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pparα促进A-FABP表达及肌内脂肪沉积的作用研究

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PPARα促进A-FABP表达及肌内脂肪沉积的作用研究

作者：尤瑞国河南农业大学

学位级别：硕士

肌内脂肪(Intermucal fat,IMF))含量和猪肉品质的嫩度、风味与多汁性等密切相关,深入了解调控肌内脂肪沉积的机理对解决肉制品市场发展等问题具有重要意义。研究发现,日粮中添加共轭亚油酸(CLA)可使长白和大白杂交猪的皮下脂肪含量减少... 详细信息

肌内脂肪(Intermucal fat,IMF))含量和猪肉品质的嫩度、风味与多汁性等密切相关,深入了解调控肌内脂肪沉积的机理对解决肉制品市场发展等问题具有重要意义。研究发现,日粮中添加共轭亚油酸(CLA)可使长白和大白杂交猪的皮下脂肪含量减少而肌内脂肪增加,A-FABP、pparα基因的表达显著上升,且在不同动物试验中均显示A-FABP的表达量与IMF含量呈显著相关性,提示CLA可能通过刺激pparα的活性影响A-FABP的表达,进而调控IMF的沉积。本研究利用分子生物学、细胞生物学等方法在细胞水平上验证了 CLA对猪源A-FABP、pparα启动子存在激活作用,过表达pparα可显著上调A-FABP启动子活性。本文又通过日粮添加CLA的方式饲喂小鼠三周,研究在动物水平上CLA对机体的影响,以及对股四头肌肌内脂肪、A-FABP、pparα、脂肪代谢与合成关键酶等表达水平的调控作用。最后,为进一步验证pparα对A-FABP启动子的激活作用,利用siRNA干扰技术沉默细胞内源性pparα的表达,分析对A-FABP启动子活性的影响是否存在统计学差异。本文主要的研究结果和结论如下:1.猪pparα基因、pparα和A-FABP启动子重组质粒构建。首先根据NCBI序列及相关文献,设计合成寡核苷酸引物,分别以猪肝组织的cDNA、基因组为模板,用PCR扩增的方法获取目的片段,同源重组的方式连接表达载体,挑取重组子、菌液PCR、酶切鉴定和测序表明质粒构建完成;质粒pCMV5-myc-pparα转染293T细胞,检测到pparα蛋白的表达;pGL3-Basic、pGL3-pparα、pGL3-afabp转染细胞48h后利用双荧光素酶报告基因系统检测表明均有启动子活性。***对pparα、A-FABP启动子的激活作用。为验证CLA对PPRAα、A-FABP基因的表达具有促进作用,在293T细胞系中分别转染质粒pGL3-pparα、pGL3-afabp,转染6h后使用不同浓度的CLA刺激细胞,发现CLA可显著增强pparα启动子和A-FABP启动子的活性(Ppparα对A-FABP基因表达的促进作用,分别在 293T、3T3-L1、PK15 细胞中共转染质粒 Pcmv5-myc-pparα和 pGL3-afabp,48h 后检测启动子活性统计学差异分析,Western blot检测pparα蛋白的表达,结果表明过表达PPRAα蛋白可显著上调A-FABP启动子活性(Ppparα基因对A-FABP启动子活性的影响。将细胞分为3组,分别为:空白对照组(无siRNA干扰)、siRNA阴性对照组(非特异性siRNA,siRNA-Con)和siRNA实验组(特异性siRNA,pparα siRNA-1、2),各组均转染质粒pGL3-afabp和Renilla,在各组细胞转染36h后,和双荧光素酶报告基因检测系统分析各组A-FABP启动子活性。结果表明:沉默细胞中PPRAα基因的表达可显著降低A-FABP启动子的活性(Ppparα和脂肪酸代谢与合成关键酶等表达水平的影响。选取40只6-8周龄的昆明系雄性小鼠,随机分为2组(n=20),试验组饲喂添加1.5%CLA的饲料,饲喂15d后处死小鼠,取肝脏和股四头肌组织冰冻切片油红O染色,索氏提取法测定股四头肌IMF的含量、荧光定量PCR和Western Blot检测A-FABP、pparα的mRNA和蛋白的相对表达水平,荧光定量PCR检测脂肪酸代谢与合成关键酶的表达水平。结果显示,CLA饲喂试验组小鼠15天后,肌肉与肝脏脂肪含量显著增加,形成“脂肪肝”现象;A-FABP、ppar(α、γ)的表达水平显著上升(Ppparα启动子的活性促进pparα基因的表达,过表达pparα可增强A-FABP启动子的活性从而提高A-FABP基因表达水平。动物试验中,CLA上调肌肉中IMF含量并对相关调控IMF的因子具有显著的影响,支撑了细胞试验的结论。本研究从pparα信号通路调控角度对CLA调节猪IMF沉积的分子机制进行了探索,为改善肉品质提供了新的思路。

关键词：肌内脂肪 pparα 共轭亚油酸 A-FABP 调控因子

pparα siRNA干扰对骡鸭原代肝细胞脂质代谢基因表达影响研究

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中国家禽 2020年第7期42卷 6-12页

作者：蓝立明潘晓丽何文峰白丁平张福君郑永干李昂福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福建福州350002 吉林正方农牧股份有限公司吉林梅河口135000

为揭示pparα基因对骡鸭肝细胞ppar信号通路中脂质代谢基因的调控作用,试验以16日胚龄的骡鸭为材料,用Ⅳ型胶原酶法分离原代肝细胞,分离的原代肝细胞经形态学观察、糖原染色和白蛋白(ALB)检测鉴定后用于后续试验;构建4对干扰pparα基因... 详细信息

为揭示pparα基因对骡鸭肝细胞ppar信号通路中脂质代谢基因的调控作用,试验以16日胚龄的骡鸭为材料,用Ⅳ型胶原酶法分离原代肝细胞,分离的原代肝细胞经形态学观察、糖原染色和白蛋白(ALB)检测鉴定后用于后续试验;构建4对干扰pparα基因的siRNA,分别转染骡鸭原代肝细胞,转染12 h后用荧光显微镜检测转染效率,转染48 h后用油红O染色检测肝细胞脂质分泌情况,筛选干扰效率最高的siRNA,qRT-PCR检测该siRNA干扰pparα基因后ppar信号通路上脂质代谢相关基因的表达情况。结果显示:Ⅳ型胶原酶法分离的骡鸭原代肝细胞活性较好,ALB的分泌量维持在较高水平,糖原染色发现大量细胞存在双核和多核状态,干扰效率最高的pparα-1344组与对照组相比脂质分泌量减少,原代肝细胞中LPL、FABP、FAS和ACBP基因表达量极显著下调(P0.05)。研究表明:分离的骡鸭原代肝细胞纯度好、活性高,pparα基因可能促进脂肪在肝脏中沉积,与骡鸭的肥肝形成密切相关。

关键词：骡鸭 pparα 原代肝细胞脂质代谢

pparα及Acox1在酒精性脂肪肝中的表达

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华中科技大学学报（医学版） 2016年第3期45卷 288-291页

作者：仝巧云葛存锦郑世华三峡大学消化疾病研究所宜昌市中心人民医院消化内科宜昌443003

目的通过测定酒精性脂肪肝大鼠血清TNF-α、肝内甘油三酯、pparαmRNA及Acox1mRNA含量、肝内pparα蛋白含量,并通过pparα激动剂苯扎贝特(Bezafibrate)的干预研究,探讨酒精性脂肪肝大鼠肝内甘油三酯沉积的分子生物学机制及酒精性脂肪肝... 详细信息

目的通过测定酒精性脂肪肝大鼠血清TNF-α、肝内甘油三酯、pparαmRNA及Acox1mRNA含量、肝内pparα蛋白含量,并通过pparα激动剂苯扎贝特(Bezafibrate)的干预研究,探讨酒精性脂肪肝大鼠肝内甘油三酯沉积的分子生物学机制及酒精性脂肪肝的发病机制。方法将60只Wistar大鼠随机分为正常对照组(n=20)、酒精性脂肪肝组(n=20)及苯扎贝特组(n=20)。正常对照组予蒸馏水灌胃8周;酒精性脂肪肝组给予鱼油2.5mL/kg+乙醇灌胃8周;苯扎贝特组采用鱼油+乙醇灌胃,4周后加用苯扎贝特100mg/kg灌胃治疗4周。第8周取腹腔静脉血及肝组织,采用ELISA法测定血清TNF-α含量;比色法测定肝脏甘油三酯沉积;RT-PCR法测定肝内pparαmRNA及Acox1mRNA含量;Western blot法测定肝内pparα蛋白含量。结果与正常对照组相比,酒精性脂肪肝组大鼠血清内TNF-α含量升高[(3.01±0.31)ng/mL vs.(1.07±0.28)ng/mL,PpparαmRNA[(0.22±0.08)vs.(0.68±0.13),Ppparα蛋白含量减少[(0.19±0.07)vs.(0.48±0.11),PpparαmRNA及Acox1mRNA表达增多,pparα蛋白含量增多。结论酒精性脂肪肝大鼠肝内pparα及Acox1表达减少,从而影响脂肪酸的代谢,导致肝内甘油三酯沉积增多,血清内TNF-α含量升高,引起酒精性脂肪肝。苯扎贝特可通过激活pparα,使肝内pparα及Acox1表达增加,促进脂肪酸的代谢,减少肝内甘油三酯沉积,降低血清内TNF-α含量,起到预防和治疗酒精性脂肪肝的作用。

关键词：酒精性脂肪肝甘油三酯 pparα Acox1 苯扎贝特

pparα/PGC-1α信号通路对阿霉素损伤H9c2心肌细胞能量代谢的调节

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临床心血管病杂志 2016年第4期32卷 388-391页

作者：金鹏陈保林杨永曜贵州医科大学附属省人民医院心血管病院心内科贵阳550002

目的:探讨过氧化物酶体增生物激活受体α(pparα)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α(PGC-1α)信号通路对阿霉素损伤后H9c2心肌细胞能量代谢的调节。方法:将传代后生长良好的H9c2心肌细胞随机分为4组:空白对照组(C组)、阿霉... 详细信息

目的:探讨过氧化物酶体增生物激活受体α(pparα)/过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α(PGC-1α)信号通路对阿霉素损伤后H9c2心肌细胞能量代谢的调节。方法:将传代后生长良好的H9c2心肌细胞随机分为4组:空白对照组(C组)、阿霉素损伤组(DI组)、pparα预激动组(PPA组)和pparα预抑制组(PPI组),药物预处理后予以阿霉素建立心肌细胞损伤模型。细胞继续培养24h后,荧光定量RT-PCR方法检测pparα、PGC-1α和P300基因表达变化,运用Western blotting方法测定pparα、PGC-1α及P300蛋白表达情况,高效液相色谱法(HPLC)测细胞线粒体内的腺苷酸含量。结果:与对照组相比,阿霉素损伤组、pparα预抑制组中pparα、PGC-1α及P300的表达均下降(Ppparα预抑制组相比,pparα预激活能够提高pparα、PGC-1α及P300的表达(Ppparα/PGC-1α轴的表达降低H9c2心肌细胞内磷酸腺苷含量,影响H9c2心肌细胞的能量代谢。而pparα/PGC-1α轴的预激活能够增加阿霉素损伤H9c2心肌细胞磷酸腺苷的含量,改善H9c2心肌细胞能量代谢。

关键词： pparα PGC-1α P300 阿霉素 H9c2心肌细胞能量代谢

不同强度有氧运动对小鼠骨骼肌的pparα／δ表达、肌纤维类型和运动能力的影响

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体育科学 2009年第1期29卷 58-65页

作者：武雅琼温含苏丽姜宁牛燕媚苑红傅力席翼天津体育学院运动人体科学系天津300381 河南省体育科学研究所河南郑州450012 秦皇岛水运卫生学校河北秦皇岛066002 深圳大学体育系广东深圳518060

观察不同强度有氧耐力训练后的骨骼肌pparα/δ表达、相关酶活性、肌纤维类型和运动能力的变化,探究pparα/δ在提高C57BL/6小鼠骨骼肌有氧耐力中的作用以及训练强度的影响。选用6周龄雄性C57BL/6小鼠45只,随机分为3个实验组,分别为76% ... 详细信息

观察不同强度有氧耐力训练后的骨骼肌pparα/δ表达、相关酶活性、肌纤维类型和运动能力的变化,探究pparα/δ在提高C57BL/6小鼠骨骼肌有氧耐力中的作用以及训练强度的影响。选用6周龄雄性C57BL/6小鼠45只,随机分为3个实验组,分别为76% VO_2max 60 min训练组(LS)、86%VO_2max 60 min训练组(HS)和安静对照组(RC)。各运动组进行跑台训练,采用RT—PCR、Western blot、MATPase染色检测骨骼肌中pparα/δ、CPT- 1、BOAcDH和GPDH的表达及肌纤维类型的变化。结果发现:运动各组骨骼肌pparα/δ转录和翻译水平较对照组均有显著提高,而HS组均显著高于LS组;各运动组CPT-1、EoAc- DH的蛋白表达和运动能力较对照组均有显著提高,但运动组间没有显著差异,GPDH的表达没有显著改变;运动各组耐力能力较对照组均有显著增强,但运动组间没有显著差异;各组之间的骨骼肌Ⅰ、Ⅱ型肌纤维组成百分比均没有显著差异。结论:pparα/δ可能作为靶点在骨骼肌对耐力训练的适应过程中发挥着重要作用,高强度训练对于这种适应过程的影响较大;运动并没有导致骨骼肌纤维类型发生显著变化。

关键词： pparα pparδ 耐力训练强度骨骼肌鼠动物实验

L-肉碱及运动对超重小鼠心肌H-FABP和pparα的影响

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西安体育学院学报 2016年第1期33卷 107-112页

作者：付乐张蕴琨南京体育学院南京210014 南京师范大学泰州学院体育与健康教育学院江苏泰州225300

目的探讨L-肉碱及运动对超重小鼠心肌脂代谢的影响。方法 C57BL/6小鼠给予3周高脂饮食建立超重模型,造模成功后的小鼠随机分为超重对照组(OC组)、超重肉碱组(OL组)、超重运动组(OE组)和超重运动结合肉碱组(OEL组)。OE和OEL组小鼠进行6... 详细信息

目的探讨L-肉碱及运动对超重小鼠心肌脂代谢的影响。方法 C57BL/6小鼠给予3周高脂饮食建立超重模型,造模成功后的小鼠随机分为超重对照组(OC组)、超重肉碱组(OL组)、超重运动组(OE组)和超重运动结合肉碱组(OEL组)。OE和OEL组小鼠进行6周的游泳训练,6次/周;同时OL和OEL组小鼠补充L-肉碱。检测心肌H-FABP、pparα蛋白表达量及FFA、肉碱含量。结果 OL和OEL组心肌肉碱含量较OC组升高;OE和OEL组心肌FFA含量均低于OC组,且OEL组低于OE组;OE和OEL组心肌H-FABP表达量较OC组升高;干预各组心肌pparα的表达量均高于OC组,且OEL组高于OE组。结论 (1)有氧运动可上调心肌H-FABP和pparα蛋白表达水平,促进心肌对FFA的氧化利用。(2)L-肉碱的补充对超重小鼠心肌H-FABP的蛋白表达无明显调控作用。(3)运动结合L-肉碱降低心肌FFA含量的效果优于单纯运动,其机制与上调pparα蛋白表达有关。

关键词： L-肉碱运动超重小鼠 pparα H-FABP

激活pparα表达对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大及NFATc4与p65-NFκB相互作用的影响

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中国病理生理杂志 2014年第6期30卷 1017-1022页

作者：邹剑周后凤先志伟刘培庆成都市第五人民医院药剂科四川成都611130 中山大学药学院药理与毒理学实验室广东广州510006

目的:研究pparα激动剂非诺贝特(fenofibrate)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大的影响及机制。方法:在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型中加入非诺贝特(10μmol/L)预处理1 h后,采用real-time PCR检测肥大标志物ANF、BNP和β-MHC mRN... 详细信息

目的:研究pparα激动剂非诺贝特(fenofibrate)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大的影响及机制。方法:在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型中加入非诺贝特(10μmol/L)预处理1 h后,采用real-time PCR检测肥大标志物ANF、BNP和β-MHC mRNA水平变化,Western blotting检测NFATc4和p65-NFκB核转位的变化,免疫共沉淀检测心肌细胞核内p65-NFκB与NFATc4之间的相互作用,EMSA检测NFATc4在BNP启动子上DNA结合活性的变化。结果:非诺贝特可显著抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。非诺贝特可抑制AngⅡ诱导的NFATc4和p65-NFκB的入核,以及两者在核内的相互作用。非诺贝特可抑制AngⅡ诱导的NFATc4在BNP启动子上DNA结合活性的增加。结论:非诺贝特可增强心肌细胞核内pparα与NFATc4之间的相互作用,并减弱p65-NFκB与NFATc4之间的相互结合,进而降低NFATc4在BNP启动子上的DNA结合活性,这可能是其抑制AngⅡ诱导的心肌肥大的重要机制。

关键词：血管紧张素Ⅱ 心肌细胞肥大 pparα NFATc4 p65-NFκB

皖西白鹅育肥期肌肉脂肪酸组成及肝pparα、FADS2和ME1基因表达规律的研究

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畜牧兽医学报 2017年第10期48卷 1912-1919页

作者：陈兴勇赵宁张燕耿照玉安徽农业大学动物科技学院合肥230036

旨在探明皖西白鹅育肥期肌肉脂肪酸组成及肝脂肪酸合成相关基因的表达规律。本研究选取同批出雏的70日龄时体重相近的皖西白鹅60只,分为3个重复,每个重复20只,育肥至100日龄。育肥期每10d(70~100日龄)从各重复取5只屠宰,分离胸肌、腿肌... 详细信息

旨在探明皖西白鹅育肥期肌肉脂肪酸组成及肝脂肪酸合成相关基因的表达规律。本研究选取同批出雏的70日龄时体重相近的皖西白鹅60只,分为3个重复,每个重复20只,育肥至100日龄。育肥期每10d(70~100日龄)从各重复取5只屠宰,分离胸肌、腿肌和肝。气相色谱法检测肌肉脂肪酸组成,RT-PCR分析肝pparα、FADS2和ME1基因相对表达量。结果表明:1)胸肌饱和脂肪酸含量高于腿肌(Ppparα在育肥20d高表达,育肥30d低表达(Ppparα表达量上升伴随C16∶1、C18∶3、UFA/SFA含量上升,同时SFA含量下降;FADS2表达量上升伴随C16∶1、C18∶1、C18∶3、MUFA和UFA/SFA含量上升,SFA、PUFA含量下降。ME1基因的表达量上升则C16∶1、C18∶1、C18∶3、MUFA和UFA/SFA上升,同时C18∶0、C20∶3和SFA含量下降。皖西白鹅pparα、FADS2和ME1基因相对表达量均和脂肪酸组成显著相关,可作为脂肪酸性状选育的候选基因。

关键词：皖西白鹅脂肪酸组成 pparα FADS2 ME1

pparα与CaN在运动大鼠心肌微损伤与心室重塑发生中的作用

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PPARα与CaN在运动大鼠心肌微损伤与心室重塑发生中的作用

作者：高瑞芳北京体育大学

学位级别：硕士

目的:用大鼠力竭游泳运动建心肌微损伤动物模型,观察力竭运动后即刻、6、12和24小时心肌pparα、HIF-1α、CaN变化特点及规律,探讨运动性心肌微损伤及心室重塑中心肌功能异常的发生机制。方法:90只成年雄性SD大鼠,分对照组,一次力竭与2... 详细信息

目的:用大鼠力竭游泳运动建心肌微损伤动物模型,观察力竭运动后即刻、6、12和24小时心肌pparα、HIF-1α、CaN变化特点及规律,探讨运动性心肌微损伤及心室重塑中心肌功能异常的发生机制。方法:90只成年雄性SD大鼠,分对照组,一次力竭与2周反复力竭游泳运动各4组,力竭后分时相取材,经免疫荧光和图像分析,研究力竭后心肌pparα、HIF-1α、CaN蛋白表达变化。结果:1力竭运动后,大鼠心肌pparα表达减少,一次力竭后6小时室间隔及右心室pparα表达显著低于对照,12-24小时基本恢复到对照水平;反复力竭后即刻及24小时室间隔pparα含量均显著低于对照。室间隔pparα含量在反复力竭后即刻及24小时分别显著低于一次力竭后即刻及24小时组。2大鼠力竭后心肌HIF-1α表达增多,经一次力竭游泳后,心室各部位HIF-1α含量运动后即刻、6、12小时均显著高于对照,24小时恢复到对照水平;反复力竭后,左右心室运动后即刻蛋白表达明显高于对照,而在室间隔升高不明显。3一次力竭后大鼠心肌CaN表达变化不明显,仅室间隔运动后即刻显著高于对照;经反复力竭后,室间隔运动后各时相均显著高于对照组,左心室运动后即刻及右心室运动后24小时显著高于对照。室间隔和右心室中CaN含量在反复力竭后24小时显著高于一次力竭后24小时组。结论:1力竭运动后心肌pparα表达水平与心肌能量供应的恢复及心肌受损程度有关,是运动性心肌微损伤与心室重塑发生的重要机制。2心肌通过HIF-1α表达,对缺血缺氧做出反应,反复力竭后HIF-1α表达受到抑制,心肌受损较严重,心肌HIF-1α表达参与调节运动性心肌微损伤发生。3一次力竭运动后CaN在心肌缺血缺氧损伤中非主要的调节因子;2周反复力竭后CaN在心肌细胞肥大发生过程中发挥更重要的作用,是运动性心室重塑发生的重要机制。4反复超负荷运动后,心肌受损以室间隔最敏感,程度最重,其次是右心室,左心室相对轻。

关键词： pparα HIF-1α 钙调神经磷酸酶力竭运动心肌微损伤