有机体生命过程中对立统一的两个方面,共同维持着体内细胞的动态平衡及其内环境的稳定。程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)与有丝分裂相互协调,调控胚胎生长,器官发育与退化,免疫,造血等生理过程。目的: 为了发现与PCD相关的人类新基因,本实验室利用荧光素酶报告基因筛选技术,对1000个人类未知功能基因进行了规模化筛选,挑选出显著影响内参的基因prr7进行深入的功能和作用机理研究,为开发有重要生理活性及临床应用前景的功能新基因奠定基础。方法: 1.目的基因的筛选:利用双荧光素酶报告基因技术对1000个人类未知功能基因进行规模化筛选,挑选出下调内参的基因;确定prr7基因为我们要研究的目的基因。 2.生物信息学分析:通过DNAman、DNAstar等生物信息学软件分析预测prr7基因的核酸及蛋白序列,表达谱,定位,信号肽,跨膜结构域,定位,蛋白疏水性。 3.真核表达载体构建:利用分子克隆技术将目的基因插入到真核表达载体PCDNA3.1b(-)-myc-his(以下简称PCDB)、pEGFPN1、pEGFPC3和PCDNA3.1-myc等载体上,构建真核表达载体。 4.表达谱分析:利用RT-PCR技术分析prr7基因的细胞表达谱。 5.细胞增殖检测:利用形态学观察以及CCK8技术检测细胞生长活力,绘制生长活力曲线。 6.细胞存活检测:通过Calcein AM和EthD-1染色,利用荧光显微镜观察,并用Metamorph6.3图像分析处理软件分析红绿荧光比例,确定细胞存活情况。 7.程序性细胞死亡检测:利用流式细胞术进行细胞膜磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外翻实验和线粒体膜电位实验以检测细胞程序性死亡。 8. prr7引起的程序性细胞死亡与caspase关系检测:Western blot检测凋亡相关基因对caspase底物PARP的切割作用,同时利用caspase广谱抑制剂从另一侧面验证prr7基因引起程序性细胞死亡与caspase信号通路的关系。 9. prr7引起的程序性细胞死亡与P53关系的检测:利用RT-PCR技术检测prr7基因对凋亡相关分子P53及DRAM的mRNA水平的调控作用。 10.亚细胞定位:借助GFP融合蛋白,用细胞器特异性染料,在共聚焦显微镜下观察prr7基因的亚细胞定位。结果: 1.通过双荧光素酶报告基因方法筛选了1000个人类未知功能的新基因,并对其结果分析总结,发现了能够明显下调内参的人类未知功能新基因prr7。 2.生物信息学分析发现,prr7基因在NCBI中的编号为NM30567,geneID为80758,由两个外显子和两个内含子组成,该基因全长1543bp,从491-1315有一个编码274个氨基酸的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码一个31kd的蛋白。染色体定位为5q35,EST支持很好。该蛋白N端有一个跨膜区,为一次跨膜蛋白,富含Pro(脯氨酸)丰富的胞内段,且在各物种间高度同源。 3.利用光学显微镜观察发现,过表达prr7后的293T细胞出现变小,变圆,皱缩,染色质凝聚,同时从培养皿中脱落。CCK8细胞活力检测发现,过表达prr7后的293T细胞与凋亡相关基因BAX呈现相似的生长情况,即细胞活力明显减弱。 4.利用细胞存活染料Calcein AM和EthD-1双染发现,过表达prr7的293T细胞其红色荧光明显增加,即死亡细胞显著增加。流式细胞术检测发现,过表达prr7能够引起PS外翻,且引起线粒体膜电位下降的细胞数明显增加,进一步说明prr7引起程序性细胞死亡。 5. Western blot检测发现,过表达prr7没有出现PARP的切割作用,同时利用caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK,流式细胞术检测过表达prr7后引起的凋亡作用未被抑制,说明prr7引起的程序性细胞死亡为非caspase依赖。 6.将prr7瞬时转染P53缺失细胞系H1299,流式细胞术检测PS外翻,结果与阴性对照没有明显差异,提示prr7引起程序性细胞死亡可能是P53依赖。 7. RT-PCR检测发现,过表达prr7后引起P53和DRAM mRNA表达水平的增加。 8. prr7与LC3-GFP共转染到HeLa细胞中,发现正常对照组LC3荧光均匀分布于细胞浆,而prr7能够引起LC3斑点状分布,且荧光的信号强度增加。Western blot检测发现,prr7能够引起LC3Ⅰ型向LC3Ⅱ型转变,提示prr7可能参与了自噬性的程序性细胞死亡(即Ⅱ型程序性细胞死亡)。 9. RT-PCR检测P53引起自噬依赖基因DRAM表达情况,证明prr7能够引起DRAM mRNA的表达水平增加。 10.共聚焦显微镜观察

关键词： prr7 自噬凋亡 P53 膜蛋白

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