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中国家禽 2020年第12期42卷 55-61页

作者：汪晓娜王蕾李庆东吴利华杨雪马岩超贺明星曹金党郑立王志祥韩进诚河南农业大学动物科技学院河南郑州450046 商丘师范学院生物与食品学院河南商丘476000 河南省绿色功能饲料添加剂开发与应用工程技术研究中心河南商丘476000 山东省食品药品检验研究院山东济南250101 商丘市动物疫病预防中心河南商丘476000 河南正本清源科技发展股份有限公司河南商丘476000 山东海能生物工程有限公司山东日照276800 河南牧业经济学院动物科技学院河南郑州450046

为研究不同日龄对肉鸡体重、骨骼生长及十二指肠钙结合蛋白(CabP-D28k)、钙离子转运ATP酶b1(pmcalb)、细胞核维生素D受体(nVDR)、细胞膜维生素D受体(mVDR)等钙吸收关键基因表达的影响,将1日龄罗斯308肉鸡公雏96只随机分为8个重复,每个重... 详细信息

为研究不同日龄对肉鸡体重、骨骼生长及十二指肠钙结合蛋白(CabP-D28k)、钙离子转运ATP酶b1(pmcalb)、细胞核维生素D受体(nVDR)、细胞膜维生素D受体(mVDR)等钙吸收关键基因表达的影响,将1日龄罗斯308肉鸡公雏96只随机分为8个重复,每个重复12只鸡。给肉鸡饲喂常规营养水平饲粮。在14、21、28、35、42日龄时,分别从每个重复中随机取出1只鸡,合计8只,空腹12小时后屠宰。刮取十二指肠黏膜,利用荧光定量qRT-PCR技术,分析钙吸收关键基因的表达水平。结果显示:①14~42日龄时,肉鸡体重随日龄增加而线性提高(PbP-D28k、pmca1b、nVDR、mVDR mRNA表达水平随日龄增加呈现先升高后降低的趋势,在28日龄达到最高峰;但CabP-D28k mRNA表达水平在各日龄间差异不显著。结果表明:尽管14~42日龄肉鸡体重、股骨与胫骨重量、灰分重量线性增加;但股骨与胫骨灰分含量线性降低;而CabP-D28k、pmca1b、n VDR、mVDR等钙吸收关键基因表达水平呈现先升高后降低的趋势,在28日龄达到最高峰。研究提示:肉鸡小肠钙吸收能力随日龄而改变。

关键词：日龄肉鸡 CabP-D28k pmca1b nVDR mVDR

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依普拉芬及1,25-二羟维生素D3对鸡胚胫骨成骨细胞增殖及钙通道TRPV6表达的影响

依普拉芬及1,25-二羟维生素D3对鸡胚胫骨成骨细胞增殖及钙通道TRP...

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作者：李成南京农业大学

学位级别：硕士

新型上皮性钙通道成员的TRPV5/TRPV6表现为对钙离子具有高度选择性,对钙离子代谢及骨代谢有着非常重要的作用。近来研究表明,雌激素、1,25二羟维生素D3、PTH.饮食钙和药物都可调节TRPV5/TRPV6的表达。研究显示,TRPV5主要存在于’肾,TRPV... 详细信息

新型上皮性钙通道成员的TRPV5/TRPV6表现为对钙离子具有高度选择性,对钙离子代谢及骨代谢有着非常重要的作用。近来研究表明,雌激素、1,25二羟维生素D3、PTH.饮食钙和药物都可调节TRPV5/TRPV6的表达。研究显示,TRPV5主要存在于’肾,TRPV6主要存在于小肠,两者在骨组织主要存在于成骨细胞。目前,国外研究已证明在肾TRPV5、在小肠TRPV6通道通过钙的重吸收作用调节正常细胞内、外的钙水平;已发现大鼠bMSCs来源的成骨细胞诱导分化过程中TRPV5和TRPV6钙离子通道的表达,与颅骨来源的成骨细胞内TRPV5和TRPV6的表达情况一样。但是,针对鸡胚胫骨成骨细胞内TRPV6的表达情况以及与骨质疏松的关系的研究尚未见文献报道。鸡胚胫骨来源的成骨细胞为研究成骨细胞在骨形成中的作用提供了最佳的体外试验模型。采用酶消化和组织块移行生长相结合的方法获取成骨细胞。应用倒置相差显微镜观察、噻唑蓝(MTT)比色法、碱性磷酸酶染色(ALP)、钙化结节染色、姬姆萨染色从形态学、生物学上对细胞进行鉴定。鉴定结果显示,鸡胚胫骨成骨细胞具有典型成骨细胞的形态特征、ALP活性等功能,符合细胞的生长特性,并可在体外发生钙化。本试验取鸡胚胫骨来源的成骨细胞,进行植物雌激素依普拉芬或1,25二羟维生素D3的干预,应用MTT法、RT-PCR以及流式细胞仪技术检测成骨细胞的增殖活性、成骨相关性细胞因子的表达和TRPV6的表达以及细胞内钙离子浓度。结果表明,依普拉芬和1,25二羟维生素D3均可促进鸡胚胫骨成骨细胞的增殖,并且增殖作用明显(Ppmcalb mRNA的表达水平出现抑制作用,在10-6mol·L-1时出现极显著地抑制(Ppmca1b mRNA的表达水平没有规律的变化趋势,但在10-11mol·L-1时出现极显著地促进(Ppmca1b mRNA、 ALP mRNA的表达水平具有相关性,并且对细胞内钙离子浓度也具有影响作用。

关键词：胫骨成骨细胞依普拉芬 1,25二羟维生素D3 TRPV6 pmca1b ALP Ca2+

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雌激素对十二指肠钙吸收的调节及其机制的研究

雌激素对十二指肠钙吸收的调节及其机制的研究

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作者：聂绪彪遵义医学院

学位级别：硕士

目的:小肠对饮食钙的吸收是维持机体钙平衡和骨骼健康的重要生理过程。而雌激素在人体具有重要的生理及病理意义。有研究表明,雌激素参与调节了小肠的钙吸收。然而,关于雌激素调节小肠钙吸收的机制目前尚未完全清楚。在这项研究中,我们... 详细信息

目的:小肠对饮食钙的吸收是维持机体钙平衡和骨骼健康的重要生理过程。而雌激素在人体具有重要的生理及病理意义。有研究表明,雌激素参与调节了小肠的钙吸收。然而,关于雌激素调节小肠钙吸收的机制目前尚未完全清楚。在这项研究中,我们旨在探索雌激素对十二指肠钙吸收的影响及其细胞分子机制。为临床上一些疾病的治疗提供理论依据,有重要的科学及临床意义。方法:(1)动物模型的建立。选择性成熟期(6周龄)C57bL/6J雌鼠在全麻下进行假手术和卵巢切除术。在手术两周后,将卵巢切除小鼠随机分为单纯卵巢切除术组(OVX)、卵巢切除+17β-雌二醇替代治疗组(OVX+E2),假手术小鼠为对照组(CONTROL)。OVX+E2组小鼠按每100g体重给予10.5μg 17β-雌二醇(E2)替代治疗。(2)十二指肠腔灌钙实验测定雌激素对小鼠十二指肠钙吸收的影响。(3)用免疫组化、蛋白质印迹实验(Western-blot)检测十二指肠钙转运蛋白(TRPV6、pmca1b)蛋白的表达情况。(4)PTI高速离子成像系统检测雌激素对十二指肠上皮细胞(SCbN细胞)钙吸收的影响。(5)PTI高速离子成像系统检TRPV6、pmca1b抑制剂对SCbN细胞钙吸收的影响。(6)PTI高速离子成像系统检测雌激素受体ERα、ERβ激动剂刺激+TRPV6、pmca1b抑制剂刺激后SCbN细胞钙吸收的影响。(7)SCbN细胞在给予雌激素受体ERα、ERβ抑制剂刺激后,Western-blot检测TRPV6、pmca1b的表达情况。(8)RNAi实验:构建质粒通过慢病毒转染使SCbN细胞的雌激素受体ERa、ERβ基因沉默后,Western-blot检测TRPV6、pmca1b蛋白的表达情况。结果:(1)与对照组相比,OVX小鼠十二指肠钙吸收明显减少,给予外源雌激素刺激后可以恢复OVX小鼠十二指肠对钙的吸收(P1)。(2)雌激素缺乏可以导致小鼠十二指肠钙转运蛋白TRPV6、pmca1b表达降低,给予17β-雌二醇治疗可以上调小鼠十二指肠TRPV6、pmca1b的表达,差异具有统计学意义(PbN细胞给予17β-雌二醇刺激后其外钙内流增加,其TRPV6、pmca1b的表达上调,差异具有统计学意义(PbN细胞给予TRPV6、pmca1b抑制剂刺激后,其外钙内流明显减少,差异具有统计学意义(PbN细胞的外钙内流,而选择性雌激素受体ERβ激动剂DPN主要通过pmca1b增加SCbN细胞的外钙内流,差异具有统计学意义(PbN细胞雌激素受体基因沉默或给予雌激素受体抑制剂刺激后,发现抑制或沉默ERa会导致TRPV6表达降低,pmca1b无明显变化;抑制或沉默ERβ后TRPV6表达降低不明显,而pmca1b表达明显降低,差异具有统计学意义(Ppmca1b的表达及功能活性不同的调节作用进而调节十二指肠的钙吸收。这进一步阐明了雌激素调节小肠钙吸收的作用机制。

关键词：雌激素雌激素受体十二指肠钙吸收 TRPV6 pmca1b

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植物乳杆菌LP-1上清调控肠道钙离子抗PEDV作用研究

植物乳杆菌LP-1上清调控肠道钙离子抗PEDV作用研究

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作者：阚子斐西南大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起猪的一种急性高度接触性肠道传染性疾病。临床症状为呕吐、严重腹泻、脱水并最终导致仔猪死亡。该病对哺乳期仔猪具有极... 详细信息

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起猪的一种急性高度接触性肠道传染性疾病。临床症状为呕吐、严重腹泻、脱水并最终导致仔猪死亡。该病对哺乳期仔猪具有极高的感染率,感染后致死率高达95%以上,给养猪业带来极大地危害。从2010年起,PEDV疫苗的免疫效果越来越差,免疫后的猪群同样爆发PEDV且出生仔猪死亡率高达90%以上。在如此大环境下急需探寻新方法来防治PED。益生菌能通过调节宿主肠道黏膜免疫系统维持肠道内环境微生物稳态,提高营养物质吸收效率,维持肠道菌群平衡,起到保护肠道健康的功能。已有研究表明,多种益生菌代谢产物具有抗病毒作用且能调节大鼠小肠上皮细胞中的钙离子浓度,本实验室前期成功分离得到一株植物乳杆菌,命名为LP-1,前期试验表明该菌株上清液能够抑制PEDV感染,但具体机制还未知。Ca作为细胞内信号转导过程中重要的第二信使,是维持和调节机体生理功能的必需元素。当Ca稳态遭到破坏时,将会引发疾病和代谢紊乱。有研究表明一些病毒感染之后,能调控细胞内钙离子水平或钙离子通道以达到促进自身感染和复制的目的。目前尚不明确PEDV感染过程中能否引起钙离子浓度上升促进自身复制。基于此,探究Ca在PEDV感染过程中作用,植物乳杆菌LP-1上清是否通过调控Ca抗病毒,这两点为PEDV的防治的新方法提供理论基础。本论文的内容及结果如下:植物乳杆菌LP-1上清抗PEDV-LJX株作用研究:测定植物乳杆菌LP-1生长曲线,确定12h为上清的最佳获取时间。MTT法检测LP-1S1/4倍稀释为IPEC-J2细胞的最大无毒剂量,Western-blot检测发现1/4倍稀释为抗PEDV最佳浓度且具有浓度依赖性。LP-1S处理IPEC-J2细胞在8h、12h、24h时能显著降低PEDV N蛋白表达,TCID结果表明在12h、24h、48h时LP-1S预处理组能显著降低病毒滴度。表明植物乳杆菌LP-1上清具有良好的抗PEDV作用。细胞外Ca浓度变化对PEDV复制研究:用火焰原子吸收法建立Ca浓度标准曲线,用火焰原子吸收法检测细胞外Ca浓度,PEDV感染后细胞外Ca浓度低于空白对照组。用钙离子荧光探针Fluo-3AM检测细胞内Ca浓度,PEDV感染组细胞内Ca荧光强度都极显著高于空白对照组的Ca荧光强度。MTT法检测EGTA细胞毒性,用EGTA螯合细胞外Ca,绝对荧光定量PCR方法检测IPEC-J2细胞中PEDV M基因拷贝数,Western-blot方法检测PEDV N蛋白表达量,EGTA预处理组PEDV M基因拷贝数和N蛋白表达量都显著低于PEDV组。为了确定EGTA对PEDV增殖的影响,在用EGTA处理细胞后加入Ca Cl补充细胞外钙离子,绝对荧光定量PCR、Western-blot检测发现添加Ca Cl后能回复PEDV M基因拷贝数和N蛋白表达量。用钙离子通道抑制剂盐酸苄普地尔处理细胞,发现盐酸苄普地尔预处理组能降低PEDV M基因拷贝数和N蛋白表达量。利用钙螯合剂bAPTA-AM预处理IPEC-J2细胞,发现bAPTA-AM预处理也能降低PEDV M基因拷贝数和N蛋白表达量。这些结论说明细胞内外Ca在PEDV感染过程中起着重要作用。植物乳杆菌LP-1上清调控钙离子抗PEDV作用研究:用火焰原子吸收法检测细胞外Ca浓度,在2h、8h、24h、48h时LP-1S能恢复由于PEDV感染引起的细胞外Ca浓度降低。用钙离子荧光探针Fluo-3AM检测细胞内Ca浓度,LP-1S处理组能降低由于PEDV感染引起的钙离子浓度异常升高。用相对荧光定量检测TRPV6的表达量,PEDV组能升高TRPV6的表达量,LP-1S预处理组能降低在PEDV感染情况下TRPV6的表达。用Western-blot检测TRPV6的表达量在6h和24h时LP-1S能够降低在PEDV感染情况下TRPV6的蛋白表达。用相对荧光定量检测pmca1b的表达量,LP-1S能够升高在PEDV感染情况下pmca1b的表达。用Western-blot检测pmca1b的表达量在6h和12h两个时间点LP-1S能够升高在PEDV感染情况下pmca1b的蛋白表达。结果表明植物乳杆菌LP-1上清能调控TRPV6和pmca1b来减少进入细胞内Ca量达到抗PEDV的作用。干扰TRPV6和pmca1b影响PEDV复制初步研究:转染质粒在24h达到稳定转染的状态,使用Western-blot检测干扰效率为40%左右。使用钙离子探针Fura-2AM检测干扰TRPV6和pmca1b后细胞内Ca浓度,在干扰pmca1b后会降低细胞膜对钙离子的通透性,减少钙离子向细胞外排出,一定程度增加细胞内钙离

关键词：猪流行性腹泻病毒 Ca2+ LP-1S TRPV6 pmca1b

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