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甲状腺乳头状癌中RSK4-PODXL通路异常的机制研究

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甲状腺乳头状癌中RSK4-PODXL通路异常的机制研究

作者：赵燕芸青岛大学

学位级别：硕士

目的:研究在甲状腺乳头状癌(PTC)中核糖体S6蛋白激酶4(RSK4)基因对Podocalyxin类蛋白(PODXL)表达的影响及作用机制,并探究PODXL基因在PTC中的作用及影响。方法:收集2019年7月至2021年7月期间,收治于青岛大学附属医院甲状腺外科因患有PT... 详细信息

目的:研究在甲状腺乳头状癌(PTC)中核糖体S6蛋白激酶4(RSK4)基因对Podocalyxin类蛋白(PODXL)表达的影响及作用机制,并探究PODXL基因在PTC中的作用及影响。方法:收集2019年7月至2021年7月期间,收治于青岛大学附属医院甲状腺外科因患有PTC而入院治疗的200例患者标本,标本采集于进行甲状腺全切以及次全切除术患者的PTC组织和邻近的正常组织,分别通过Western blot、RT-PCR实验方法检测PTC组织及其邻近正常组织中PODXL、RSK4在蛋白和转录水平的表达量差异,与此同时采用免疫组织化学染色方法对PODXL进行定位分析,并进行PODXL与RSK4表达水平之间的相关性分析。通过Western blot方法检测在RNA干扰RSK4表达后的PTC细胞及其对照细胞中分别加入泛素蛋白酶体抑制剂和溶酶体抑制剂后PODXL蛋白降解变化情况。利用Western blot方法分别测定RNA干扰PODXL表达和RSK4表达后对PTC细胞MAPK/ERK通路活性变化的影响。分别使用PODXL sh RNA慢病毒载体和PODXL过表达质粒对PTC细胞进行转染,并进行Western blot验证转染效率;敲减和过表达PODXL后PTC细胞增殖能力的改变通过CCK-8实验进行检测;采用Transwell细胞迁移及侵袭实验对敲减和过表达PODXL的PTC细胞迁移和侵袭能力的改变进行检测。应用SPSS 26.0对实验相关数据做统计学分析,并使用Graphpad Prism 8进行绘图。结果:1.RT-PCR结果表明在PTC组织与邻近正常组织中PODXL m RNA的相对表达量无显著差异;Western blot实验结果表明,PTC组织中PODXL蛋白表达水平显著高于邻近正常组织;免疫组化实验结果显示,高表达PODXL的阳性细胞数在PTC组织明显高于邻近正常组织,且在PTC组织中RSK4表达和PODXL表达之间存在负相关关系。2.通过Western blot实验方法探究RSK4调控PODXL的机制,结果显示RSK4是通过溶酶体途径影响PODXL蛋白的降解。3.通过Western blot蛋白水平验证相关信号通路,结果表明:PODXL的下调可使MAPK-ERK信号通路活性降低,RSK4是通过调节PODXL抑制MAPK-ERK通路的活性。4.检测PODXL对肿瘤的生物学活性的影响:CCK-8细胞增殖实验结果表明,敲减或过表达PODXL组与相应的对照组之间PTC细胞增殖能力没有显著的统计学差异,PODXL基因对PTC细胞增殖能力无显著影响;通过Transwell侵袭及迁移实验,结果表明过表达PODXL的BCPAP细胞侵袭迁移能力显著高于其相应对照组,而敲减PODXL组细胞侵袭迁移能力显著低于对照组。结论:1.PTC组织中PODXL蛋白表达显著高于其邻近正常组织,且PODXL表达与RSK4表达呈负相关关系。2.RSK4介导PODXL通过溶酶体途径降解。3.RSK4通过调控PODXL抑制MAPK/ERK通路的活性。4.PODXL作为一种促癌基因,可能通过促进MAPK/ERK通路的激活,促进PTC细胞的相关恶性生物学行为。

关键词： PODXL RSK4 甲状腺乳头状癌 MAPK/ERK信号通路

LncRNA SNHG14/miR⁃148a⁃3p/PODXL轴在瘢痕疙瘩形成过程中的分子机制

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实用医学杂志 2021年第24期37卷 3137-3142页

作者：李嫚温晓东张立燕刘军中国人民解放军联勤保障部队第九四一医院烧伤整形科西宁810007

目的探讨LncRNA SNHG14/miR⁃148a⁃3p/PODXL轴在瘢痕疙瘩形成过程中的分子机制。方法qRT⁃PCR法与Western blot法分别检测正常皮肤组织、瘢痕疙瘩组织中SNHG14、miR⁃148a⁃3p、PODXL的表达量;Pearson法分析瘢痕疙瘩组织中SNHG14与miR⁃148a⁃3p的相关性,以及miR⁃148a⁃3p与PODXL的相关性;体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞,si⁃NC、si⁃SNHG14分别转染入瘢痕疙瘩成纤维细胞;MTT实验、平板克隆形成实验、Transwell小室实验分别检测细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭;双荧光素酶报告基因实验检测SNHG14与miR⁃148a⁃3p的靶向关系,以及miR⁃148a⁃3p与PODXL的靶向关系;Western blot法检测ProcollagenⅠ、α⁃SMA、Col1蛋白表达量。结果与正常皮肤组织比较,瘢痕疙瘩组织中SNHG14与PODXL的表达量升高(PPODXL呈负相关(r=-0.8559,PPODXL呈正相关(r=0.7241,PPODXL的表达量,促进miR⁃148a⁃3p的表达,并可降低细胞活力、克隆形成、迁移及侵袭能力,ProcollagenⅠ、α⁃SMA、Col1蛋白水平降低,差异有统计学意义(PPODXL。结论干扰SNHG14表达可通过调控miR⁃148a⁃3p/PODXL轴而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭及胶原蛋白合成。

关键词： LncRNA SNHG14 miR⁃148a⁃3p PODXL 瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移侵袭

PODXL、p53及Ki-67在结直肠癌组织的表达及其临床意义

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PODXL、p53及Ki-67在结直肠癌组织的表达及其临床意义

作者：查汉益吉林大学

学位级别：硕士

目的:探讨足细胞标记蛋白(podocalyxin-like protein 1,PODXL)、肿瘤抑制基因(p53)、细胞核增殖抗原(Ki-67)在结直肠癌组织中的表达情况及其临床意义。材料与方法:收集吉林大学中日联谊医院胃肠结直肠肛门外科2013年1月至2015年1月行结... 详细信息

目的:探讨足细胞标记蛋白(podocalyxin-like protein 1,PODXL)、肿瘤抑制基因(p53)、细胞核增殖抗原(Ki-67)在结直肠癌组织中的表达情况及其临床意义。材料与方法:收集吉林大学中日联谊医院胃肠结直肠肛门外科2013年1月至2015年1月行结直肠癌根治术的癌组织石蜡标本和癌旁正常组织标本各90例,采用免疫组织化学SP法检测组织中PODXL、p53、Ki-67的表达情况。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照,以已知阳性的肾组织切片作为阳性对照。采用?检验或Fisher确切概率法分析蛋白表达与临床病理特征之间的关系;单因素生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线,组间比较采用Log-rank检验;多因素生存分析采用Cox比例风险回归模型。以PPODXL在结直肠癌组织中的阳性表达率为50.0%(45/90),高表达率为22.2%(20/90);而在癌旁正常组织中的阳性表达率为25.6%(23/90),高表达率为10.0%(9/90);两者差异有统计学意义(?=4.974,P=0.026)。p53在结直肠癌组织的阳性表达率为73.3%(66/90),高表达率为47.8%(43/90)。Ki-67在结直肠癌组织的阳性表达率为94.4%(85/90),高表达率为54.4%(49/90)。2、PODXL在TNM分期、淋巴结转移、组织学类型差异有统计学意义(?=5.347、4.400、10.633,PPODXL的表达与p53、Ki-67的表达相关(Phi=0.345、0.274,PPODXL高表达、p53高表达、Ki-67高表达对结直肠癌患者预后存在影响。将这些因素纳入多因素分析,结果显示:TNM分期[危险比(HR)=0.182,95%置信区间(CI):0.045.742,PPODXL高表达(HR=0.374,95%CI:0.152.921,PPODXL在结直肠癌组织中表达增加,它的高表达与TNM分期,淋巴结转移,组织学类型及预后的生存时间有关,可作为判断患者预后的指标。2、p53高表达与肿瘤位置、TNM分期、组织学类型、脉管浸润、PODXL高表达及预后生存时间相关,能够作为结直肠癌判断患者预后的指标。3、Ki-67高表达与TNM分期相关。

关键词：结直肠癌 PODXL p53 Ki67 免疫组化预后

MiR-509-3-5p负向调控PODXL抑制胃癌侵袭转移的研究

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MiR-509-3-5p负向调控PODXL抑制胃癌侵袭转移的研究

作者：章靖上海交通大学

学位级别：硕士

目的:本研究旨在探讨miR-509-3-5p和PODXL在胃癌中的表达情况及其与临床病理特征的关系;应用体内、外实验研究miR-509-3-5p和PODXL在胃癌侵袭转移中的作用;应用分子生物学研究miR-509-3-5p对PODXL的调控机制。方法:首先利用miRNA芯片筛... 详细信息

目的:本研究旨在探讨miR-509-3-5p和PODXL在胃癌中的表达情况及其与临床病理特征的关系;应用体内、外实验研究miR-509-3-5p和PODXL在胃癌侵袭转移中的作用;应用分子生物学研究miR-509-3-5p对PODXL的调控机制。方法:首先利用miRNA芯片筛选淋巴结转移为N0和N3的胃癌组织中差异表达的miRNAs;利用q RT-PCR、ISH检测miR-509-3-5p等在胃癌组织中的表达情况;上、下调miR-509-3-5p表达后分别检测胃癌细胞株体内、外的生物学行为;利用生物信息学、q RT-PCR、Western blot、luciferase实验检测miR-509-3-5p对PODXL的调控机制;公共数据库、q RT-PCR、ISH、IHC等实验进一步阐述miR-509-3-5p与PODXL的相关性;体内实验阐述PODXL在胃癌中的作用。结果:1、miRNA芯片筛选结果显示N3组中miR-509-3-5p等信号值显著降低;qRT-PCR、ISH结果显示miR-509-3-5p在配对的胃癌组织中表达较低,且与胃癌临床病理等呈负相关性;miR-509-3-5p可以作为判断胃癌术后总体生存率的独立影响因素;TCGA数据库显示miR-509-3-5p的表达与分期呈负相关性;2、上调胃癌细胞BGC823中miR-509-3-5p的表达后,可以减弱胃癌细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力,下调胃癌细胞MGC803中miR-509-3-5p的表达后,可以增强胃癌细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力;体内实验证实敲减胃癌细胞MGC803中miR-509-3-5p的表达后,可以促进裸鼠体内肿瘤生长和淋巴结转移;3、生物信息学、q RT-PCR、Western blot、luciferase实验结果显示miR-509-3-5p可以靶向调控PODXL的表达;q RT-PCR、ISH、IHC等实验结果进一步提示miR-509-3-5p与PODXL的负向调控关系;4、IHC与公共数据库结果显示PODXL在胃癌组织中高表达,且与胃癌临床病理特征呈正相关。上调胃癌细胞BGC823中PODXL的表达后,可增强胃癌细胞克隆形成、迁移和侵袭能力,下调胃癌细胞MGC803中PODXL的表达后,可减弱胃癌细胞克隆形成、迁移和侵袭能力。结论:MiR-509-3-5p可以通过负向调控PODXL,抑制胃癌的侵袭和淋巴结转移。MiR-509-3-5p/PODXL通路的发现可能为胃癌淋巴结转移的诊断和预后判断提供新的分子标记物。

关键词：胃癌 MiR-509-3-5p PODXL 侵袭淋巴结转移

RSK4基因在甲状腺乳头状癌中作用的机制研究

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RSK4基因在甲状腺乳头状癌中作用的机制研究

作者：尹雅楠青岛大学

学位级别：硕士

目的1.研究核糖体S6蛋白激酶4（RSK4）基因甲基化在甲状腺乳头状癌（PTC）中的作用;2.初步探讨PTC中RSK4对Podocalyxin类蛋白（PODXL）的影响。方法1.收集2018年4月至2018年10月在我院接受甲状腺全切及次全切除术的PTC患者癌组织及相应... 详细信息

目的1.研究核糖体S6蛋白激酶4（RSK4）基因甲基化在甲状腺乳头状癌（PTC）中的作用;2.初步探讨PTC中RSK4对Podocalyxin类蛋白（PODXL）的影响。方法1.收集2018年4月至2018年10月在我院接受甲状腺全切及次全切除术的PTC患者癌组织及相应癌旁组织各226例,应用逆转录-定量PCR（RT-qPCR）检测RSK4表达量,一代测序检测癌组织中BRAF V600E突变率,其中134组标本应用甲基化特异性PCR（MSP）、31组标本应用亚硫酸盐基因组测序法（BGS）来检测RSK4基因启动子区甲基化状态,分析其与RSK4表达、BRAF V600E突变及临床病理特征的相关性。运用RT-qPCR、Western blot及BGS检测甲状腺癌细胞系TPC-1、BHT101及正常甲状腺上皮细胞系Nthy-ori3-1中RSK4 mRNA、蛋白表达量及启动子区甲基化状态;运用去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza,10μM）处理以上3种细胞系后,RT-qPCR和Western blot检测RSK4表达量变化,CCK8实验检测5-Aza对TPC-1和BHT101细胞增殖能力的影响;在BHT101中敲降BRAF V600E后,RT-qPCR与BGS分别检测RSK4 mRNA水平和甲基化状态;。2.shRNA慢病毒干扰PTC细胞系（BCPAP）中RSK4,采用TMT相对定量蛋白质组学分析筛选出受RSK4调控的蛋白质。在敲降RSK4的BCPAP中,首先运用RT-qPCR和Western blot对筛选出的PODXL表达量进行验证,之后转染PODXL过表达质粒,Western blot检测外源性PODXL蛋白变化情况,最后在细胞中加入CHX抑制蛋白质合成,分别在0h,2h,4h,8h,16h,24h各时间点收取细胞蛋白,Western blot分析RSK4对PODXL蛋白降解的影响。RT-qPCR和Western blot检测PTC组织和癌旁组织中PODXL表达。过表达或敲降BCPAP中PODXL,Western blot分析其对丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的影响。结果1.（1）PTC中RSK4 mRNA水平显著低于癌旁组织;MSP结果显示PTC中RSK4基因启动子甲基化阳性率高于癌旁组织,PTC组织中甲基化组RSK4 m RNA水平低于非甲基化组;BGS同样证明PTC中RSK4启动子甲基化率高于癌旁组织,PTC组织中RSK4甲基化率与mRNA水平呈负相关。（2）BRAF V600E突变PTC患者RSK4表达量显著低于无BRAF V600E突变患者,但不管是否具有BRAF V600E突变,PTC组织中RSK4水平均低于癌旁组织;BRAF V600E突变患者PTC组织RSK4甲基化阳性率高于癌旁组织,无BRAF V600E突变患者癌与癌旁甲基化阳性率无显著差异。（3）有淋巴结转移患者PTC组织RSK4甲基化率高于无淋巴结转移患者,肿瘤直径＞1cm患者PTC组织RSK4甲基化率高于肿瘤直径≤1cm患者。（4）TPC-1、BHT101中RSK4 mRNA与蛋白表达量均低于Nthy-ori3-1,而RSK4启动子甲基化率明显高于Nthy-ori3-1;（5）去甲基化药物5?Aza处理细胞后,TPC-1、BHT101中RSK4 mRNA和蛋白表达量部分恢复,细胞增殖能力受到抑制。（6）敲降BHT101细胞中BRAF V600E引起RSK4 mRNA水平升高,启动子甲基化率降低。2.（1）TMT相对定量蛋白质组学结果显示,敲降BCPAP中RSK4后,51种蛋白质表达发生显著改变,其中PODXL为上调最明显的蛋白之一。（2）敲降RSK4后,BCPAP中内源性及外源性PODXL蛋白表达均明显升高,PODXL mRNA水平无明显变化。（3）PTC组织中PODXL蛋白水平的明显高于癌旁组织,PODXL mRNA水平在癌与癌旁组织中无显著差异。（4）敲降RSK4后PODXL蛋白质降解明显减慢。（5）敲降PODXL使细胞外调节蛋白激酶（ERK）磷酸化水平降低,过表达PODXL则使ERK磷酸化水平增加。结论1.PTC中RSK4表达降低的机制之一为启动子区CpG岛高甲基化,其表达及甲基化状态受BRAF V600E影响,RSK4甲基化状态与肿瘤增殖与淋巴结转移相关,其有可能成为PTC早期诊断及治疗的分子靶点。2.RSK4可以促进PODXL蛋白降解,其对PODXL的调控可能为转录后水平,PODXL可以增强MAPK通路活性,初步推测RSK4-PODXL通路的异常激活了MAPK通路。

关键词：甲状腺乳头状癌 RSK4 甲基化 BRAF V600E PODXL