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新LncRNA-HZ09在BPDE削弱女性滋养层细胞侵袭迁移和引发流产中的机制研究

新LncRNA-HZ09在BPDE削弱女性滋养层细胞侵袭迁移和引发流产中的...

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作者：代孟源福建医科大学

学位级别：硕士

目的苯并(a)芘(BaP)是广泛存在的环境污染物,在环境、食品、饮用水中都能被检出,具有致癌、致畸、致突变的“三致”作用,其生殖毒性也逐渐成为研究的热点。然而BaP及其代谢活化产物对女性滋养层细胞及流产的影响的研究非常少,本研究旨... 详细信息

目的苯并(a)芘(BaP)是广泛存在的环境污染物,在环境、食品、饮用水中都能被检出,具有致癌、致畸、致突变的“三致”作用,其生殖毒性也逐渐成为研究的热点。然而BaP及其代谢活化产物对女性滋养层细胞及流产的影响的研究非常少,本研究旨在揭示BaP的代谢产物BPDE诱导的女性滋养层细胞功能障碍与流产发生之间的关系及其潜在的分子机制,寻找并鉴定新lnc RNA及其调控的信号通路,探讨lnc RNA对BPDE诱发流产这一过程的调控作用,揭示环境中多环芳烃诱导女性滋养层细胞功能障碍而引发流产的调控机制,以期为流产的预防和治疗提供科学依据。方法第一部分新LncRNA的发现及功能鉴定(1)采用高通量测序技术检测BPDE暴露的滋养层细胞中转录组变化,筛选差异表达的LncRNA;(2)采用racE实验验证Lnc-HZ09的全长,FISH实验对Lnc-HZ09进行亚细胞定位;(3)采用Trans-well实验检测敲低或过表达lnc-HZ09、pld1及Hu R后的滋养层细胞的侵袭迁移能力;第二部分BPDE通过lnc-HZ09削弱滋养层细胞侵袭迁移的机制研究(1)采用RT-q PCR实验和Western blot实验检测HZ09的表达和通路相关基因表达量的变化;(2)采用RIP实验、Me RIP实验和RNA pull-down实验,检测lnc-HZ09、pld1与Hu R的相互作用,HZ09的甲基化修饰;(3)采用Ch IP实验检测pld1启动子区域与转录因子SP1,HZ09启动子区域与转录因子MSX1的结合;(4)对RM组织,采用RT-q PCR实验和Western blot实验检测lnc-HZ09的表达和通路相关基因表达量的变化。采用Ch IP实验、Me RIP实验检测转录因子与启动子区的结合,m6A甲基化修饰;(5)对BPDE暴露的滋养层细胞,采用Trans-well实验、检测滋养层细胞的迁移侵袭能力,采用RT-q PCR实验和Western blot实验检测lnc-HZ09的表达和通路相关基因表达量的变化;采用Ch IP实验、Me RIP实验检测转录因子与启动子区的结合,m6A甲基化修饰;第三部分动物模型的构建采用0、0.05、0.2 mg/kg的BaP分别灌胃构建小鼠流产模型,对流产小鼠胎盘采用RT-q PCR实验和Western blot实验检测相关通路基因表达量的变化。结果第一部分新LncRNA的发现及功能鉴定高通量测序结合RT-q PCR实验筛选出BPDE暴露后差异高表达的新lnc-HZ09,其不具有编码性,长度为366nt,在细胞质和细胞核内均有分布,且主要分布于细胞质;HZ09能明显抑制滋养层细胞的侵袭迁移能力。第二部分BPDE通过HZ09削弱滋养层细胞侵袭迁移的机制研究在滋养层细胞中,pld1能够促进下游基因rac1和cdc42的表达从而促进细胞的侵袭迁移,与HC组相比,RM组织中pld1、rac1和cdc42的表达量相对较低,而lnc-HZ09的表达量相对较高;SP1作为pld1的转录因子能够启动pld1的转录,RNA结合蛋白Hu R可与pld1的m RNA结合以维持稳定性,而lnc-HZ09可抑制SP1的表达,并与pld1的m RNA竞争结合Hu R;MSX1作为lnc-HZ09的转录因子可启动lnc-HZ09的转录,在lnc-HZ09上存在m6A RNA甲基化修饰位点,甲基化转移酶METTL3可促进lnc-HZ09 m6A甲基化修饰使其稳定性提高;在BPDE中,lnc-HZ09对pld1的调控具有与正常细胞相同的机制,且BPDE能够促进MSX1和METTL3的表达,增加lnc-HZ09的稳定性,降低pld1 m RNA的稳定性;与HC组相比,RM组织中SP1的表达量偏低,而MSX1和METTL3的表达量相对较高,且lnc-HZ09的表达量与pld1、rac1和cdc42的表达量具有明显的负相关。第三部分动物模型的构建lnc-HZ09在小鼠组织中不具有同源性;SP1、pld1、rac1和cdc42在小鼠中均具有同源性,且与对照组相比,在BaP灌胃后流产的小鼠胎盘组织中表达量明显偏低。结论在滋养层细胞中,本研究鉴定出一条新的LncRNA-HZ09,BPDE能够通过促进MSX1的表达及HZ09的m6A甲基化修饰,使HZ09的表达量异常增加,在lncHZ09的表达量增加后,SP1的表达量和pld1 m RNA稳定性明显降低,致使pld1的转录减少,且降解增加,表达水平也因此明显降低,最终削弱滋养层细胞的侵袭迁移能力,这可能与流产的发生密切相关。

关键词： BaP及BPDE 滋养层细胞 LncRNA 复发性流产环境污染 pld1/rac1/cdc42

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