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pma-qpcr技术在病毒检测中的研究进展

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PMA-qPCR技术在病毒检测中的研究进展

pma-qpcr定量检测青枯菌活菌方法的建立

ASTF2023（第五届）抗菌科学与技术论坛

作者：文霞苏皑庭黄迪张淑瑶陈漪汶谢小保广东省科学院微生物研究所广东省微生物分析检测中心华南应用微生物国家重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室

病毒检测和病毒灭活验证试验是抗病毒材料风险评估的重要组成部分,传统的观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)的方法长期以来都是病毒检测和病毒灭活验证试验的金标准,但存在诸多缺点,如耗时长、成本高、易受人为因素影响等,而且... 详细信息

病毒检测和病毒灭活验证试验是抗病毒材料风险评估的重要组成部分,传统的观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)的方法长期以来都是病毒检测和病毒灭活验证试验的金标准,但存在诸多缺点,如耗时长、成本高、易受人为因素影响等,而且有些病毒不能在宿主细胞系中培养。qpcr(quantitative PCR)技术以其特异性、敏感性和快速性成为近十年来该领域研究的热点,但是其不能区分感染性和非感染性病毒。pma(propidium monoazide)是一种含有叠氮化物基团的核酸染料,可以穿透受损的病毒衣壳,在可见光照射下与病毒核酸共价交联,pma与qpcr结合,可同时达到定量和准确检测感染性病毒与非感染性病毒核酸的目的。本文综述了pma-qpcr技术的原理以及其在病毒检测和病毒灭活验证试验中的研究进展,以期为病毒检测和病毒灭活验证试验提供可靠的参考依据。

关键词： pma-qpcr 病毒检测

来源： cnki会议评论

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植物保护 2018年第6期44卷 122-128,135页

作者：王帅徐进许景升张昊冯洁中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193

本文将叠氮溴化丙锭(pma)与荧光实时定量PCR技术相结合,建立了一种适于青枯菌不同小种菌株活细胞精准、快速检测的pma-qpcr方法。通过单因素变化试验对pma预处理反应体系中的各参数进行优化,确立了pma终浓度为15 ng/μL,黑暗孵育时间为1... 详细信息

本文将叠氮溴化丙锭(pma)与荧光实时定量PCR技术相结合,建立了一种适于青枯菌不同小种菌株活细胞精准、快速检测的pma-qpcr方法。通过单因素变化试验对pma预处理反应体系中的各参数进行优化,确立了pma终浓度为15 ng/μL,黑暗孵育时间为10 min,曝光时间为5 min的pma预处理体系。试验结果表明,当活菌比例大于10%,pma-qpcr的测定结果均在理论活菌数相对应的95%置信区间内。检测灵敏度测试结果显示,该方法适用于活菌数在5.0×10~2～5.0×10~8 cfu/mL范围内菌悬液的检测。本文建立的pma-qpcr方法可在一定范围内有效去除青枯菌死菌的干扰,定量检测出活菌数量,研究结果可为植物细菌性青枯病的流行规律研究提供新的技术支撑。

关键词： pma-qpcr 青枯菌活菌检测

黄瓜细菌性角斑病pma-qpcr检测方法的建立和应用

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生物技术通报 2016年第2期32卷 70-75页

作者：孔维文李云龙王敬琦刘婷婷陈南金一何晓青北京林业大学生物科学与技术学院北京100083 北京市植物保护站北京100029

黄瓜细菌性角斑病为黄瓜常见的一种细菌病害,其致病菌为丁香假单胞菌黄瓜致病型。目前该病在全球范围内已经造成严重的经济损失。针对于pma染料能够区分细胞死活的特性将其与荧光定量PCR技术结合。(1)通过比对分析Gen Bank中该菌种不同... 详细信息

黄瓜细菌性角斑病为黄瓜常见的一种细菌病害,其致病菌为丁香假单胞菌黄瓜致病型。目前该病在全球范围内已经造成严重的经济损失。针对于pma染料能够区分细胞死活的特性将其与荧光定量PCR技术结合。(1)通过比对分析Gen Bank中该菌种不同株的gap1基因序列,找出gap1基因的保守区并根据保守区基因序列设计了一对特异性引物Dxf1和Dxr1,以其他5种非丁香假单胞菌基因组为模板进行实时定量PCR扩增,只有丁香假单胞菌有扩增曲线,证明引物非常特异。(2)以gap1基因为目的基因构建其克隆载体,将克隆载体导入到大肠杆菌感受态细胞中进行培养,使其大量复制。再将质粒提取,以提取的质粒作为标准品,根据其浓度将其稀释为5×101-5×107 7个梯度绘制标准曲线,获得的扩增效率为96.6%,并做组内重复和组间重复,变异系数均在2%内,证明标准曲线重复性良好。(3)将构建好的方法用于实际样品的检测,得到的Ct值为27.99,根据标准曲线所得的起始模板与Ct值之间的线性关系公式,检测到100 mg患病叶片中含有的菌体为7.69×102拷贝。研究表明,该方法可以快速鉴定并检测实际样品中的活的致病菌的数量,为黄瓜细菌性角斑病的防控提供技术支持。

关键词：黄瓜细菌性角斑病 pma-qpcr 丁香假单胞菌检测有活力菌体

黄瓜白粉病的pma-qpcr方法建立及应用

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福建农林大学学报（自然科学版） 2019年第5期48卷 550-555页

作者：李金婷张佐然梁雅静孔维文李云龙何晓青北京林业大学生物科学与技术学院北京100083 北京市植物保护站北京100029

鉴于叠氮溴化丙锭(pma)染料可辨别细菌活性,将其与实时荧光定量PCR(qpcr)相结合,建立pma-qpcr方法,以检测黄瓜白粉病的活性致病菌.在黄瓜白粉菌核糖体DNA的ITS区设计引物,将扩增片段重组到pGM-Simple-T载体中构建标准质粒.以5×10-5×1... 详细信息

鉴于叠氮溴化丙锭(pma)染料可辨别细菌活性,将其与实时荧光定量PCR(qpcr)相结合,建立pma-qpcr方法,以检测黄瓜白粉病的活性致病菌.在黄瓜白粉菌核糖体DNA的ITS区设计引物,将扩增片段重组到pGM-Simple-T载体中构建标准质粒.以5×10-5×10^6个??μL^-1 6个梯度稀释质粒来绘制标准曲线,并做组内和组间重复.(1)qpcr标准曲线显示有良好的扩增结果,其相关系数(R2)为0.994.(2)利用qpcr检测臭氧处理后pma染料处理组和对照组中有活性的黄瓜白粉菌数量.结果显示,pma染料处理组拷贝数为4.335×10^2个??μL^-1,对照组拷贝数为9.448×10^6个??μL^-1.(3)利用pma-qpcr方法检测臭氧处理后的黄瓜叶片不同部位(全组织、表面、内部)活菌数占总菌数的比例,处理50 min后的活菌比例分别较处理前下降了58.8%、67.0%、48.0%.这表明该方法可快速鉴定黄瓜白粉病中的活性致病菌数量,为该病的预防和控制提供技术支持.

关键词：黄瓜白粉病 pma-qpcr 标准曲线臭氧处理

pma-qpcr方法用于监测超声波灭菌效率的适用性及其应用

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现代食品科技 2012年第4期28卷 409-411,423页

作者：李聪聪余以刚邱杨肖性龙郭毅岱华南理工大学轻工与食品学院广东广州510640 东莞出入境检验检疫局广东东莞523072

为研究pma-qpcr方法的适用性问题,本文以超声波制备膜损伤细菌,用pma-qpcr方法进行检测,并与平板计数的结果进行比较,证明该方法适用于监测超声波法灭菌率的监测。将该方法用于检测不同因素对超声波灭菌效率的影响,表明在温度和超声频... 详细信息

为研究pma-qpcr方法的适用性问题,本文以超声波制备膜损伤细菌,用pma-qpcr方法进行检测,并与平板计数的结果进行比较,证明该方法适用于监测超声波法灭菌率的监测。将该方法用于检测不同因素对超声波灭菌效率的影响,表明在温度和超声频率一定的条件下,处理时间和功率对灭菌效率的影响比较明显,而占空比对其影响较小。

关键词： pma-qpcr 超声波灭菌率

pma-qpcr定量检测畜禽肉类中食源性致病菌活菌的研究

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PMA-qPCR定量检测畜禽肉类中食源性致病菌活菌的研究

作者：於颖东华大学

学位级别：硕士

沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是两大食源性致病菌。在我国由沙门氏菌和金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件主要因食入了受污染的畜禽肉类食品为主。了解这两类食源性致病菌在畜禽肉类食品中的污染程度，获得其污染的定量数据，可为开展食品... 详细信息

沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是两大食源性致病菌。在我国由沙门氏菌和金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件主要因食入了受污染的畜禽肉类食品为主。了解这两类食源性致病菌在畜禽肉类食品中的污染程度，获得其污染的定量数据，可为开展食品安全风险评估提供重要的科学依据。本研究旨在建立可快速、有效检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的活菌定量检测方法，并初步应用于畜禽肉类食品中此类菌检测，为食品安全快速定量检测提供技术支持。叠氮丙啶（pma）作为一种与核酸具有亲和性的光敏性染料，具有活/死细胞筛选的功能。它可通过死亡细胞的细胞膜，进入细胞内，对胞内的DNA进行不可逆修饰，使其不能进行扩增;而活细胞由于细胞膜完全阻止了pma进入胞内，因此活细胞的DNA扩增不受影响。pma的选择性功能与菌属不同有关。本研究分别选取了革兰氏阴性菌（沙门氏菌）和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）各一株，分别分析了pma对两种菌活/死细胞的选择性作用。对pma作用的几个关键因素，包括曝光时间、最小抑制浓度、最大毒性浓度等进行了探索。通过实验分析，确定5分钟为适宜的曝光时间;沙门氏菌在pma15μg/ml浓度下可完全抑制死菌DNA扩增，大于40μg/ml浓度时可对活菌产生影响;金黄色葡萄球菌pma的最小抑制浓度为30μg/ml，最大毒性浓度为50μg/ml。本研究将pma与qpcr相结合，建立pma-qpcr定量检测方法，更好地发挥了qpcr快速定量的功能，且利用pma对活/死细胞具有选择性的特性，规避常规qpcr方法和培养计数法中出现假阳性和漏检的情况，开发快速准确的活菌定量检测技术。通过灵敏度和特异性分析评估pma-qpcr方法的可靠性。pma-qpcr方法最低可检出101CFU/ml沙门氏菌或金黄色葡萄球菌。本研究还设计构建了针对沙门氏菌invA基因特定序列的质粒标准品。用质粒标准品建立的qpcr标准曲线最低可检出10copies/reaction(R2=0.9979)。构建了含有金黄色葡萄球菌nuc基因特定序列的质粒作为金黄色葡萄球菌定量检测方法的标准品，所建立标准曲线R2为0.9973，可检出14copies/reaction。质粒的构建为pma-qpcr方法的稳定性提供了保证。本研究将pma-qpcr活菌定量检测方法应用于畜禽肉类食品样本，通过对人工染菌的样本进行分析，对畜禽肉类样本中的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测范围在103～108CFU/ml。与传统培养计数法进行比较分析发现，沙门氏菌活菌定量检测结果与传统培养计数法结果、金黄色葡萄球菌与纸片计数法结果均无统计学显著性差异（P>0.05）。用pma-qpcr方法检测畜禽肉类样品中活的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是对食源性致病菌活菌定量检测的一次成功尝试。pma-qpcr技术能够有效、快速地区分活菌和死菌，实现对病原菌活菌的准确定量。pma-qpcr技术还可推广至其他食源性致病菌，在食源性致病菌活菌定量检测领域将有更广阔的发展前景。

关键词： pma-qpcr 沙门氏菌金黄色葡萄球菌活菌畜禽肉类

副溶血弧菌活的非可培养状态及pma-qpcr检测技术研究

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副溶血弧菌活的非可培养状态及PMA-qPCR检测技术研究

作者：刘羽霏华南农业大学

学位级别：硕士

副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus)是一种广泛分布于海产品中的致病菌,被食用后能引起人的腹泻、呕吐等症状。它已被证实能够进入活的非可培养状态(viable but non culturable,VBNC)。VBNC状态是细菌应对外界环境压力时采取的一种自... 详细信息

副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus)是一种广泛分布于海产品中的致病菌,被食用后能引起人的腹泻、呕吐等症状。它已被证实能够进入活的非可培养状态(viable but non culturable,VBNC)。VBNC状态是细菌应对外界环境压力时采取的一种自我保护的生存机制,处于这种状态下的细菌不能通过平板培养法检测,但其仍然具有代谢活性甚至致病性,且当外界条件适宜时能被复苏成正常状态的细菌。因此,副溶血弧菌的VBNC状态的研究对食品质量检测、疾病预防控制具有重要意义。本文采用不同诱导条件诱导副溶血弧菌进入VBNC状态,并对诱导过程中的菌数变化进行监控。采用多种复苏方式对不同诱导条件下的VBNC菌进行复苏,考察诱导条件对复苏的影响以及不同复苏培养基的复苏效果。探究了生物膜形成与VBNC状态之间的联系。建立了pma-qpcr检测方法用于定量检测处于VBNC状态的副溶血弧菌。分析了副溶血弧菌的生理特性。并利用转录组和蛋白质组比较了副溶血弧菌VBNC状态和复苏状态与正常状态中的基因和蛋白的差异表达。本研究为副溶血弧菌VBNC状态的检测及其形成机制的研究提供了重要的理论方法和数据支持。研究的主要内容及结果如下:1、采用不同的温度、盐浓度和氯霉素浓度共12种条件诱导副溶血弧菌进入VBNC状态,其中7种条件下副溶血弧菌在60 d内进入了VBNC状态。采用pma-qpcr技术定量检测副溶血弧菌活菌数并计算出VBNC细胞的浓度。VBNC细胞终浓度最低为5×10 CFU/mL,最高为1.7×10 CFU/mL。此外,大蒜提取物和肉桂提取物亦能成功诱导副溶血弧菌进入VBNC状态,且比氯霉素的效率更高。2、不同诱导条件下的VBNC状态菌,对不同的复苏培养液敏感。其中4℃诱导的VBNC状态菌能被最多的培养液复苏,复苏能力最强。1%吐温80能复苏除诱导条件是2 MIC大蒜提取液以外的所有菌,复苏效果最好。利用无菌上清培养液能快速将VBNC状态菌复苏,而热处理后会对复苏效果产生影响。3、采用结晶紫染色法半定量检测VBNC诱导过程中生物膜的形成情况。研究发现,在这一过程中,菌液未进入VBNC状态的实验组比进入VBNC状态的实验组能生成更多的生物膜。比较了副溶血弧菌生物膜与浮游菌诱导VBNC状态的情况,实验证明在相同的诱导条件下,浮游菌比生物膜细菌更容易进入VBNC状态。4、基于副溶血弧菌tlh基因设计引物,优化pma处理条件(pma避光处理5 min,卤钨灯曝光15 min),建立了针对副溶血弧菌的pma-qpcr检测技术。检测范围在1.2×10至1.2×10CFU/mL。结果表明,利用pma-qpcr检测技术能够方便准确地定量监控诱导过程中活菌数的变化及VBNC状态菌的形成情况。5、利用LIVE/DEAD细胞试剂盒在荧光显微镜下区分活细胞与死细胞,以确认VBNC状态细胞的存在。将传统的CTC呼吸实验与激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞分析技术结合,采用CTC/DAPI双染法能在激光扫描共聚焦显微镜下清晰地观察到VBNC细胞表面的红色荧光,有效区分死活细胞。同时利用流式细胞仪能够根据荧光强度快速区分呼吸活性呈阴性和阳性的细胞。证实了处于VBNC状态的副溶血弧菌仍然具有呼吸活性。6、在转录组和蛋白质组水平比较分析副溶血弧菌的VBNC状态和复苏状态与正常状态中的基因和蛋白的差异表达。三组(正常与复苏,正常与VBNC,VBNC与复苏)间的总差异表达基因数为1309个。三组间总差异蛋白546个。VBNC状态的差异表达基因主要表现在代谢过程、金属离子传递、运动、刺激反应、信号传递、抗氧化、运输等;差异蛋白主要参与核糖体合成、氨基酸代谢、碳固定、脂肪酸合成与代谢等过程。复苏状态的差异表达基因主要表现在核糖体合成、蛋白质翻译、脂肪酸合成与代谢、HIF-1信号通路等过程中;差异蛋白主要作用于ABC转运子(跨膜运输)。

关键词：副溶血弧菌活的非可培养状态 pma-qpcr 生物膜转录组学蛋白组学

番茄细菌性斑点病菌pma-qpcr检测方法的建立及应用

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番茄细菌性斑点病菌PMA-qPCR检测方法的建立及应用

作者：郭威涛河南科技学院

学位级别：硕士

近年来,番茄细菌性斑点病在我国多个省份大面积发生,给当地的农民造成了严重的经济损失。本研究对引起番茄细菌性斑点病的病原菌的进行鉴定,建立了病原菌活细胞定量检测方法,并应用于病残体中病原菌活细胞的定量检测。主要的研究结果如... 详细信息

近年来,番茄细菌性斑点病在我国多个省份大面积发生,给当地的农民造成了严重的经济损失。本研究对引起番茄细菌性斑点病的病原菌的进行鉴定,建立了病原菌活细胞定量检测方法,并应用于病残体中病原菌活细胞的定量检测。主要的研究结果如下:(1)番茄细菌性斑点病病样采集及病原菌鉴定。2016至2018年,从北京、新疆、山东等蔬菜产区采集番茄细菌性斑点病疑似病害样本71份,通过致病性试验和分子生物学鉴定,明确引起番茄细菌性斑点病的病原菌为丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato,简称Pst),保存Pst菌株为55株。(2)建立了番茄细菌性斑点病菌荧光定量PCR检测体系。以Pst病菌的致病相关基因HrpZ为靶序列,设计了特异性引物Pst3F/Pst3R,特异性扩增出大小为161 bp的目的片段,建立了Pst病菌的实时荧光定量PCR检测技术体系。利用实时荧光定量PCR检测体系,检测模拟带菌种子检测下限为4.21 cfu/g种子,检测到1级发病叶片带菌量为4.15×10cfu/g叶片。对田间采集的63个番茄细菌性斑点病明显症状和疑似症状样本,分别进行了实时荧光定量PCR检测和常规分离鉴定,两种方法检测结果一致。建立的Pst实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速、准确地定量检测种子和发病组织中Pst的含量。(3)将叠氮溴化丙啶(Propidium monoazide,pma)pma与qpcr相结合,建立Pst活细胞定量检测技术。明确了pma预处理的最佳浓度为10μmol/L,最佳处理时间为黑暗孵育20 min,曝光10 min。应用pma-qpcr技术,研究了Pst在25%、50%、75%、90%等不同湿度处理条件下,处理00 d病残体中病原菌活细胞的动态变化。结果表明,空气和土壤湿度越大,病原菌死亡速度越快。90%空气和90%土壤湿度条件下处理30 d后,病残体内病原菌数目分别由初始6.43×10cfu/g、9.32×10cfu/g减少为2.30×10cfu/g和1.27×10 cfu/g,不同空气湿度和土壤湿度处理条件下,病原菌死亡速度差异不显著。本论文建立了基于pma-qpcr的Pst活细胞定量检测技术,并应用于发病组织、种子和病残体中病原菌的检测,为病害早期诊断提供一种快速检测的手段,为病害生态防治提供理论依据。

关键词：番茄细菌性斑点病 Pst 荧光定量PCR pma-qpcr 种子检测

乳品中细菌与酵母菌pma-qpcr活菌检测方法的建立

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乳品中细菌与酵母菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立

作者：盖冬雪吉林大学

学位级别：硕士

乳品中富含蛋白质、氨基酸、矿物质等多种营养成分,口感佳、易消化,深受消费者青睐。但是乳品的质量与安全问题严重制约了我国乳品行业的发展,如何保障乳品的质量与安全成为生产企业与消费者共同瞩目的焦点。微生物污染是威胁乳品安全... 详细信息

乳品中富含蛋白质、氨基酸、矿物质等多种营养成分,口感佳、易消化,深受消费者青睐。但是乳品的质量与安全问题严重制约了我国乳品行业的发展,如何保障乳品的质量与安全成为生产企业与消费者共同瞩目的焦点。微生物污染是威胁乳品安全的主要因素之一,受到微生物污染的乳品会变质、腐败、胀袋。致病微生物污染还可能会引发食物中毒,威胁消费者的健康。国标常规检测方法耗时长,不适用于乳品加工企业现代化生产模式。因此,乳品中微生物快速检测技术的研发备受乳品企业关注。本实验采用叠氮溴化丙锭(pma)结合q PCR对乳制品样品中活菌DNA进行定量,分别建立一种快速检测巴氏乳中细菌与发酵乳中酵母菌活菌总数的检测方法。首先采集广泽乳业生产的巴氏乳及发酵乳样品500份,分离巴氏乳中污染的细菌与发酵乳中污染的酵母菌,通过形态学、分子生物学与生化实验对分离得到的微生物进行鉴定。结果显示,巴氏乳中污染的细菌包括:阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、蜂房哈夫尼亚菌、阪崎肠杆菌、溶血链球菌、格式乳球菌、中间葡萄球菌、绿浅气球菌、溶血性葡萄球菌、克氏库克菌。发酵乳中酵母菌包括:马克思克鲁维酵母菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母菌、热带假丝酵母菌。分别优化不同菌种的pma处理条件,确定巴氏乳中细菌最佳pma工作浓度为15μg/m L,暗孵育时间10 min,曝光时间15 min。确定发酵乳中酵母菌最佳pma工作浓度为15μg/m L,暗孵育时间与曝光时间均为10 min。通过q PCR定量分析,分别建立细菌及酵母菌的菌浓度对数与相应Ct值的标准曲线。参照国标GB19645-2010与GB19302-2010,分别确定巴氏乳中细菌总数与发酵乳中酵母菌总数超标的参考Ct值范围。结果显示:巴氏乳奶样品中细菌浓度为105 CFU/m L的Ct范围为27.240.85;发酵乳样品中酵母菌浓度为102 CFU/m L的Ct范围为33.975.24。分别对巴氏乳与发酵乳样品进行pma-q PCR法与国标法检测,验证两种乳品中pma-q PCR活菌检测方法的准确性。巴氏乳中细菌pma-q PCR活菌检测结果与国标法符合率大于93.3%,发酵乳中酵母菌pma-q PCR活菌检测结果与国标法符合率大于86.6%,检测时间约为4 h。该方法可快速判断加工后的乳品是否合格,及时反馈检测信息,适用于乳品加工企业生产线的现场评价。

关键词：巴氏乳发酵乳细菌酵母菌活菌总数 pma-qpcr