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肉鸭prkaa1和prkaa2基因表达水平及其与剩余采食量性状的相关性分析

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南京农业大学学报 2018年第5期41卷 925-930页

作者：金四华杨磊童雨翠范心凤何婷婷汪加发李永胜耿照玉安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 黄山强英鸭业有限公司安徽黄山245461 黄山市畜牧兽医技术推广中心安徽黄山245000

[目的]本试验旨在探讨AMP激活蛋白激酶α1和α2基因(prkaa1、prkaa2)在高、低饲料效率组肉鸭胸大肌、腿肌和肝脏中表达水平及其与剩余采食量(RFI)性状的相关性。[方法]选取体质量相近的H系肉公鸭1 000只,测定21~42日龄时的采食量和体增... 详细信息

[目的]本试验旨在探讨AMP激活蛋白激酶α1和α2基因(prkaa1、prkaa2)在高、低饲料效率组肉鸭胸大肌、腿肌和肝脏中表达水平及其与剩余采食量(RFI)性状的相关性。[方法]选取体质量相近的H系肉公鸭1 000只,测定21~42日龄时的采食量和体增重,计算RFI。挑选高、低RFI组肉鸭各8只,采用定量PCR检测prkaa1和prkaa2在2组肉鸭胸大肌、腿肌和肝脏中表达水平。[结果]prkaa1 mRNA在低RFI组肉鸭胸大肌中表达量极显著高于高RFI组(Pprkaa2 mRNA表达量显著高于高RFI组(Pprkaa1 mRNA相对表达量与日采食量、饲料转化率和RFI显著负相关(Pprkaa2 mRNA相对表达量与日采食量和RFI显著负相关(Pprkaa1和prkaa2基因在高、低RFI组肉鸭胸大肌和腿肌中表达量存在显著差异且与剩余采食量性状显著相关。

关键词：鸭剩余采食量 prkaa1 prkaa2 相关性

贵州从江香猪FoxO4、prkaa1基因在不同组织中的表达分析

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基因组学与应用生物学 2017年第3期36卷 841-846页

作者：孙成娟许厚强陈伟陈祥周迪赵焕平吴萍张青青陈福高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室贵阳550025 贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵阳550025 贵州大学生命科学学院贵阳550025

为研究FoxO4、prkaa1基因在从江香猪不同组织中的表达情况,本实验采用实时荧光定量PCR技术,检测FoxO4、prkaa1基因的mRNA表达量,分析FoxO4、prkaa1在贵州从江香猪不同组织的差异表达。结果显示,FoxO4基因mRNA在从江香猪所检测的9个组织... 详细信息

为研究FoxO4、prkaa1基因在从江香猪不同组织中的表达情况,本实验采用实时荧光定量PCR技术,检测FoxO4、prkaa1基因的mRNA表达量,分析FoxO4、prkaa1在贵州从江香猪不同组织的差异表达。结果显示,FoxO4基因mRNA在从江香猪所检测的9个组织样中均有表达,其中在脂肪组织中表达量最高,且差异极显著(p1),在背最长肌组织中表达量最低;prkaa1基因mRNA在从江香猪所检测的9个组织样中也均有表达,其中在肺组织中表达量最高,且差异极显著(p1),在脂肪组织中表达量次之,在背最长肌组织中表达量最低。FoxO4、prkaa1基因可能在肌内脂肪(IMF)沉积中发挥重要作用,为进一步研究FoxO4、prkaa1的功能奠定基础。

关键词： FoxO4 prkaa1 荧光定量PCR 贵州从江香猪

PRKAA1基因相关LncRNA的筛选鉴定及其在肌内脂肪中的表达调控研究

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作者：吴小敏贵州大学

学位级别：硕士

prkaa1属于AMPK家族中的一员,是生物体内一种重要的蛋白激酶,在能量稳态、脂肪代谢和细胞增殖中具有重要调控作用;LncRNA在生物体胚胎发育、脂肪沉积和细胞分化等过程中发挥重要的作用。本研究用贵州从江香猪和大白猪为研究材料,通过qRT... 详细信息

prkaa1属于AMPK家族中的一员,是生物体内一种重要的蛋白激酶,在能量稳态、脂肪代谢和细胞增殖中具有重要调控作用;LncRNA在生物体胚胎发育、脂肪沉积和细胞分化等过程中发挥重要的作用。本研究用贵州从江香猪和大白猪为研究材料,通过qRT-PCR、分子克隆、细胞培养、细胞转染、Western blot等技术,筛选和鉴定prkaa1相关LncRNA-ALNC1和ALNC2基因,检测脂肪相关基因的表达水平,分析其在肌内、皮下脂肪前体细胞和脂肪细胞分化中的调控机制,探讨影响地方猪优质肉品性状成因,解析LncRNA对猪脂肪沉积和肉质性状的影响,对深入了解我国地方猪优质肉品性状,挖掘、保存和创新利用地方猪种资源等方面都具有重要的科学意义和潜在的应用前景。1.猪prkaa1基因相关LncRNAs的筛选鉴定及其在组织中的表达分析通过在线软件NCBI和NONCODE（http://***/）对prkaa1相关LncRNA进行筛选鉴定。结果成功筛选出prkaa1基因相关LncRNAs（NONSUST030689.1,ALNC1）和（NONSUST004358.1,ALNC2）。序列分析显示:ALNC1全长935 bp,位于17号染色体,ALNC2全长1639 bp,位于11号染色体,克隆序列比原序列插入46 bp,二者具有丰富的二级结构和多个开放阅读框,与prkaa1存在作用靶点,与miR-1226-5p、miR-487b-5p、miR-7156-5p等存在相互作用。组织qRT-PCR结果显示:ALNC1在从江香猪和大白猪的肝脏和大肠中的表达量最高,从江香猪脂肪和背最长肌组织中的表达量极显著高于大白猪（P＜0.01）,ALNC2在从江香猪和大白猪脾脏和肺脏中表达量最高,从江香猪脂肪的表达量显著低于大白猪（P＜0.05）,背最长肌表达量极显著高于大白猪（P＜0.01）。推测两LncRNA可能是影响猪脂肪沉积的重要候选基因。***1和ALNC2在原代脂肪前体细胞诱导分化过程中的表达分析分离并培养5日龄从江香猪原代肌内、皮下脂肪前体细胞。qRT-PCR方法检测两LncRNA和prkaa1在细胞诱导0 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h和120 h时间点的表达量。结果显示:肌内脂肪前体细胞中,prkaa1和ALNC1两基因的表达趋势一致,先上升后下降,60 h表达最高;ALNC2在72 h表达最高;皮下脂肪前体细胞中,prkaa1基因表达趋势与肌内前体细胞中一致,48 h表达最高;ALNC1与ALNC2两基因表现出相同的表达趋势,均先下降后上升再下降,72 h时表达最高。prkaa1、ALNC1和ALNC2与脂肪分化相关基因PPARγ、FAS、ACC与ATGL在从江香猪原代脂肪前体细胞分化过程中的表达模式基本一致,表明ALNC1和ALNC2参与脂肪前体细胞的分化调控作用。***1和ALNC2在前体脂肪细胞分化中的功能研究构建真核表达载体pEGFP-ALNC1和pEGFP-ALNC2,并合成针对ALNC1的siRNA,转染脂肪前体细胞后利用qRT-PCR和Western bloting技术检测脂肪代谢相关基因prkaa1、PPARγ、FAS和HSL在mRNA和蛋白水平的表达,同时测定脂肪前体细胞中甘油三酯和胆固醇的含量。结果显示:过表达ALNC1后,肌内脂肪前体细胞中prkaa1、FAS的mRNA和蛋白水平表达上调,PPARγ蛋白表达下调;皮下脂肪前体细胞中prkaa1、PPARγmRNA和蛋白水平表达上调,HSL和FAS mRNA表达下调;干扰ALNC1后,肌内脂肪前体细胞中prkaa1、FAS和HSL mRNA和蛋白水平表达下调,PPARγmRNA表达上调;皮下脂肪前体细胞中prkaa1和HSL mRNA和蛋白表达下调,PPARγ蛋白表达上调。过表达ALNC2后,肌内脂肪前体细胞中prkaa1、FAS和PPARγmRNA和蛋白水平上调,HSL的蛋白表达下调;皮下脂肪前体细胞中prkaa1和HSL mRNA和蛋白水平上调,FAS mRNA水平下调,PPARγ蛋白水平下调。超表达ALNC1、ALNC2和干扰ALNC1后分别提高和降低了两前体脂肪细胞中甘油三酯和胆固醇的含量。综上所述,本文筛选得到两条与猪prkaa1基因相关的LncRNA ALNC1和ALNC2,两条LncRNA在从江香猪和大白猪不同组织中普遍表达,从江香猪肝脏中的ALNC2的克隆序列比原序列插入了46 bp,可能作为从江香猪育种选育的分子标记片段;prkaa1和ALNC1和ALNC2与脂肪分化相关基因在原代脂肪前体细胞分化过程中的表达模式基本一致,均先上升后下降;猪脂肪前体细胞中,ALNC1和ALNC2对细胞分化相关基因P

关键词：从江香猪 prkaa1 ALNC1 ALNC2 脂肪前体细胞

prkaa1/AMPKα1在胰腺癌中作用及其机制的初步研究

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PRKAA1/AMPKα1在胰腺癌中作用及其机制的初步研究

作者：雍桃兰州大学

学位级别：硕士

研究目的:胰腺癌是一种侵袭性强、预后极差的消化道肿瘤。大多数患者早期没有明显的症状,往往发展成晚期才被确诊。因其特殊的肿瘤微环境,传统治疗也收效不佳,病死率极高。prkaa1是5′-prime-AMP-activated protein kinase（AMPK）的一... 详细信息

研究目的:胰腺癌是一种侵袭性强、预后极差的消化道肿瘤。大多数患者早期没有明显的症状,往往发展成晚期才被确诊。因其特殊的肿瘤微环境,传统治疗也收效不佳,病死率极高。prkaa1是5′-prime-AMP-activated protein kinase（AMPK）的一个催化亚基。现有的研究表明prkaa1基因与肿瘤的发生发展及预后密切相关。本课题将从prkaa1基因在胰腺癌中的表达入手,研究其与胰腺癌患者临床病理特征和预后之间的关系,探索敲低prkaa1基因后胰腺癌细胞表型的变化,初步探究其在胰腺癌进展中的分子机制。研究方法:首先我们通过癌症基因组图谱（TCGA）和GTEx数据库获得了胰腺癌的RNAseq数据和相应的临床信息,分析了prkaa1基因在消化道肿瘤中的表达,以及在正常胰腺组织和胰腺癌组织中的表达。使用q RT-PCR、Western Blot检测胰腺癌细胞和正常胰腺细胞中prkaa1的表达差异。从我院收集75例胰腺癌患者手术标本和20例正常胰腺组织,进行免疫组织化学染色并分析组织中prkaa1的表达,收集患者的临床病理数据进行关联性分析。分别使用TCGA数据库数据（TCGA队列）和我院患者（我院队列）绘制Kaplan-Meier生存曲线,比较prkaa1基因高低表达组之间的生存差异。细胞免疫荧光检测prkaa1基因在胰腺癌细胞中的定位。建立CRISPR-Cas9敲除的稳转细胞株进行CCK-8、集落形成、伤口愈合、Transwell侵袭实验以及流式细胞术测定细胞凋亡实验验证prkaa1基因敲低对胰腺癌细胞表型的影响,并使用Western Blot进一步验证敲低prkaa1基因对胰腺癌细胞增殖、迁徙、凋亡相关蛋白表达的影响。此外,为了探究prkaa1调控胰腺癌进展的初步机制,我们还检测了敲低prkaa1后PI3K、p-PI3K以及Akt、p-Akt蛋白的表达变化。研究结果:从TCGA和GTEx下载的数据分析得出,prkaa1基因在包括胰腺癌的消化道肿瘤中呈高表达。免疫印迹实验及q RT-PCR实验均表明与人正常胰腺上皮细胞h TERT-HPNE相比,prkaa1在胰腺癌细胞系CFPAC-1和PANC-1中的表达增高（P1）。免疫组化显示低分化胰腺癌组织中prkaa1基因表达更高,提取75例患者临床资料并进行随访,使用Pearsonχ检验分析prkaa1表达与胰腺癌患者的临床病理变量的相关性,观察到prkaa1表达水平与年龄（P=0.001）、T分期（P1）和M分期（P=0.003）相关。单因素回归分析显示:prkaa1高表达（HR=1.991,95%CI:1.206-3.288,P=0.007）、CA19-9（HR=1.001,95%CI:1.000-1.002,P=0.014）、T分期（HR=1.959,95%CI:1.241-3.094,P=0.004）以及M分期（HR=4.498,95%CI:2.548-7.939,P=0.001）是胰腺癌患者预后的影响因素。我们将P1）以及prkaa1蛋白高表达（HR=1.879,95%CI:1.067-3.310,P=0.029）是胰腺癌患者不良预后的独立危险因素。两个队列的生存分析结果均显示:prkaa1高表达预示胰腺癌患者预后较差,其中TCGA队列（HR=1.591,95%CI:1.053-2.404,P=0.0276）;我院队列（HR=2.030,95%CI:1.207-3.415,P=0.0013）。选取相对表达较高的两株细胞进行后续的实验。首先建立CRISPR-Ca s9敲除的稳转细胞株,进行集落形成、CCK-8、流式细胞术检测细胞凋亡、伤口愈合以及Transwell侵袭等表型实验,观察到与阴性对照组相比,CFPAC-1和PAN C-1中prkaa1敲低后,细胞增殖和迁徙能力显著抑制,凋亡能力明显增强（Pprkaa1主要定位在细胞质。在敲除prkaa1的细胞中检测到PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、AKT、磷酸化Akt（p-Akt）等蛋白表达的变化,结果显示:与阴性对照组相比,prkaa1敲除组中上述蛋白的表达减少,并且p-PI3K/PI3K比值和p-AKT/AKT比值显著降低（P1在胰腺癌中表达显著升高,其高表达与年龄、淋巴转移、远处转移和生存率差相关;2.下调prkaa1可调控CFPAC-1和PANC-1细胞的增殖以及迁袭、凋亡的能力;***1可能通过PI3K/Akt信号通路促进胰腺癌进展。

关键词： prkaa1 胰腺癌肿瘤表型 PI3K/Akt

PRKAA1基因多态性与HBV相关慢性肝炎、肝硬化和肝癌的遗传易感性...

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作者：谭斯亮广西医科大学

学位级别：硕士

目的:通过对腺苷活化蛋白激酶(AMPK)α1亚基(prkaa1)rs3792822,rs10036575和rs154268三个位点基因多态性的检测,探讨prkaa1基因多态性与HBV相关慢性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化(Liver Cirrhosis,LC)和肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)遗传易感性的关系,为评估HBV相关性肝脏疾病患病风险和为临床针对性治疗提供新的思路。方法:本课题纳入研究对象共571例,其中病例组424例,包括慢性肝炎组138例,肝硬化组137例,肝癌组150例,健康对照组146例。采用SNa Pshot测序法(也叫小测序法)分别检测prkaa1基因rs3792822,rs10036575和rs154268共三个位点的基因多态性,然后计算三个位点各组等位基因和基因型分布频率。采用群体遗传学原理中的哈-温平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)定律分析各组所选研究对象是否来自同一孟德尔群体,是否具有群体代表性和可比性。采用Logistic回归分析校正性别、年龄等混杂因素后,计算比值比(odds ratio,OR)和95%可信区间(Confidence interval,CI),分析prkaa1基因三个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)与HBV相关的CHB,LC和HCC遗传易感性的关系。通过在线软件SHEsis构建prkaa1 rs3792822、rs10036575和rs154268三个位点的单倍型,分析各单倍型与CHB、LC和HCC遗传易感性的关系。结果1.健康对照组146例,其中男性120例(82.2%),女性26例(17.8%),平均年龄(48.24±11.41)岁;CHB组138例,其中男108例(78.3%),女性30例(21.7%),平均年龄(39.71±11.69)岁;LC组137例,其中男108例(78.7%),女性29例(21.3%),平均年龄(47.04±11.69)岁;HCC组150例,其中男性127例(84.7%),女性23例(15.7%),平均年龄(50.53±10.35)岁。各病例组与健康对照组的男女性别比例差异无统计学意义(P>0.05),方差分析结果显示四个研究组的平均年龄差异有统计学意义(P0.05)。各病例组与健康对照组prkaa1基因rs3792822、rs10036575和rs154268三个位点的基因型分布频率均符合哈-温平衡定律(均为P>0.05)。***1基因rs3792822位点有GG、GA和AA三种基因型。以GG基因型为参照,prkaa1基因rs3792822位点三种基因型及等位基因的携带频率在CHB组、LC组和HCC组的差异无统计学意义(均为P>0.05)。***1基因rs1003657位点有CC、CT和TT三种基因型。以TT基因型为参照,结果显示:CC基因型可显著增加HCC的患病风险,其OR=1.971,95%CI:1.007-3.858,P=0.048。但在各病例组间进行比较,未发现存在统计学差异(均为P>0.05)。在对各组进行年龄分层分析时发现,≥50岁人群携带CT基因型可增加患LC和HCC的风险,其OR值和95%CI分别为:OR=3.851,95%CI:1.316-11.272,P=0.014;OR=2.633,95%CI:1.074-4.658,P=0.034。在男性人群与女性人群中进行分层比较分析,三种基因型及等位基因的携带频率亦无统计学差异(均为P>0.05)。***1基因rs154268位点有CC、CT和TT三种基因型。以CC基因型为参照,prkaa1基因rs154268位点三种基因型及等位基因的携带频率在CHB组、LC组和HCC组的差异无统计学意义(均为P>0.05)。在女性人群中,与健康对照组相比,LC组T等位基因的携带频率增加(P0.05)。结论***1基因rs10036575位点突变基因型CC可能增加健康人群患HCC的风险,杂合子CT基因型可能增加≥50岁健康人群LC和HCC的患险风险。***1基因rs154268位点携带等位基因T可能增加女性健康人群LC的患病风险。***1基因rs379

关键词： prkaa1 基因多态性慢性乙型肝炎肝硬化肝癌

prkaa1和UNC5CL基因多态性与胃癌易感性的关系

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PRKAA1和UNC5CL基因多态性与胃癌易感性的关系

作者：张永菊青岛大学

学位级别：硕士

目的:胃癌的发生发展是一个多因素参与、多步骤进展的复杂过程,是环境因素、遗传因素及生物学因素共同作用的结果。个体之间遗传因素与胃癌易感性之间的关系至今尚不完全清楚。本研究通过检测prkaa1(rs10074991、rs13361707、rs10036575... 详细信息

目的:胃癌的发生发展是一个多因素参与、多步骤进展的复杂过程,是环境因素、遗传因素及生物学因素共同作用的结果。个体之间遗传因素与胃癌易感性之间的关系至今尚不完全清楚。本研究通过检测prkaa1(rs10074991、rs13361707、rs10036575)和UNC5CL(rs2294693、rs742494)基因多态性,分析prkaa1和UNC5CL基因各基因型在胃炎组和胃癌组中的分布,探讨其与胃癌易感性的关系,为阐明胃癌的遗传易感性提供理论基础。方法:根据实验设计将研究对象分为2组,共计120例,其中胃炎组60例,胃癌组60例。所有病例均经组织病理学确诊。同时采集病例的性别年龄等资料。提取全血DNA,采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱检测技术(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF)进行单核苷酸多态性分型,数据采用χ2检验、t检验和logistic回归分析进行统计分析。结果:***1基因rs13361707位点CC基因型在胃癌组(38.3%)频率明显高于胃炎组(16.6%),差异有统计学意义(?2=5.756,P=0.016;OR=3.68 95%CI:1.25-10.88)。多因素logistic回归分析校正性别年龄后,差异仍有统计学意义(OR=3.38 CI:1.05-10.86)。prkaa1基因rs10074991位点GG基因型在胃癌组(40.0%)频率明显高于胃炎组(16.6%),差异有统计学意义(?2=5.482,P=0.019;OR=3.49 CI:1.20-10.12),多因素logistic回归校正性别年龄后,差异仍有统计学意义(OR=3.49 CI;1.20-10.12)。rs10036575位点胃癌组(40.0%)CT+CC基因型频率高于胃炎组(16.6%),差异有统计学意义(?2=5.482,P=0.019;OR=3.49 CI:1.20-10.12)。多因素logistic回归分析校正性别年龄后,差异仍有统计学意义(OR=3.49 CI:1.20-10.12)。***5CL基因rs2294693位点CC基因型和rs742494位点TT基因型频率胃癌组(13.3%)高于胃炎组(3.3%),但差异无统计学意义(?2=2.726,P=0.099;OR=4.65 CI:0.92-23.52),多因素logistic回归分析校正性别年龄后,差异仍无统计学意义(OR=3.25 CI:0.59-17.85)。***1基因rs13361707和rs10074991 C和G等位基因频率胃癌组(60.8%)高于胃炎组(45.0%),差异有统计学意义(OR=1.90 CI:1.14-3.17)。prkaa1基因rs10036575 C等位基因频率胃炎组(55.8%)高于胃癌组(39.2%),差异有统计学意义(OR=0.51 CI:0.31-0.85)。***5CL基因rs742494和rs2294693 T和C等位基因频率胃癌组(30.8%)高于胃炎组(21.7%),但差异无统计学意义(OR=1.61 CI:0.90-2.88)。结论:(1)prkaa1基因rs13361707位点CC基因型、C等位基因、rs10074991位点GG基因型、G等位基因能增加胃癌的发病风险。(2)prkaa1基因而rs10036575位点CT+CC基因型、C等位基因降低胃癌的发病风险。(3)UNC5CL基因rs2294693和rs742494位点基因多态性与胃癌发病风险无关。

关键词：基因多态性胃癌 prkaa1 UNC5CL

miRNA对从江香猪prkaa1基因调控的研究

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miRNA对从江香猪PRKAA1基因调控的研究

作者：吴巧群贵州大学

学位级别：硕士

miRNA是一种与靶基因的转录体m RNA互补的内源性非编码RNA,在真核细胞中广泛存在,参与了动物、植物、病毒、细菌中多种生理或病理过程的调控。为挖掘与从江香猪脂肪沉积相关的miRNA,结合课题组前期对prkaa1基因在脂肪细胞中的生物学功... 详细信息

miRNA是一种与靶基因的转录体m RNA互补的内源性非编码RNA,在真核细胞中广泛存在,参与了动物、植物、病毒、细菌中多种生理或病理过程的调控。为挖掘与从江香猪脂肪沉积相关的miRNA,结合课题组前期对prkaa1基因在脂肪细胞中的生物学功能研究,以prkaa1为靶基因,寻找并验证与prkaa1基因存在靶位点的miRNA。本研究以贵州从江香猪作为研究材料,利用软件、高通量测序、RNAhybrid软件筛选出与prkaa1基因相关的miRNA,通过分子克隆、实时荧光定量PCR、原代细胞的培养、诱导分化、细胞转染等技术,检测筛选miRNA及脂肪沉积相关基因在从江香猪各组织及前体脂肪细胞诱导过程表达水平,分析其在脂肪细胞分化中的调控作用,其主要研究结果如下:（1）从江香猪prkaa1基因相关miRNA的筛选及其在组织中的表达规律通过SWChen2.3软件以prkaa1基因的3’-UTR和miRNA的种子区序列筛出prkaa1基因相关miRNA,再结合高通量测序结果,利用Venny2.1在线软件寻找共有的miRNA,选取miR-22-3P、miR-143-3P这2个miRNAs为研究对象,运用茎环法设计引物,成功构建p MD-19-miR-22-3P、p MD-19-miR-143-3P载体,检测这2个miRNAs在从江香猪各组织表达水平,结果发现miR-22-3P表达量在小肠、舌、腿肌中极显著高于肺、肝、大肠、胸肌、脾、肾、心、皮下脂肪、睾丸（P＜0.01）,在小肠中极显著高于舌、腿肌（P＜0.01）;miR-143-3P在组织中表达量最高为肺,极显著高于大肠、舌、小肠、心、肾、睾丸、腿、脾、肝、胸、皮下脂肪（P＜0.01）,其次在大肠、舌、小肠、心这4个组织中极显著高于其他7个组织（P＜0.01）;miR-143-3P表达量在小肠、舌、脾脏、腿肌、大肠、肾、心、肺、睾丸这9个组织都极显著高于miR-22-3P（P＜0.01）,miR-22-3P在肝脏和胸肌中极显著高于miR-143-3P,在皮下脂肪中miR-22-3P、miR-143-3P均为低表达且差异不显著（P＞0.05）。（2）miR-22-3P、miR-143-3P在从江香猪原代脂肪细胞诱导分化中的表达分析分离培养3日龄的从江香猪的皮下、肌内前体脂肪细胞,实时荧光定量PCR1检测miRNA和prkaa1基因在细胞诱导分化48 h、60 h、72 h、96 h、120 h后的表达量。结果显示:miR-22-3P、miR-143-3P在皮下、肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中,诱导分化48 h、72 h、96 h时表达趋势呈逐渐下降,而在诱导分化120 h时表达量增加,在48 h时表达量最高且极显著高于72 h、96 h和120 h,在诱导分化96 h时表达量最低;prkaa1基因在皮下、肌内前体脂肪细胞诱导分化48 h、72 h、96 h时表达量呈上升趋势,在120 h时表达量下降,在诱导分化96 h时表达量极显著高于其他时间（P＜0.01）;脂肪沉积相关基因LPL、HSL、PPARγ在诱导分化过程中96 h时表达量最高,LPL在皮下、肌内前体脂肪细胞中为低表达,而在肌内前体脂肪细胞诱导分化96 h时极显著高于其他时间（P＜0.01）,HSL与PPARγ在诱导时间48 h、72 h时表达量呈下降趋势,诱导96 h时表达量极显著高于其他时间（P＜0.01）。（3）miR-22-3P、miR-143-3P与prkaa1基因靶位点验证构建分别含有miR-22-3P、miR-143-3P与prkaa1基因3’-UTR靶位点的双荧光蛋白载体,与合成的miR-22-3P mimics、miR-143-3P mimics转染至293T、LNCap、皮下前体脂肪细胞、肌内前体脂肪细胞,利用倒置荧光显微镜观察细胞发光情况,酶标仪检测发光强度,q RT-PCR检测prkaa1靶基因及脂肪沉积相关基因PPARγ、HSL、LPL m RNA表达情况。结果显示:在转染至293T、LNCap后,miR-22-3P mimics+双荧光蛋白载体质粒组和miR-143-3P mimics+双荧光蛋白载体质粒组的发光细胞数和荧光强度极显著低于含靶位点双荧光蛋白质粒+NC组（P＜0.01）;prkaa1基因在皮下、肌内前体脂肪细胞中,转染miR-22-3P mimics组、miR-143-3P mimics组表达量均极显著低于NC组（P＜0.01）;脂肪沉积相关基因LPL、HSL、PPARγ转染miR-22-3P mimics组、miR-143-3P mimics组表达量都低于NC组,在肌内前体脂肪细胞中,转染miR-143-3P mimics组显著低于NC组（P＜0.05）,转染miR-22-3P mimics

关键词：从江香猪 miRNA prkaa1 脂肪沉积

猪肉质性状相关基因FoxO4、prkaa1的克隆表达及功能研究

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猪肉质性状相关基因FoxO4、PRKAA1的克隆表达及功能研究

作者：孙成娟贵州大学

学位级别：硕士

本论文以贵州从江香猪为试验动物,采用PCR技术、实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)、分子克隆、细胞培养、细胞转染等技术,对FoxO4、prkaa1基因分别从分子、细胞水平进行研究。研究结果如下:***4、prkaa1基因在从江香猪不同组织中表达量的... 详细信息

本论文以贵州从江香猪为试验动物,采用PCR技术、实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)、分子克隆、细胞培养、细胞转染等技术,对FoxO4、prkaa1基因分别从分子、细胞水平进行研究。研究结果如下:***4、prkaa1基因在从江香猪不同组织中表达量的差异研究。采用qRT-PCR方法对从江香猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、背最长肌和脂肪9个不同组织样mRNA表达量进行检测,分析FoxO4、prkaa1基因在不同组织中的差异表达。结果显示:FoxO4基因在脂肪组织中表达量最高;prkaa1基因在肺组织中表达量最高,在脂肪组织中表达量次之。2.成功克隆从江香猪FoxO4、prkaa1基因的CDS区,构建真核表达载体pEGFP-N3-FoxO4、pEGFP-N3-prkaa1。以cDNA为模板,设计引物,扩增FoxO4、prkaa1基因的完整CDS区。将PCR的胶回收产物分别与真核载体pEGFP-N3连接,构建真核表达载体pEGFP-N3-FoxO4、pEGFP-N3-prkaa1。3.从江香猪肌内和皮下脂肪前体细胞的原代培养。采集5日龄从江香猪背最长肌和皮下脂肪组织,利用胶原酶消化法,分别从此两种组织中分离获得脂肪前体细胞。进一步扩大培养,油红O染色法鉴定,诱导分化,利用qRT-PCR方法检测脂肪细胞各分化相关基因PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL的表达情况。结果显示,肌内和皮下脂肪前体细胞培养成功。在皮下脂肪前体细胞分化中发现,PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL在细胞分化早期均呈现较高表达,而在肌内脂肪前体细胞分化中发现,PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL在细胞分化后期呈现较高表达。4.探究FoxO4、prkaa1基因对脂肪代谢的影响。本研究将重组质粒pEGFP-N3-FoxO4、pEGFP-N3-prkaa1分别转染肌内和皮下脂肪前体细胞,利用qRT-PCR方法检测FoxO4、prkaa1基因过表达后,两种细胞相关分化基因PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL的表达情况。结果显示,在皮下脂肪前体细胞中转染重组质粒pEGFP-N3-FoxO4、pEGFP-N3-prkaa1后,各相关分化基因PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL的表达均显著上调。而在肌内脂肪前体细胞中转染重组质粒后,各相关分化基因只有个别基因表达上调,其他基因间均差异不显著。说明FoxO4、prkaa1基因对脂肪代谢具有一定的调控作用,以期为我们进一步了解脂肪代谢机制提供理论依据。

关键词： FoxO4 prkaa1 脂肪前体细胞 qRT-PCR 从江香猪

PSCA、PLCE1、prkaa1基因多态性及幽门螺旋杆菌感染与胃癌易感性的关系

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PSCA、PLCE1、PRKAA1基因多态性及幽门螺旋杆菌感染与胃癌易感性...

作者：吴迪兰州大学

学位级别：硕士

目的：通过检测甘肃河西地区汉族中胃癌、癌前病变和正常对照人群PSCA (rs2294008)、PLCE1(rs3203713、rs11599672)和prkaa1(rs13361707)基因多态性及幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)感染,探讨其与胃癌易感性的关系。方法：根据实验设计将研究对象分为三组,共计747例,其中胃癌组217例,癌前病变组102例,正常对照组428例,所有病例均经组织病理学确诊。采集病例的性别、年龄、胃癌家族史和流行病学等资料。采用多重单碱基延伸法(Multiplex SNaPshot)进行SNP分型;采用尿素[13C]呼气试验检测***感染。数据采用X2检验、单因素方差分析和logistic回归进行统计分析。结果：研究发现rs2294008CT/TT基因型携带者患胃癌的风险是CC基因型的1.778倍(OR,1.778;95%CI,1.272～2.484;P=0.001);rs11599672AC/CC基因型携带者患胃癌的风险是AA基因型的1.981倍(OR,1.981;95%CI,1.423～2.758;P=0.000),癌前病变恶变潜能是AA型携带者的1.960倍(OR,1.960;95%CI,1.216～3.159;P=0.005);rs13361707CT/CC基因型携带者患胃癌的风险是TT基因型的1.587倍(OR,1.587;95%CI,1.085～2.322;P=0.017)。通过logistic回归分析发现,rs2294008CT/TT基因型、rs11599672AC/CC基因型、rs13361707CT/CC基因型、饮酒、胃癌家族史和***感染都与胃癌的发病风险有关,而且这三种基因型与饮酒、胃癌家族史及H. pylori感染之间在胃癌的发病风险中均存在相加的交互作用;rs11599672AC/CC基因型和阳性家族史都与癌前病变的恶变潜能有关,并且二者共同作用可以使癌前病变的恶变潜能增加;同时携带rs2294008CT/TT、rs11599672AC/CC和rs13361707CT/CC基因型的个体患胃癌的风险是rs2294008CC、rs11599672AA和rs13361707TT基因型携带者的6.792倍(OR,6.792;95%CI,2.521～18.296).结论：PSCA(rs2294008)、PLCE1(rs11599672)、prkaa1(rs13361707)基因多态性与饮酒、胃癌家族史及H. pylori感染等因素和中国甘肃地区汉族人群胃癌发病风险可能有关。

关键词：胃癌基因多态性 PSCA PLCE1 prkaa1 幽门螺旋杆菌