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甘蔗Shpr10基因的克隆及其编码蛋白与甘蔗线条花叶病毒P1蛋白的互作研究

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生物技术通报 2023年第10期39卷 163-174页

作者：黄佳艳冯小艳沈林波王文治胡海燕张树珍海南大学热带作物学院海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海口571101

病程相关蛋白10(pathogenesis related protein 10,pr10)在植物抵抗病毒侵染中发挥重要作用。前期以甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)编码的RNA沉默抑制子P1为诱饵,筛选获得一个甘蔗Shpr10蛋白。为探究Shpr10在... 详细信息

病程相关蛋白10(pathogenesis related protein 10,pr10)在植物抵抗病毒侵染中发挥重要作用。前期以甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)编码的RNA沉默抑制子P1为诱饵,筛选获得一个甘蔗Shpr10蛋白。为探究Shpr10在甘蔗应答SCSMV侵染过程中的功能,利用同源克隆技术克隆甘蔗Shpr10基因并对其编码蛋白进行生物信息学分析,利用绿色荧光蛋白融合表达法分析Shpr10蛋白的亚细胞定位,采用酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证Shpr10与SCSMV P1的互作关系,采用农杆菌共浸润瞬时表达系统和Western blot技术分析Shpr10对P1沉默抑制子活性的影响。结果显示,甘蔗Shpr10基因开放阅读框全长570 bp,编码一个不稳定亲水蛋白,蛋白分子量为21.17 kD,等电点为4.77,含有一个P-loop基序,不含跨膜结构域和信号肽。Shpr10二级结构包含51.85%的无规则卷曲、35.98%的α-螺旋、7.41%的延伸链和4.76%的β-转角。Shpr10蛋白与玉米Zmpr10蛋白的氨基酸序列相似性高达91.53%,两者在进化树上聚为一个分支。Shpr10定位在细胞质和细胞核,与SCSMV P1在酵母细胞和烟草细胞中存在互作关系。Shpr10本身不具有沉默抑制子活性,其表达削弱了P1的沉默抑制子活性,但对P1蛋白的含量无明显影响。综上,Shpr10可能通过结合P1来削弱P1的沉默抑制子活性,从而提高甘蔗对SCSMV的抗性。

关键词：病程相关蛋白 pr10 甘蔗线条花叶病毒 RNA沉默抑制子 P1蛋白甘蔗蛋白互作

Role of Pathogen-Related protein 10 (pr 10) under Abiotic and Biotic Stresses in Plants

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Phyton-International Journal of Experimental Botany 2020年第2期89卷 167-182页

作者： Rakesh Kumar Sinha Shiv Shankar Verma Anshu Rastogi Department of Plant Biophysics&Biochemistry Biology Center of the Czech Academy of SciencesInstitute of PlantMolecular BiologyCeskeBudejovice37005Czech Republic School of Medicine Case Western Reserve UniversityCleveland44106USA Department of Ecology and Environmental protection Laboratory of BioclimatologyPoznan University of Life SciencesPoznan60-649Poland

Members of the Pathogenesis Related(pr)10 protein family have been identified in a variety of plant species and a wide range of functions ranging from defense to growth and development has been attributed to them.pr10 protein possesses ribonuclease(RNase)activity,interacts with phytohormones,involved in hormone-mediated signalling,afforded protection against various phytopathogenic fungi,bacteria,and viruses particularly in response to biotic and abiotic stresses.The resistance mechanism of pr10 protein may include activation of defense signalling pathways through possible interacting proteins involved in mediating responses to pathogens,degradation of RNA of the invading pathogens.Moreover,several morphological changes have been shown to accompany the enhanced abiotic stress tolerance.In this review,the possible mechanism of action of pr10 protein against biotic and abiotic stress has been discussed.Furthermore,our findings also confirmed that the in vivo Nitric oxide(NO)is essential for most of environmental abiotic stresses and disease resistance against pathogen infection.The proper level of NO may be necessary and beneficial,not only in plant response to the environmental abiotic stress,but also to biotic stress.The updated information on this interesting group of proteins will be useful in future research to develop multiple stress tolerance in plants.

关键词： Pathogenesis-related(pr) pr10 abiotic stress biotic stress ribonuclease stress tolerance nitric oxide

果生刺盘孢效应因子CfEC92靶向Mal d 1j抑制苹果免疫机理研究

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果生刺盘孢效应因子CfEC92靶向Mal d 1j抑制苹果免疫机理研究

作者：王杰西北农林科技大学

学位级别：硕士

由果生刺盘孢引起的苹果炭疽叶枯病为我国苹果一种新病害。该病害危害苹果果实与叶片,严重影响苹果产量和质量。果生刺盘孢分泌效应因子,抑制植物免疫,从而促进其侵染。明确效应因子靶标有助于解析病原菌致病和寄主防卫机制。实验室前... 详细信息

由果生刺盘孢引起的苹果炭疽叶枯病为我国苹果一种新病害。该病害危害苹果果实与叶片,严重影响苹果产量和质量。果生刺盘孢分泌效应因子,抑制植物免疫,从而促进其侵染。明确效应因子靶标有助于解析病原菌致病和寄主防卫机制。实验室前期发现效应因子CfEC92为果生刺盘孢关键致病因子,但其作用机制仍不清楚。本研究对CfEC92互作靶标进行了筛选,并对靶标的功能研究,取得以下主要结果:1.运用酵母双杂、Bi FC技术对候选靶标进行筛选,获得候选互作靶标Mal d1j,进一步通过ITC与Co-IP等体外与体内实验证明CfEC92与Mal d 1j的直接互作。在烟草中瞬时表达CfEC92与Mal d 1j,结果显示二者共定位于细胞膜与细胞核。在苹果叶片上接种果生刺盘孢孢子悬液,定量分析显示Mal d 1j在8 h开始高表达、在36 h达到最高,表明Mal d 1j受到病原菌侵染诱导表达。2.对Mal d 1j进行系统发育分析与同源氨基酸比对,结果显示Mal d 1j隶属于pr10家族,为苹果过敏原蛋白Mal d 1类成员。该蛋白含有Bet v 1结构域和GXGGXGXXK保守序列的p-loop基序。3.在苹果中瞬时过表达Mal d 1j可以增强对果生刺盘孢抗性。在本氏烟草中过表达Mal d 1j可以增强对烟草疫霉抗性;在烟草中沉默Mal d 1j同源基因Nb pr10后,抗性明显减弱。在苹果中共表达CfEC92与Mal d 1j降低对果生刺盘孢抗性;在烟草中共表达CfEC92与Mal d 1j降低对烟草疫霉抗性。这些结果表明CfEC92在植物中可以抑制Mal d 1j诱导的抗性。4.为了明确CfEC92影响Mal d 1j的机制,将Mal d 1j序列分段,与CfEC92共同转入酵母,结果发现CfEC92与Mal d 1j的100-159aa互作,与含有p-loop基序的34-66aa并不互作,p-loop基序与核酸酶活性相关。说明CfEC92可能并不会通过影响Mal d 1j的核酸酶活性进而抑制其免疫功能。5.Mal d 1j蛋白体外抑菌活性测定显示对果生刺盘孢与烟草疫霉无直接抑菌作用。烟草过表达Mal d 1j后,定量分析显示抗病相关基因Nb pr1A、Nb pr2、Nb pr5、Nb PDF上调表达,组织学观察显示胼胝质大量积累,共表达CfEC92和Mal d 1j抑制胼胝质积累。这些结果显示,Mal d 1j可以诱导寄主抗性,而CfEC92通过与Mal d 1j互作抑制植物免疫。

关键词：植物免疫果生刺盘孢效应因子 Mal d 1 pr10

Overexpression of ARAhpr10, a Member of the pr10 Family, Decreases Levels of <i>Aspergillus flavus</i>Infection in Peanut Seeds

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American Journal of Plant Sciences 2013年第3期4卷 602-607页

作者： Chunzheng Xie Shijie Wen Haiyan Liu Xiaoping Chen Haifen Li Yanbin Hong Xuanqiang Liang Crops Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences Guangzhou China.

Peanut (Arachis hypogaea L.) is one of the most susceptible host crops to Aspergillus flavus invasion and subsequent aflatoxin contamination. In this report, a new member of pr10 family putative resistant gene (designated as ARAhpr10, No. EU661964.1) encoding a pr10 protein was isolated and characterized. Analysis of qRT-PCR showed that the expression of ARAhpr10 was induced by pre-harvested A. flavus infection, but no significant difference was observed between resistant genotype “GT-C20” and susceptible genotype “Yueyou 7”. Seven transgenic peanut lines expressing the ARAhpr10 gene under the control of 35S promoter were obtained using the Agrobacterium tumefaciens-mediated method. Real time RT-PCR results showed that the expression level of the ARAhpr10 was significantly higher and the A. flavus infection and aflatoxin content were significantly lower in seeds of transgenic lines than that of the wild type. A significant negative correlation between ARAhpr10 expression at transcript level and seeds aflatoxin production was observed. Combining the previous results, it is suggested that ARAhpr10 expression play an important role in peanut host resistance to A. flavus infection and aflatoxin producing.

关键词： Peanut pr10 Aflatoxin Contamination Overexpression

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植物病程相关蛋白pr10研究进展

大豆科学 2013年第3期32卷 415-419页

作者：程鹏姜良宇靳立梅吴俊江王金生徐鹏飞张淑珍黑龙江省农业技术推广站黑龙江哈尔滨150036 东北农业大学大豆研究所/大豆生物学教育部重点实验室黑龙江哈尔滨150030 黑龙江省农业科学院大豆研究所黑龙江哈尔滨150086

植物病程蛋白是植物受生物或非生物胁迫后诱导产生并积累的一类蛋白质总称,是植物防卫体系的重要组成部分。近年来,根据它们的结构、亲源关系和生物活性,pr蛋白主要分为17个功能家族。pr10蛋白是具有核酸酶相似结构,一般为分子量15～19 ... 详细信息

植物病程蛋白是植物受生物或非生物胁迫后诱导产生并积累的一类蛋白质总称,是植物防卫体系的重要组成部分。近年来,根据它们的结构、亲源关系和生物活性,pr蛋白主要分为17个功能家族。pr10蛋白是具有核酸酶相似结构,一般为分子量15～19 kDa的酸性蛋白。近年来相关研究表明,一些pr10蛋白具有核酸酶活性和体外抗菌功能,在植物防御反应中发挥重要作用,具有较为广泛的应用前景。为此,就pr10蛋白的基因结构、表达模式、核酸酶活性、抗病机制、在转基因方面应用等方面的最新研究进展并结合本实验室工作进行综述,为其在植物抗性育种方面的应用提供参考。

关键词：病程相关蛋白 pr10 研究进展

烟草病程相关蛋白Ntpr10基因克隆与表达分析

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中国烟草科学 2017年第3期38卷 1-7页

作者：张玉张增林蒋彩虹常爱霞杨爱国罗成刚王绍美王元英中国农业科学院烟草研究所青岛266101 中国农业科学院研究生院北京100081

为鉴定烟草病程相关蛋白pr10的生物学功能,从普通烟草G28中克隆得到了Nt pr10基因,基因全长483 bp,编码160个氨基酸。基因结构分析表明,该基因编码的蛋白包含病程相关蛋白家族Bet_v_I保守域,具有与核酸酶活性相关的"P-Loop"结构。利用TM... 详细信息

为鉴定烟草病程相关蛋白pr10的生物学功能,从普通烟草G28中克隆得到了Nt pr10基因,基因全长483 bp,编码160个氨基酸。基因结构分析表明,该基因编码的蛋白包含病程相关蛋白家族Bet_v_I保守域,具有与核酸酶活性相关的"P-Loop"结构。利用TMHMM、Signal P、prosite Scan等软件分析发现,Nt pr10不含跨膜区,无信号肽,有胞内定位特征。采用实时荧光定量PCR分别分析了TMV诱导下该基因在抗、感品种枯斑三生和G28中的表达模式。结果表明,在TMV诱导下,Nt pr10基因在感病品种G28中显著上调表达;而在抗病品种枯斑三生中,TMV侵染后6 h,Nt pr10基因显著上调表达,第12小时至第8天显著下调表达,而后至第16天逐渐升高至侵染前水平。综合以上结果,Nt pr10应答了TMV侵染过程,并且在抗、感品种中整体呈现出相反的表达趋势,暗示了Nt pr10在TMV侵染过程中具有重要功能,为深入分析Nt pr10的抗病生物学功能奠定了基础。

关键词：烟草病程相关蛋白 pr10 基因克隆表达

pr10的结构、信号转导以及功能的研究进展

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中国农学通报 2014年第4期30卷 251-258页

作者：杨瑞瑞易小娅曾幼玲新疆生物资源基因工程重点实验室/新疆大学生命科学与技术学院乌鲁木齐830046

pr10蛋白是植物在受到各类生物和非生物胁迫后产生的一种病程相关蛋白。本研究首先回顾和总结了prs以及pr10近年来的研究进展。主要介绍了pr10蛋白的序列和结构特征,并结合国内外的研究成果总结了pr10的信号转导途径;分析了pr10蛋白在... 详细信息

pr10蛋白是植物在受到各类生物和非生物胁迫后产生的一种病程相关蛋白。本研究首先回顾和总结了prs以及pr10近年来的研究进展。主要介绍了pr10蛋白的序列和结构特征,并结合国内外的研究成果总结了pr10的信号转导途径;分析了pr10蛋白在不同方面的功能,比如具有核酸酶活性,抵抗病原微生物等生物与非生物胁迫,以及与宿主细胞程序化死亡密切相关等方面,最后提出了pr10蛋白在目前研究中依然存在的问题及对未来的展望,所以研究该抗病基因的功能和作用机制对于今后在改良农作物的品质,提高作物产量方面具有重要的意义。

关键词： pr10 结构功能信号转导

大豆疫霉根腐病抗性相关基因pr10和prP功能的初步研究

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大豆疫霉根腐病抗性相关基因PR10和PRP功能的初步研究

作者：姜良宇东北农业大学

学位级别：硕士

大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起的土传性的毁灭病害。在我国，黑龙江、安徽、山东、河南、江苏、浙江、福建等地区均有Phytophthora sojae的报道。黑龙江省是我国大豆的主产区，且大豆疫霉根腐病在该省发病面... 详细信息

大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起的土传性的毁灭病害。在我国，黑龙江、安徽、山东、河南、江苏、浙江、福建等地区均有Phytophthora sojae的报道。黑龙江省是我国大豆的主产区，且大豆疫霉根腐病在该省发病面积连年增加，严重危害我国大豆的生产。迄今为止，防治该病最为有效的手段就是选用抗病品种。大豆疫霉菌毒力结构趋于复杂化、生理小种进化速度快;而常规的育种工作周期长，工作效率低，抗性资源有限，很难满足生产的需要。因此，解析大豆抗疫霉根腐病分子机理进而利用抗病基因工程育种是解决该难题的有希望的途径之一。植物为了抵抗病原微生物的侵害，在长期进化过程中，逐渐形成了一系列复杂而有效的保护机制和防御网络。植物防卫反应中表达的基因主要是编码病程相关蛋白（pathogenesisrelated proteins，pr蛋白）基因和植保素合成相关酶的基因。课题组以高抗大豆品种“绥农10”为试验材料构建的受疫霉菌诱导后差异表达的cDNA消减文库的基础上，选取了文库中经本地Blast比对后发现与其它植物的病程相关蛋白类基因具有较高同源性的高上调表达的EST序列进行研究，并用RACE技术扩增了病程相关蛋白类基因pr10（pathogenesis-related protein10）基因和prP（pathogenesis-related protein）基因，本研究在上述基础上对两个基因的功能进行了初步研究，对丰富大豆病程相关蛋白基因理论和实践抗病基因工程育种都具有十分重要的意义。具体研究结果如下： 1．将pr10和prP基因构建到pET-29b（+）原核表达载体上，在37℃，IPTG浓度0.5mM，诱导4h条件下，获得以包涵体形式存在的融合蛋白，其大小约为17.14kDa和30kDa。将该His-pr10和His-prP融合蛋白分离纯化，成功复性后，进行体外抑制大豆疫霉根腐病1号生理小种菌丝体生长试验，结果表明：pr10和prP基因编码蛋白在体外对大豆疫霉1号生理小种菌丝生长具有抑制作用，pr10基因编码蛋白在25μg时具有明显的抑菌效果，而prP基因编码蛋白在35μg时具有明显的抑菌效果。pr10蛋白所特有的P-Loop结构域具有核苷酸酶活性，可以使RNA降解。prP基因也具有核酸酶活性，可以降解RNA。 2．构建了GFP融合表达载体pCAMBIA1302-pr10和pCAMBIA1302-prP，利用农杆菌介导法侵染洋葱表皮细胞，在激光共聚焦显微镜下观察结果表明pr10和prP基因表达蛋白主要分布在细胞质中。 3．对本课题组已获得的转pr10和prP基因T1代烟草进行检测，经PCR检测，获得阳性植株6株，转pr10和prP基因的各3株。利用离体叶片接种法对烟草阳性植株接种烟草疫霉菌，结果证实转基因烟草的抗病性较对照烟草增强。 4．以感病大豆品种“东农50”的子叶节为外植体，通过农杆菌介导法对pCAMBIA3301-pr10和pCAMBIA3301-prP进行遗传转化。获得转pr10基因的再生植株65株，转prP基因的50株。经PCR检测，阳性植株14株，转pr10和prP基因的各7株。通过Southernblot和Real-time PCR分析结果表明，pr10基因和prP基因已经整合到大豆基因组中。利用离体叶片接种法对转基因大豆后代植株接种大豆疫霉根腐病1号生理小种，观察发现转基因植株的抗病性较对照组增强。

关键词：大豆疫霉根腐病抗性相关基因 pr10 prP GFP 原核表达遗传转化

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植物病程相关蛋白pr10研究进展

分子植物育种 2008年第5期6卷 949-953页

作者：谢纯政刘海燕李玲梁炫强广东省农业科学院作物研究所广州510640 华南师范大学生命科学学院广州510631

pr(pathogenesis related protein)蛋白产生与积累是植物体应答生物或非生物胁迫的主要特征之一。近年来大量pr蛋白被鉴定,根据它们的结构,亲源关系和生物活性,被分为17个功能家族。pr10蛋白具有核酸酶相似结构,一般为分子量16～19kD的... 详细信息

pr(pathogenesis related protein)蛋白产生与积累是植物体应答生物或非生物胁迫的主要特征之一。近年来大量pr蛋白被鉴定,根据它们的结构,亲源关系和生物活性,被分为17个功能家族。pr10蛋白具有核酸酶相似结构,一般为分子量16～19kD的酸性蛋白。近年来相关研究表明一些pr10蛋白具有核酸酶活性和体外抗菌活性,在植物防御反应中发挥重要作用,具有较为广泛的应用前景。本文就pr10蛋白的生理功能、基因结构、表达调控及其与植物抗病的关系等方面的最新研究进展作一综述,并结合本实验室工作展望其在植物抗性育种方面的应用前景。

关键词：病程相关蛋白基因 pr10