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pofut1通过增加滋养层细胞uPA的O-岩藻糖基化促进胎盘血管形成

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poFUT1通过增加滋养层细胞uPA的O-岩藻糖基化促进胎盘血管形成

作者：梁彩霞大连医科大学

学位级别：硕士

一、背景与目的:胚胎着床是一个复杂的生物学过程,需要成熟的胚胎和接受态的子宫内膜同时建立。在胚胎植入过程中,胚泡表面的滋养层介导胚胎和子宫内膜之间的识别,促进胚胎的植入、胎盘发育以及维持成功的妊娠。在正常妊娠过程中,滋养... 详细信息

一、背景与目的:胚胎着床是一个复杂的生物学过程,需要成熟的胚胎和接受态的子宫内膜同时建立。在胚胎植入过程中,胚泡表面的滋养层介导胚胎和子宫内膜之间的识别,促进胚胎的植入、胎盘发育以及维持成功的妊娠。在正常妊娠过程中,滋养层细胞能够降解细胞外基质、侵入母体子宫内膜及血管,建立母胎之间的连接。滋养层细胞增殖和侵袭能力的缺失可阻碍胚胎植入,导致流产,以及妊娠相关疾病,例如胎儿宫内生长受限(fetal intrauterine growth restriction,FIGR),先兆子痫(preeclampsia)等。蛋白质O-岩藻糖基转移酶1(protein O-fucosyltransferase 1,pofut1)是催化蛋白质O-岩藻糖合成的关键酶。课题组前期研究表明:与正常早孕相比,流产患者滋养层细胞pofut1的含量显著下降;pofut1促进滋养层细胞的侵袭及增殖能力。但是对pofut1在滋养层细胞参与胎盘血管重塑中的作用及机制未见报道。本文旨在探讨pofut1对滋养层细胞在胎盘血管生成中的作用及其机制,这将有助于深入理解胚胎植入的机理,并为临床上以糖为靶点的流产等妊娠相关疾病的诊断和治疗提供新的理论依据。二、方法:1.免疫组织化学染色检测正常妊娠早期绒毛和流产患者绒毛中CK7、pofut1和血管生成标志物CD34的表达;免疫组织化学染色检测健康孕妇和流产患者蜕膜组织中HLA-G、CD34的表达。2.运用Real-time PCR、western blot检测pofut1 cDNA、pofut1 siRNA的转染效率;transwell、F-actin检测滋养层细胞的迁移和骨架重排能力;明胶酶谱检测上清中MMPs的分泌;基质胶成管实验分析细胞成管能力;western blot检测血管生成相关蛋白的表达。3.O-Fucose试剂盒检测滋养细胞表面总O-岩藻糖的表达;蛋白质免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)检测尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,uPA)上O-岩藻糖含量;纤维蛋白酶谱法检测培养液中uPA的表达。4.利用脂质体瞬时转染pofut1 cDNA、pofut1 mutant、uPA cDNA、uPA mutant至滋养细胞(HTR-8/SVneo)内,western blot检测细胞周期蛋白的表达;transwell检测细胞的迁移能力;用小管形成实验分析细胞成管能力;用uPAR免疫共沉淀检测与uPAR结合的uPA;western blot检测滋养细胞中RhoA信号通路的激活。5.收集经过不同处理的滋养细胞培养液作用于人脐静脉内皮细胞(HUVEC),western blot检测细胞周期蛋白的表达;transwell、F-actin检测细胞迁移和骨架重排能力;小管形成实验分析两种细胞共成管能力;western blot检测HUVEC中RhoA信号通路的激活。6.鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)体内验证:收集人绒毛组织,经pofut1 siRNA(50nM)处理后作用于CAM上,观察CAM上血管的变化。三、结果:1.收集正常早孕与流产患者的绒毛和蜕膜组织样品进行免疫化学染色,检测发现:与正常早孕相比,流产患者绒毛组织pofut1表达显著降低,形成的螺旋动脉管腔小。流产患者蜕膜组织HLA-G的表达降低,螺旋动脉管腔直径明显小于正常早孕管腔直径。***1促进滋养层细胞的血管形成。Transwell、F-actin结果均表明,与对照组相比,转染pofut1 cDNA,滋养层细胞的迁移能力明显增强,而转染pofut1 siRNA则抑制滋养层细胞迁移。明胶酶谱分析培养液中基质金属蛋白酶(MMP2、MMP9)的表达,结果显示,转染pofut1 cDNA以后,MMP2及MMP9的分泌增加。成管实验结果表明,转染pofut1 cDNA组,滋养细胞的成管能力显著增强,血管相关标志物CD31、CD34和血管生成相关蛋白(VE-cadherin、VEGFR2、uPA)的表达显著增加。***1增加uPA上O-岩藻糖的生物合成。O-Fucose结果显示,转染pofut1siRNA以后,滋养细胞总的O-岩藻糖表达降低,pofut1 siRNA+pofut1 cDNA组可以回调O-岩藻糖的表达。蛋白的免疫共沉淀结果表明,转染uPA cDNA组,uPA上O-岩藻糖表达增加,而转染uPA mutant组,滋养细胞的O-岩藻糖基化水平与未转染组相比,未见明显变化。纤溶酶谱结果显示,转染pofut1 cDNA组,培养液中uPA分泌增加。***1通过增加uPA的O-岩藻糖基化促进滋养层细胞的增殖

关键词：血管形成滋养层细胞 pofut1 uPA O-岩藻糖基化

pofut1在子宫蜕膜血管形成中的作用及相关机制的研究

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poFUT1在子宫蜕膜血管形成中的作用及相关机制的研究

作者：张丹丹大连医科大学

学位级别：硕士

一、背景与目的:在胚胎着床和发育过程中,子宫内膜基质细胞的分化及新生血管网络的形成对于妊娠的建立和维持至关重要。而岩藻糖基转移酶及岩藻糖化寡糖在子宫内膜接受态的建立及胚胎着床发育过程中发挥重要作用。蛋白质O-岩藻糖基转移... 详细信息

一、背景与目的:在胚胎着床和发育过程中,子宫内膜基质细胞的分化及新生血管网络的形成对于妊娠的建立和维持至关重要。而岩藻糖基转移酶及岩藻糖化寡糖在子宫内膜接受态的建立及胚胎着床发育过程中发挥重要作用。蛋白质O-岩藻糖基转移酶1(po FUT1)定位于细胞内质网,通过特异性识别催化含类表皮生长因子(EGF)结构域的底物,将L-Fucose以O-糖苷键的形式连接到蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基上,形成O-连接型岩藻化糖蛋白。实验室前期研究表明,po FUT1可以增强胚胎滋养层细胞的植入和增殖能力,在子宫内膜接受态的建立及胚胎着床发育过程中发挥重要作用,但其在子宫蜕膜血管形成过程中所起的作用目前未见报道。本研究旨在探讨po FUT1对子宫蜕膜血管形成的影响及作用机制,为进一步深入理解妊娠生理及诊断治疗临床相关病理性妊娠及妊娠期并发症提供新的思路和理论依据。二、方法:1.组织免疫荧光检测正常未孕和早孕妇女及小鼠子宫内膜组织中po FUT1和血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)标志物表达水平。2.体外诱导人子宫内膜基质细胞(human endometrial stromal cells,HESCs)蜕膜化,并使用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)进行刺激,应用Real-time PCR、Western blot、细胞免疫荧光方法检测po FUT1和VECs标志物的表达水平;应用小管形成实验分析细胞成管能力。3.利用脂质体瞬时转染po FUT1-si RNA至蜕膜化的基质细胞(human decidual stromal cells,HDSCs)内,下调po FUT1表达,应用Real-time PCR、Western blot、细胞免疫荧光方法检测VECs标志物的表达水平;应用细胞骨架染色检测细胞骨架改变情况,应用划痕实验分析细胞迁移能力,应用小管形成实验分析细胞成管能力。4.蛋白质免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)和O-Fucose试剂盒检测HDSCs中尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,u PA)上O-岩藻糖含量。*** blot检测HDSCs中Rho A信号通路相关分子的表达。6.对受孕小鼠进行po FUT1-si RNA宫角注射,体内验证下调po FUT1抑制小鼠子宫蜕膜血管形成。三、结果:1.组织免疫荧光结果显示:与正常未孕女性增生期子宫内膜组织相比,分泌期子宫内膜组织血管数量多、管腔大,po FUT1和VECs标志物(CD31)高表达,正常早孕女性子宫蜕膜组织血管管腔显著扩张,po FUT1和CD31的表达更未显著;正常早期妊娠小鼠子宫内膜组织中po FUT1和CD31的表达随着妊娠的进展而递增。2.蜕膜化诱导和VEGF作用促进HESCs中po FUT1表达,增强其成管能力。诱导HESCs蜕膜化后,Real-time PCR、Western Blot、细胞免疫荧光实验结果显示:与对照组相比,HESCs蜕膜化诱导后po FUT1和VECs标志物的表达上调,加入VEGF后其表达进一步增加。小管形成实验结果显示:蜕膜化后HESCs形成血管的能力与对照组相比更强,而加入VEGF作用以后成管能力进一步增强。*** FUT1促进HDSCs血管形成能力。Real-time PCR、Western blot、细胞免疫荧光实验结果显示:HDSCs转染po FUT1-si RNA后VECs标志物表达下调,而当与po FUT1-c DNA共转染后,VECs标志物表达部分回调。细胞骨架染色、划痕实验和小管形成实验结果显示:HDSCs转染po FUT1-si RNA后,细胞骨架形成,细胞迁移能力和成管能力均受到抑制,而当与po FUT1-c DNA共转染后,细胞骨架纤维形成的抑制作用减弱,细胞迁移能力和成管能力部分回调。*** FUT1通过上调u PA上的O-岩藻糖基化的修饰,从而激活Rho A信号通路。Western blot结果显示:转染po FUT1-si RNA后可显著下调HDSCs中O-Fucose的表达,而与po FUT1-c DNA共转染后,总蛋白O-Fucose的表达回调。为了寻找具体是哪一种蛋白质上的O-岩藻糖基化发生改变,影响子宫蜕膜血管形成,我们通过生物信息学预测(Uni Prot)发现:u PA上含有O-岩藻糖基化修饰位点。co-IP实验结果显示:与对照组相比,转染po FUT1-si RNA后,u PA上的O-Fucose表达下调,而与po FUT1-c DNA共同转染后,u PA上的O-fucose表达回调;共同转

关键词：蜕膜化血管形成 pofut1 O-岩藻糖基化 uPA

miR-34c-5p靶向pofut1对胎盘血管形成的影响

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郑州大学学报（医学版） 2024年第3期59卷 320-325页

作者：刘月华杨照远鲁继聪谢梦霞郭婧王媛媛杨敬敬田赟赵明陈冬笋朱双慧李珠银丁文珺郑州大学第三附属医院产科郑州450052

目的:探讨miR-34c-5p与pofut1的靶向关系及对胎盘血管形成的影响。方法:利用ENCORI数据库预测miR-34c-5p与pofut1的结合位点,采用双荧光素酶报告实验验证。随机选取2023年4至10月在郑州大学第三附属医院住院的胎儿生长受限(FGR)孕妇20例... 详细信息

目的:探讨miR-34c-5p与pofut1的靶向关系及对胎盘血管形成的影响。方法:利用ENCORI数据库预测miR-34c-5p与pofut1的结合位点,采用双荧光素酶报告实验验证。随机选取2023年4至10月在郑州大学第三附属医院住院的胎儿生长受限(FGR)孕妇20例(FGR组),选择同期正常孕妇20例为对照。采用实时荧光定量PCR法检测两组胎盘组织中miR-34c-5p和pofut1 mRNA的表达。取脐静脉内皮细胞,分组转染miR-34c-5p模拟物及其对照(NC)、miR-34c-5p抑制物及其NC、si-pofut1 NC、si-pofut1、si-pofut1+miR-34c-5p抑制物,采用CCK-8法、Transwell实验以及成管实验检测细胞转染24、48、72、96 h后的增殖能力,转染48 h后的侵袭能力和成管能力。结果:FGR组和对照组胎盘组织中miR-34c-5p表达水平分别为(1.57±0.39)、(1.09±0.18),pofut1 mRNA表达水平分别为(0.51±0.17)、(1.06±0.13),FGR组胎盘组织中miR-34c-5p表达水平高于对照组,pofut1 mRNA表达水平低于对照组(Ppofut1 NC组相比,si-pofut1组侵袭细胞数和管腔节点数减少,细胞增殖活性降低(Ppofut1+miR-34c-5p抑制物组上述变化较si-pofut1组部分逆转(Ppofut1影响血管内皮细胞功能,从而影响胎盘的血管形成,参与FGR的发生。

关键词： miR-34c-5p 胎儿生长受限 pofut1 血管形成

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孕激素上调pofut1基因表达及促进胚胎增殖与黏附机制的研究

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孕激素上调poFUT1基因表达及促进胚胎增殖与黏附机制的研究

作者：崔馨元大连医科大学

学位级别：硕士

背景与目的:孕激素(Progesterone,P)在胚胎发育成熟和着床过程中起重要作用,孕激素不足可导致胚胎发育不良,及妊娠终止引起流产。孕激素通过调节与着床有关分子的表达促进胚胎的增殖和黏附能力。多种病理和生理过程受到蛋白质糖基化的影... 详细信息

背景与目的:孕激素(Progesterone,P)在胚胎发育成熟和着床过程中起重要作用,孕激素不足可导致胚胎发育不良,及妊娠终止引起流产。孕激素通过调节与着床有关分子的表达促进胚胎的增殖和黏附能力。多种病理和生理过程受到蛋白质糖基化的影响,其中包括了胚胎发育与着床过程。O-糖基化和N-糖基化是蛋白质糖基化的主要形式。蛋白质的O-岩藻糖基化受蛋白质O-岩藻糖基转移酶(po FUTs,protein-fucosyltransferases)的催化,而po FUTs在促进胚胎发育与着床过程中的作用未见报道。激活蛋白-1(AP-1)是一种转录因子,转录因子家族由Jun和Fos的细胞同源物组成,参与细胞增殖、分化、和侵袭过程和内分泌基因的调节。研究发现,AP-1(c-Jun/c-Fos)广泛表达于人胎盘中,活化的AP-1具有调控胎盘的形成和胎儿发育的作用。本研究拟探讨孕激素对蛋白质O-岩藻糖基化的调控作用及影响胚胎增殖和着床过程。研究结果表明JAR细胞经孕激素作用,增加AP-1(c-Jun/c-Fos)的磷酸化表达,上调pofut1的基因表达,并促进胚胎细胞的黏附能力与增殖能力。实验有助于揭示岩藻糖在着床糖生殖生物学中的作用及其机制,为临床医学提供研究及诊断治疗的新思路。方法:1.利用ELISA和Western blot检测健康未孕、早孕和流产妇女血清中孕激素和pofut1的蛋白表达水平。通过免疫荧光的方法验证人绒毛组织中pofut1的定位和表达。2.利用Western blot,免疫荧光和Real-time PCR等方法,观察孕激素对胚胎滋养层细胞中pofut1基因和蛋白表达水平的影响,以及孕激素与米非司酮联合应用对pofut1基因和蛋白表达水平的影响。3.利用Western blot,免疫荧光和Real-time PCR等方法,观察孕激素影响pofut1的表达及对细胞增殖黏附功能的改变。4.为了探讨孕激素是如何调控pofut1表达,我们采用Western blot、EMSA和免疫荧光方法确定孕激素可激活转录因子AP-1的转录活性。5.利用染色质免疫沉淀技术检测转录因子AP-1直接作用在pofut1的启动子区域,促进pofut1转录,并且通过Western blot和Real-time PCR检测瞬时转染c-Jun/c-Fos siRNA干扰质粒和AP-1抑制剂(TIIA)处理后pofut1基因和蛋白表达的变化。6.体外着床模型是在荧光显微镜下,观察和统计黏附率,检测了包括正常组、孕激素组、孕激素联合米非司酮组、转染c-Jun/c-Fos siRNA干扰质粒组,AP-1抑制剂(TIIA)组以及分别联合孕激素等9组的胚胎黏附率。并且利用Western blot、免疫荧光和CCK-8检测JAR细胞增殖能力。结果:1.收集临床样品包括健康未孕、正常早孕和先兆流产女性血清进行ELISA检测发现:正常早孕妇女血清中,孕激素和pofut1的含量均高于先兆流产患者和健康未孕的女性;而先兆流产患者血清中,孕激素和pofut1的含量比早孕妇女低。孕激素和pofut1在血清中的表达变化呈正相关。通过免疫荧光确定人早孕绒毛中pofut1的定位和表达。2.孕激素促进pofut1的基因和蛋白水平的表达。经过不同浓度的孕激素和不同作用时间处理后,通过Real-time PCR和Western blot等方法检测发现,孕激素能显著促进JAR细胞pofut1基因和蛋白的表达;Real-time PCR、Western blot和免疫荧光结果表明,联合应用米非司酮(RU486)可抑制孕激素的效用;瞬时转染pofut1 siRNA后,pofut1表达明显降低,联合孕激素处理后可回调pofut1的表达。3.孕激素促进pofut1的表达并调节JAR细胞的增殖与黏附的能力。Real-time PCR、Western blot和免疫荧光结果发现,干扰pofut1的JAR细胞中合并应用孕激素可以恢复pofut1的表达。通过Western blot、CCK-8和免疫荧光等方法分析发现孕激素调控pofut1的表达影响JAR细胞的增殖和黏附能力。4.孕激素激活转录因子AP-1的转录活性。Western blot、EMSA和免疫荧光结果发现,孕激素(10-5mol/L)可上调转录因子AP-1(c-Jun/c-Fos)的表达水平,并促进其在核中的积累。***-1直接影响靶基因pofut1的转录,Real-time PCR、Western blot结果显示,与对照组相比,抑制了AP-1的转录激活能力可降低pofut1的表达水平。通过CHIP实验进一步确定了AP-1直接作用在pofut1启动子区域,引起下游靶基因pofut1转录并调控其表达变化。6.孕激素通过激活转录因子AP-1上调poFU

关键词：孕激素胚胎植入 pofut1 AP-1 子宫内膜

pofut1影响食管鳞癌细胞生物学行为及其机制的初步研究

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临床和实验医学杂志 2024年第6期23卷 561-566页

作者：何萍萍陈质斌朱倩钰周冬虎邢洁黄坚首都医科大学附属北京友谊医院、北京市临床医学研究所北京100050 首都医科大学附属北京友谊医院消化内科北京100050

目的探讨蛋白O-岩藻糖基转移酶1(pofut1)对食管鳞癌细胞增殖、迁移、周期和凋亡的影响及其潜在机制。方法利用siRNA转染人食管鳞癌细胞KYSE30和EC109细胞株,按转染情况分为pofut1敲低组(转染pofut1 siRNA)和阴性对照组(转染NC siRNA)。... 详细信息

目的探讨蛋白O-岩藻糖基转移酶1(pofut1)对食管鳞癌细胞增殖、迁移、周期和凋亡的影响及其潜在机制。方法利用siRNA转染人食管鳞癌细胞KYSE30和EC109细胞株,按转染情况分为pofut1敲低组(转染pofut1 siRNA)和阴性对照组(转染NC siRNA)。应用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法验证敲低效果。通过CCK-8法、Transwell实验检测不同的pofut1表达对细胞增殖、迁移能力的影响;采用流式细胞术检测敲低pofut1后食管鳞癌细胞周期和凋亡的变化。通过转录组测序分析pofut1敲低组与阴性对照组KYSE30细胞中的差异表达基因,利用KEGG数据库分析潜在的信号通路。结果与阴性对照组相比,pofut1敲低组细胞增殖能力及迁移细胞数均明显降低,差异均有统计学意义(Ppofut1敲低组凋亡细胞比例增加,同时,细胞周期G2/M期细胞比例增加,差异均有统计学意义(Ppofut1后,多条癌症相关信号通路分子表达发生改变,其中鞘脂信号通路相关基因S1PR5与MAPK8,以及NOTCH信号通路相关基因NOTCH1、NOTCH2、DLL1表达均降低。结论pofut1体外敲低导致食管鳞癌细胞增殖和迁移减少、细胞周期阻滞以及凋亡水平升高,pofut1可能通过鞘脂信号通路、NOTCH信号通路等影响食管鳞癌细胞生物学行为。

关键词：细胞增殖细胞凋亡食管鳞癌 pofut1 迁移

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pofut1异常表达与消化系统肿瘤的发生发展

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中国组织化学与细胞化学杂志 2023年第2期32卷 208-211页

作者：张年凤杨智英李光蒋渝向安萍宋旭日张运凤肖娟黄河岳阳职业技术学院慢性病岳阳市重点实验室岳阳414000 中南大学基础医学院组织学与胚胎学系长沙410013 长沙卫生职业学院药学系长沙410100 岳阳市中心医院岳阳414000 宁乡市人民医院宁乡410600

蛋白O-岩藻糖基转移酶1(protein O-fucosyltransferase 1,pofut1)是O-岩藻糖基转移酶家族蛋白中的一员。pofut1介导的岩藻糖基化修饰在消化系统肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用,是消化系统肿瘤的研究热点。本文主要对pofut1在消化... 详细信息

蛋白O-岩藻糖基转移酶1(protein O-fucosyltransferase 1,pofut1)是O-岩藻糖基转移酶家族蛋白中的一员。pofut1介导的岩藻糖基化修饰在消化系统肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用,是消化系统肿瘤的研究热点。本文主要对pofut1在消化系统肿瘤中的表达特征、作用及分子机制进行综述,旨在为消化系统肿瘤治疗提供新的思路。

关键词： pofut1 NOTCH信号通路消化系统肿瘤

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蛋白-O-岩藻糖基转移酶1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

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现代预防医学 2024年第12期51卷 2248-2252+2304页

作者：王晓慧李明泰高绿叶郝艳龙冯雪飞翟元芳郭艳琳山西医科大学基础医学院病理教研室山西医科大学基础医学院解剖教研室

目的探讨非小细胞肺癌中蛋白-O-岩藻糖基转移酶1的表达及其临床意义，为非小细胞肺癌的诊断和治疗提供参考依据。方法通过TCGA、UALCAN数据库和免疫组化技术探讨pofut1 mRNA和pofut1蛋白在非小细胞肺癌的表达情况。提取TCGA数据库的... 详细信息

目的探讨非小细胞肺癌中蛋白-O-岩藻糖基转移酶1的表达及其临床意义，为非小细胞肺癌的诊断和治疗提供参考依据。方法通过TCGA、UALCAN数据库和免疫组化技术探讨pofut1 mRNA和pofut1蛋白在非小细胞肺癌的表达情况。提取TCGA数据库的临床数据，采用Kaplan-Meier法进行生存分析，采用COX比例风险回归模型分析pofut1 mRNA表达水平对非小细胞肺癌患者预后的影响。结果 pofut1 mRNA和pofut1蛋白在肺腺癌和肺鳞癌组织中均高表达(均Ppofut1 mRNA的表达水平与临床分期相关(P1),肺鳞癌中pofut1 mRNA的表达与肿瘤直径相关(P1)。COX回归分析结果显示，pofut1 mRNA高表达(P=0.012)、肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移与肺腺癌患者预后相关(均P1),临床Ⅲ-Ⅳ期是肺腺癌患者独立危险因素。肿瘤直径(P=0.001)、临床Ⅲ-Ⅳ期(P=0.006)和pofut1 mRNA高表达(P=0.049)与肺鳞癌患者预后相关，肿瘤直径大于5cm和pofut1高表达是肺鳞癌患者独立危险因素。生存分析结果显示pofut1高表达的非小细胞肺癌患者生存率显著低于低表达患者。结论 pofut1在非小细胞肺癌组织中高表达，且其高表达与患者不良预后相关，可作为非小细胞肺癌预后评估的生物标志物。

关键词：非小细胞肺癌 pofut1 生物信息学免疫组织化学预后

蛋白质O-岩藻糖基化调控子宫内膜蜕膜化的机制研究

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蛋白质O-岩藻糖基化调控子宫内膜蜕膜化的机制研究

作者：杨宇大连医科大学

学位级别：硕士

背景与目的:子宫内膜蜕膜化是子宫间质在各种激素的刺激下增殖和分化形成的一种特殊组织,指排卵后,由于激素水平改变,发生间质重构过程,其中包括子宫内膜基质细胞转变为蜕膜细胞。子宫内膜蜕膜化对妊娠的建立和维持十分重要。蛋白质糖... 详细信息

背景与目的:子宫内膜蜕膜化是子宫间质在各种激素的刺激下增殖和分化形成的一种特殊组织,指排卵后,由于激素水平改变,发生间质重构过程,其中包括子宫内膜基质细胞转变为蜕膜细胞。子宫内膜蜕膜化对妊娠的建立和维持十分重要。蛋白质糖基化是蛋白质重要的翻译后加工和修饰方式,分为N-糖基化和O-糖基化,参与了多种生理和病理过程,其中包括了胚胎植入过程等。着床糖生物学研究表明:蛋白质糖基化与子宫内膜接受性等生殖功能相关。蛋白质岩藻糖基化是蛋白质糖基化作用的一种重要形式,对于子宫内膜功能有重要意义。然而,由特异的蛋白质O-岩藻糖基转移酶(pofuts,protein O-fucosyltransferases)催化的O-岩藻糖基化在子宫内膜蜕膜化过程中的作用分子机制尚未清楚。本论文旨在探讨蛋白质O-岩藻糖基化对子宫内膜蜕膜化的影响及其作用机制。方法:1.通过免疫组化检测人正常未孕(增生期/分泌期)、正常早孕组织中pofut1的表达。2.对基质细胞进行蜕膜化诱导,利用qRT-PCR、ELISA、Western blot、免疫荧光方法检测基质细胞蜕膜后pofut1基因和蛋白的表达。3.调控pofut1,利用Western blot和免疫荧光检测蜕膜标志物的表达。4.利用Western blot、CCK-8和免疫荧光检测蜕膜后,pofut1对细胞增殖能力的影响。5.通过蛋白质免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)和Western blot检测pofut1是否可以影响Notch分子上的O-岩藻糖基化以及Notch的O-岩藻糖基化改变对Notch通路的影响。并通过Notch信号通路进一步研究pofut1对子宫内膜蜕膜化的调控作用。6.对受孕小鼠宫角注射pofut1-siRNA,通过免疫组化进一步验证pofut1在体内对小鼠子宫内膜蜕膜化过程中的作用。结果:1.收集临床样品包括人正常未孕(增生期/分泌期)和正常早孕组织,通过免疫组化结果分析得到:pofut1在人子宫内膜组织中增生期、分泌期、早孕期pofut1表达依次增高。2.在基质细胞蜕膜化过程中pofut1的表达增加。通过雌二醇(E2),甲羟孕酮17-乙酸酯(Medroxyprogesterone 17-acetate,MPA),和双丁酰环磷酸腺苷(dibutyryl cAMP,dbc AMP)联合使用对基质细胞进行蜕膜化诱导,进行形态学、qRT-PCR、ELISA、Western blot、免疫荧光分析,结果显示,细胞从长梭形变为圆形,蜕膜化的标志物PRL和IGFBP1的表达水平升高,证明基质细胞已转变为蜕膜细胞。对其进行qRT-PCR、Western blot、免疫荧光实验,结果显示:与对照组比,基质细胞蜕膜化后pofut1的表达升高。***1促进基质细胞蜕膜化。Western blot结果显示:与对照组比,转染pofut1-siRNA后PRL和IGFBP1的表达水平降低,当转染pofut1-cDNA后,PRL和IGFBP1的表达水平明显升高。免疫荧光实验结果与之一致。***1通过激活细胞周期蛋白,从而促进基质细胞增殖能力。Western blot结果显示:与对照组比,转染pofut1-siRNA,细胞增殖核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白(cyclin D1、CDK2、CDK6)的表达水平降低,转染pofut1-cDNA,细胞中PCNA和细胞周期蛋白的表达水平升高。CCK-8结果显示:转染pofut1-siRNA组的细胞生长速度慢于对照组细胞,而转染pofut1-cDNA后,细胞的生长速度显著高于对照组。免疫荧光实验结果与之一致。***1通过上调Notch分子上的O-岩藻糖基化,激活Notch信号通路从而促进子宫内膜蜕膜化。Western blot结果显示:细胞蜕膜化后,总蛋白的O-岩藻糖表达上调,当转染pofut1-siRNA则下调O-岩藻糖的表达,转染pofut1-cDNA,O-岩藻糖表达上调。IP结果显示:用Notch1抗体进行IP,与对照组比,转染pofut1-siRNA,Notch1上的O-岩藻糖和其配体Jagged-1表达下调;转染pofut1-cDNA,它们的表达上调;而转染pofut1-mutant,它们与对照组比未见明显变化。证明Notch1上的O-岩藻糖表达对Notch通路产生影响。同时Western blot结果显示:当加入Notch信号通路抑制剂时,PRL和IGFBP1的表达下调。6.小鼠宫角注射pofut1-siRNA后小鼠子宫内膜蜕膜化受到抑制,胚胎着床率降低。通过免疫组化实验证明:当小鼠宫角注射pofut1-siRNA后,IGFBP1和PCNA表达均明显下降。结论:***1在人子宫内膜组织中增生期、分泌期、早孕期poFU

关键词：蛋白质O-岩藻糖基化 pofut1 子宫内膜蜕膜化 Notch信号通路

加权基因共表达网络分析鉴定左右半结直肠癌差异相关基因

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加权基因共表达网络分析鉴定左右半结直肠癌差异相关基因

作者：吕一鸣浙江大学

学位级别：硕士

背景与目的:肿瘤原发部位是结直肠癌疾病管理的重要因素,这已成为了大家的共识。在目前提倡精准医学的形势下,为进一步探究左右半结直肠癌的临床表现及其对治疗反应的差异,我们分析了 GSE39582和TCGA数据库中结直肠癌样本的表达谱数据,... 详细信息

背景与目的:肿瘤原发部位是结直肠癌疾病管理的重要因素,这已成为了大家的共识。在目前提倡精准医学的形势下,为进一步探究左右半结直肠癌的临床表现及其对治疗反应的差异,我们分析了 GSE39582和TCGA数据库中结直肠癌样本的表达谱数据,来探讨其中潜在的分子机制。方法:本研究采用加权基因共表达网络分析对数据集GSE39582的436个样本及TCGA的644个样本的表达谱构建了基因共表达网络并划分基因模块。计算各基因模块与临床性状(尤其是肿瘤原发部位)的关系,从而定位关键模块,并筛选关键模块中的枢纽基因。最后对枢纽基因在大样本结直肠癌病例中进行表达谱分析、生存分析及富集分析。结果:加权基因共表达网络分析算法在GSE39582数据集和TCGA结直肠癌数据集中各划分出31和26个基因模块,确定了 red和dark-gray模块与肿瘤原发部位的相关性最大,筛选出12个关键的枢纽基因,并着重研究了基因PLAGL2和pofut1。TCGA数据集提示PLAGL2和pofut1在结直肠癌中存在过表达,表达水平存在强正相关性。在30例结直肠癌临床样本中,实时荧光定量聚合酶链式反应试验也证明PLAGL2和pofut1的表达呈显著正相关。此外,大数据生存分析提示它们对左右半结直肠癌患者的预后存在不同影响,富集分析则发现它们均富集于相同通路。结论:本研究通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)所划分基因模块并最终成功定位了与结直肠癌肿瘤原发部位相关的red、dark-gray模块以及其中的枢纽基因,并验证了关键基因表达水平和探究了部分生物学影响。PLAGL2和pofut1作为和肿瘤原发部位最具相关性的基因,未来可能可以作为潜在的生物标记物和精准医学的治疗靶点。

关键词：生物信息学分析结直肠癌肿瘤部位加权基因共表达网络分析 PLAGL2 pofut1