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A portable viable Salmonella detection device based on microfluidic chip and recombinase aided amplification

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Chinese Chemical Letters 2023年第2期34卷 268-273页

作者： Wuzhen Qi Siyuan Wang Lei Wang Xinge Xi Shangyi Wu Yanbin Li Ming Liao Jianhan Lin Key Laboratory of Agricultural Information Acquisition Technology Ministry of Agriculture and Rural AffairsChina Agricultural UniversityBeijing 100083China Department of Biological and Agricultural Engineering University of ArkansasFayetteville 72701United States College of Veterinary medicine South China Agricultural UniversityGuangzhou 510642China

creening of foodborne pathogens is important to prevent contaminated foods from their supply chains.n this study, a portable detection device was developed for rapid, sensitive and simple detection of viable almonella using a finger-actuated microfluidic chip and an improved recombinase aided amplification (RAA) assay. Improved propidium monoazide(pmaxx) was combined with RAA to enable this device to distinguish viable bacteria from dead ones. The modification of pmaxx into dead bacteria, the magnetic xtraction of nucleic acids from viable bacteria and the RAA detection of extracted nucleic acids were performed using the microfluidic chip on its supporting device by finger press-release operations. The fluorescent signal resulting from RAA amplification of the nucleic acids was collected using a USB camera nd analyzed using a self-developed smartphone App to quantitatively determine the bacterial concenration. This device could detect Salmonella typhimurium in spiked chicken meats from 1.3 × 10^(2) CFU/m L o 1.3 × 10^(7) CFU/m L in 2 h with a lower detection limit of 130 CFU/m L, and has shown its potential for on-site detection of foodborne pathogens.

关键词： Finger-actuated microfluidic chip pmaxx Recombinase aid amplification Smartphone App Viable bacterial detection

基于鼠源诺如病毒建立的活病毒鉴别技术及应用

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基于鼠源诺如病毒建立的活病毒鉴别技术及应用

作者：高世珏暨南大学

学位级别：硕士

人源诺如病毒(Human noroviruses,Hu No Vs)是导致全球非细菌性肠胃炎暴发的主要病原体之一,能以粪-口途径或直接接触传播。当前,Hu No Vs仍缺乏稳定可靠的体外培养系统,其确证也依赖于分子生物学检测手段。逆转录-实时荧光聚合酶链式反... 详细信息

人源诺如病毒(Human noroviruses,Hu No Vs)是导致全球非细菌性肠胃炎暴发的主要病原体之一,能以粪-口途径或直接接触传播。当前,Hu No Vs仍缺乏稳定可靠的体外培养系统,其确证也依赖于分子生物学检测手段。逆转录-实时荧光聚合酶链式反应(Real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-q PCR)作为国内外检测Hu No Vs的“金标准”,无法有效区分具有感染能力的活病毒与对人体无害的死病毒颗粒,因而通常会高估活病毒数量并造成严重的假阳性检测结果。在此现状下,利用可体外培养的Hu No Vs替代模型建立灵敏高效的活病毒鉴别技术,并推广至Hu No Vs中应用是近年来较为热门的研究方向。基于上述背景,本课题选取可体外培养的鼠源诺如病毒(Murine norovirus,MNV)为研究对象,旨在建立一种能监测裙带菜热加工过程中病毒失活的活病毒鉴别技术,为其后续真正应用于Hu No Vs中提供理论依据与技术基础。本论文主要研究内容及结果如下:1.利用透射电镜观察MNV衣壳蛋白在55～95℃热处理过程中的损伤情况;将MNV全基因组划分为31个核酸扩增区域,分别在受热温度与每一扩增子损失的基因滴度之间建立数学模型以得到31组扩增子的衰变速率常数(k);利用k分析MNV全基因组热损伤分布并确定其中对热高度易感的核酸区域;以标靶该区域的Long-range RT-q PCR监测不同滴度MNV在55～95℃下的热失活。结果显示:MNV经中低温(55～75℃)处理后易形成较多衣壳蛋白变性或破损程度不严重的病毒颗粒,而高温长时间(85～95℃,30 min)加热将进一步破坏MNV衣壳蛋白结构并使之形成许多小分子亚基蛋白分散于介质中;热诱导的核酸损伤在MNV全基因组中的分布存在差异,其中5’-UTR、ORF1头部(259～1147)及尾部(2873～4586)为热损伤集中区域,且4289～4586对热最为敏感(k=3.16×10 K base);靶向核酸区域4289～4586的Long-range RT-q PCR技术无法有效降低因55～95℃加热致死的MNV的基因滴度,但其排除热致死MNV核酸扩增信号的能力强于RT-q PCR。2.为进一步排除热致死病毒的Long-range RT-q PCR扩增信号,将核酸嵌入剂(pmaxx与Pt Cl)引入体系后建立了pmaxx/Pt Cl-Long-range RT-q PCR技术,并从q PCR扩增子、核酸嵌入剂使用浓度与孵育条件等多个方面对该技术展开优化;以细胞培养(TCID)结果为对照,利用优化后的pmaxx/Pt Cl-Long-range RT-q PCR技术对MNV在56、75及85℃中的热失活进行了评估。结果表明:pmaxx与Pt Cl可有效排除热致死MNV的扩增信号;在室温下将50μM pmaxx同MNV死病毒在室温(25℃)下避光孵育15 min后再光活化10 min是pmaxx的最佳作用条件;而Pt Cl的最佳使用条件为,在4℃下将2500μM Pt Cl与MNV死病毒共同孵育30 min;使用靶向长q PCR扩增子的pmaxx/Pt Cl-Long-range RT-q PCR技术有利于提高活病毒定量结果的准确度,且长度为425 bp的q PCR扩增子可使其在排除假阳性信号方面达到最优效果;该技术更适用于评估高温长时间(75～85℃,10～15 min)加热环境中的活病毒数量,但无法有效监测MNV在56℃时的热失活。3.为增强pmaxx/Pt Cl-Long-range RT-q PCR技术在食品基质中的适用性,首先于裙带菜浓缩洗脱液中测试了PMA Enhancer、Triton X-100及Tween-20对改善该技术降低死病毒基因滴度的效果;最后以此为基础,建立了能够适用于裙带菜基质的活病毒鉴别技术,并用其评估了接种于裙带菜表面MNV的热失活(75～95℃)情况。结果表明:PMA Enhancer可作为排除裙带菜基质干扰并增强核酸嵌入剂结合死病毒RNA效果的最佳辅助手段;活病毒鉴别技术pmaxx/Pt Cl-PMA Enhancer-Long-range RT-q PCR在裙带菜基质中的检测定量限可达0.31 log TCID/5 g;pmaxx-PMA Enhancer-Long-range RT-q PCR在裙带菜基质中鉴别活病毒的能力优于Pt Cl-PMA Enhancer-Long-range RT-q PCR,且前者能完全消除该基质中因75～95℃加热5 min致死的低滴度MNV(3～4 log TCID)的扩增信号;当MNV以更高滴度水平(4～5

关键词：诺如病毒活病毒热处理 pmaxx PtCl4 Long-range RT-qPCR RT-qPCR 裙带菜

快速定量检测痕量VBNC状态阪崎克罗诺杆菌的技术研究

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快速定量检测痕量VBNC状态阪崎克罗诺杆菌的技术研究

作者：吕新瑞华南农业大学

学位级别：硕士

阪崎克罗诺杆菌是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌,能导致新生儿脑膜炎和菌血症等疾病,由其引起的感染死亡率高达50%以上。已有报道表明,该菌能够在抗生素胁迫的条件下,具有进入“活的非可培养状态”（Viable but noncult... 详细信息

阪崎克罗诺杆菌是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌,能导致新生儿脑膜炎和菌血症等疾病,由其引起的感染死亡率高达50%以上。已有报道表明,该菌能够在抗生素胁迫的条件下,具有进入“活的非可培养状态”（Viable but nonculturable,VBNC）的能力。在这种状态下,病原体通常保持痕量且平板不可生长,但仍具有毒性和致病性。现有的传统的平板检测法对该状态菌的检测具有漏检和误检的缺陷。因此,建立快速、精准的定量检测方法对于该菌VBNC状态的防控具有重要意义。本文首先观察了乳制品中的阪崎克罗诺杆菌在抗生素的作用下的动态变化过程,并通过构建的微流控可视化平台,从单细胞层面对VBNC状态菌的存在进行观测和确认。在此基础之上,我们创新性的将免疫磁分离富集技术（Immunomagnetic separation,IMS）、改进的叠氮溴化丙啶（Improved propidium monoazide,pmaxx）以及微滴式数字PCR技术（Droplet digital PCR,dd PCR）相结合。针对痕量残留的VBNC阪崎克罗诺杆菌构建了集富集、染色和定量检测为一体的检测体系,实现婴幼儿配方奶粉（Powdered infant formula,PIF）中痕量VBNC阪崎克罗诺杆菌的快速精准定量检测。主要研究内容和结果如下:（1）基于微流控可视化平台对阪崎克罗诺杆菌进入VBNC状态的观测及确认。本研究以阪崎克罗诺杆菌作为实验对象,利用氨苄青霉素模拟该菌在乳及乳制品生产加工过程所处的抗生素胁迫环境,并对胁迫过程中的总菌数、活菌数以及可培养数的变化进行监测。利用微滴微流控技术构建微流控可视化平台,通过微滴中不同状态细菌间培养后浊度的差异,实现对VBNC状态菌的观测和确认。结果发现,平板法测得可培养数在第9 d时已经降至为0。在此条件下,分散在液滴中的单个菌仍然具有活性,但在液滴中丧失了繁殖能力。实验表明,在氨苄青霉素胁迫下阪崎克罗诺杆菌能够进入VBNC状态,其残留量为1%左右。前期进入VBNC状态的阪崎克罗诺杆菌为后续提供了实验对象。（2）痕量VBNC阪崎克罗诺杆菌富集体系的构建。本研究系统地考察了在PBST中最佳的抗体量、免疫磁珠剂量、孵育时间、磁分离时间和免疫反应温度等条件对捕获效率的影响,并以不同的奶制品为底物,考察了食品基质对捕获条件的影响。结果表明,在PBST溶液中当链霉亲和素磁珠与生物素化多克隆抗体偶联质量比为25:1,IMBs加入量为150μL,孵育时间为45 min,磁分离时间为5 min,反应温度为室温时IMBs捕获率大于90%。并且针对不同的食品样本,富集条件需要特定的进行优化。在PIF、脱脂奶和全脂奶粉中,免疫磁珠分别添加400μL、300μL、500μL时捕获效率达到最大值,分别为90.72%、90.35%、75.83%。孵育时间分别在75 min、60 min、75 min时捕获效率达到最大值,分别为92.21%、92.12%、80.01%。（3）定量检测技术的构建及对比研究。以阪崎克罗诺杆菌特异性基因ITS为靶基因设计并合成引物和探针,在单个完整细胞的基础上,通过对pmaxx染料作用条件以及PCR扩增条件的优化,构建了pmaxx与q PCR和dd PCR联用技术。结果表明,针对pmaxx-SIC q PCR检测技术,最佳处理浓度和光活化时间为10μM和10 min,而针对pmaxx-SIC dd PCR检测技术,最佳处理浓度和光活化时间为8μM和10 min,最佳退火温度为58℃和最佳延伸时间为1 min。此外,pmaxx-SIC dd PCR技术能够分别检出纯培养物和人工污染婴幼儿配方奶粉中低至23 CFU/m L和23 CFU/g的VBNC阪崎克罗诺杆菌,其灵敏度和准确性均高于pmaxx-SIC q PCR。同时,采用pmaxx-SIC ddPCR对240份实际婴幼儿食品样品中的阪崎克罗诺杆菌总活菌的检测中发现,传统培养法检测出6份阳性样本,pmaxx-SIC dd PCR法检测出11份阳性样本。进一步证明VBNC的存在可能导致传统的基于培养的方法低估了微生物种群的大小。（4）IMS-pmaxx-ddPCR检测技术的构建及实际应用评价。以前期建立的痕量菌的富集技术和定量检测技术为基础,以婴幼儿配方奶粉中痕量VBNC阪崎克罗诺杆菌为研究对象,进一步建立IMS-pmaxx-dd PCR定量检测方法,并考察了其相关的特异性灵敏度等。结果表明,IMS-pmaxx-dd PCR仅可特异性检出阪崎克罗诺杆菌,而其他细菌均不能被检测。经过IMBs富集后的IMS-pmaxx-dd PCR方法在VBNC阪崎克罗诺杆菌浓度为1 Log10copies/g时准确率更高。在无需前增菌的情况下,IMS-P

关键词：阪崎克罗诺杆菌活的非可培养免疫磁分离 pmaxx 定量检测

乳制品中沙门菌和金黄色葡萄球菌活菌快速检测方法的研究及食品微生物实验室的设计

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乳制品中沙门菌和金黄色葡萄球菌活菌快速检测方法的研究及食品微...

作者：赵国婧南昌大学

学位级别：硕士

乳制品是以生鲜羊乳或者牛乳作为原材料,工业加工制备出的各种食品,因其风味独特、营养丰富,在人们的饮食结构中占有重要地位。但乳制品也非常容易受到微生物的污染,活的沙门菌等食源性致病菌是污染乳制品造成人体食物中毒的主要原因,... 详细信息

乳制品是以生鲜羊乳或者牛乳作为原材料,工业加工制备出的各种食品,因其风味独特、营养丰富,在人们的饮食结构中占有重要地位。但乳制品也非常容易受到微生物的污染,活的沙门菌等食源性致病菌是污染乳制品造成人体食物中毒的主要原因,一旦人体摄入含有此类活菌的乳制品极有可能对生命健康产生极其严重的危害。对于此类活菌,传统的检测方法具有操作繁琐,成本高及耗时长等缺点,因此,建立快速有效的检测方法用于检测乳制品中活的食源性致病菌具有非常重要的意义。本研究采用改良后的叠氮溴化丙锭(Improved propidium monoazide)对待测样品进行预处理,排除死菌对活菌检测的干扰,同时结合重组酶介导的等温核酸扩增技术(Recombinase aided amplification),实现了对牛奶中活的沙门菌和金黄色葡萄球菌的快速、灵敏检测。为了能进一步实现对实际样本的快速检测,本研究在传统微生物实验室基础上进行了一定程度的改造,增加了RAA快速检测法等多种检测系统,为能进行快速筛选实验或进行确证实验提供硬件基础。本文各章节内容分述如下:第一章综述了常见致病性微生物的检测手段及其研究进展,以期为乳制品中食源性致病菌的检测提供参考。第二章研究建立了pmaxx-RAA方法检测牛奶中的沙门菌。实验结果表明:4株目的菌株具有荧光扩增信号曲线,另外其他24株非目的菌株没有荧光扩增信号曲线,该方法有较好的特异性;对pmaxx效果进行了验证,显示pmaxx对死细胞膜具有渗透性,能消除死菌DNA对后续RAA的检测影响;该方法在纯培养液中沙门菌的检测限为2.8×10CFU/m L;在加标牛奶样品中,检测限为1.8×10CFU/m L,检测时间为40 min;本研究建立的pmaxx-RAA方法实现了牛奶中活的沙门菌的快速检测。第三章研究建立了pmaxx-RAA方法检测牛奶中的金黄色葡萄球菌。实验结果表明:针对金黄色葡萄球菌的nuc基因设计的引物有较好的特异性;对pmaxx效果进行了验证,确定在最佳pmaxx浓度(20μM)下,纯培养液中金黄色葡萄球菌的检测限为7.4×10CFU/Ml;在加标牛奶样品中,富集3 h和6 h后对应的检测限分别为5.4×10CFU/m L和5.4×10CFU/m L,检测时间为20min;本研究建立的pmaxx-RAA方法为准确、快速检测牛奶中活的金黄色葡萄球菌提供了一种全新策略。第四章初步完成了一种食品微生物实验室设计方案。本章节设计的食品微生物实验室整合了传统培养法和RAA快速检测法等多种检测系统,具有能够进行快速筛选实验或进行确证实验的硬件基础,能有效的缩短检验时间,提高检测效率。本设计重点对食品微生物实验室平面布局、分区和功能、结构与装修、实验室设备基本配置等进行论述,最终能实现样品处理、微生物培养、分离鉴定、分子生物学检测等一系列功能,为微生物检测提供基础和保障。

关键词：乳制品活菌检测重组酶介导等温核酸扩增沙门菌金黄色葡萄球菌 pmaxx