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腾冲水热爆炸地热生境原核微生物pks和nrps基因多样性研究

腾冲水热爆炸地热生境原核微生物PKS和NRPS基因多样性研究

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作者：赵紫钰新乡医学院

学位级别：硕士

背景细菌耐药性已成为全球性关注的问题,与细菌产生耐药性的速率相比,新型抗生素的开发显得进展缓慢。抗生素主要来源于对土壤环境微生物活性物质的筛选,但随着人为活动对土壤环境的影响,从土壤环境中寻找新的抑菌物质变得越来越困难。... 详细信息

背景细菌耐药性已成为全球性关注的问题,与细菌产生耐药性的速率相比,新型抗生素的开发显得进展缓慢。抗生素主要来源于对土壤环境微生物活性物质的筛选,但随着人为活动对土壤环境的影响,从土壤环境中寻找新的抑菌物质变得越来越困难。近年来,越来越多的研究者将焦点放在了寻找新的生物活性化合物储存库,云南热泉生态系统因其具有高温、寡营养和低溶氧等特点,孕育了丰富而独特的高温微生物资源,能够产生功能独特的酶类以及结构新颖的生物活性物质,在医药和生物工程领域具有广泛的应用前景。因此,热泉生境是发现未知微生物及特殊功能酶类的理想生境。目的本论文采用基于16S r RNA基因的高通量测序和宏基因组测序技术结合的方式,探究云南腾冲水热爆炸地热生境微生物群落结构组成及物种多样性分析,并挖掘该生境中抗生素合成基因聚酮合酶(Polyketide Synthase,pks)和非核糖体多肽合成酶(Nonribosomal Peptide Synthetase,nrps)基因,并进行丰度与多样性分析;评价该生境采用纯培养技术进行该生境原核微生物的分离与培养,建立该生境原核微生物菌种库,并进行纯培养菌株基因组DNA中pks和nrps功能基因的扩增与克隆,获得一批功能菌株,并对这些菌株进行发酵培养、抗菌活性检测。本论文的实施,可评价该生境作为新颖生物活性物质筛选来源的可能性,并为后续进一步开展该生境中具有抗菌活性次级代谢物的发酵、分离、纯化、鉴定及应用提供菌种支持。方法以腾冲水热爆炸地热生境微生物为研究对象,通过基于16Sr RNA基因的高通量测序技术探索该生境中微生物群落结构组成并进行多样性分析;通过宏基因组测序技挖掘该生境内抗生素合成基因pks和nrps的丰度与多样性;设计分离培养基,采用纯培养技术对该生境的原核微生物进行分离、纯化、保藏及进化地位分析,并对该生境中可培养微生物多样性进行初步分析,设计pks和nrps特异性引物,选取从该生境中分离得到67株嗜热菌进行功能基因pks和nrps的扩增,获得目的片段的克隆序列,并进行系统发育分析。对上述纯培养菌株,进行发酵培养,以5种病原指示菌检测发酵浓缩液的抗菌性,筛选出具有抑菌能力的功能菌株。结果1.对云南腾冲水热爆炸3个热土样点进行16S r RNA基因扩增子测序,共获得1032条16S r RNA基因序列,784个OTU聚类结果。3个样点内门水平的优势类群为产水菌门(Aquificota),蓝细菌门(Cyanobacteria)和异常球菌门(Deinococcota)。属水平的优势类群是栖热菌属(Thermus)、热毛属(Thermocrinis)和产氢杆菌属(Hydrogenobacter)。对该生境进行宏基因组测序,注释到了61种与次级代谢有关的基因簇,其中与pks和nrps合成有关的基因簇就包含了13种,比例占到了21.3%。含有次级代谢产物基因簇前十的门类分别是假单胞菌门(Pseudomonadota)、拟杆菌门(Bacteroidota)、绿弯菌门(Chloroflexota)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)、浮霉菌门(Planctomycetota)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteriota)和异常球菌门(Deinococcota)。2.基于纯培养分离方技术从3个样点共获得170株嗜热微生物,其中包含6个候选新物种。门水平优势类群为芽孢杆菌门(Bacillota),属水平优势类群为厌氧芽孢属(Anoxy Bacillus)。对分离得到的67株细菌进行I型和II型pks和nrps基因克隆,结果表明有8株菌含有I型pks基因结构域,2株菌含有II型pks基因结构域。使用8个克隆成功的I型pks序列及宏基因组注释到的I型pks基因与数据库相似性最高的5条序列构建了系统发育树。基于系统发育树发现S1样点内pks基因多样性最高,3.对67株该生境分离得到的细菌,采用滤纸片法进行抗菌活性筛选,其中对鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)有抗菌活性的有2株,对金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)有抗菌活性的有3株。结论云南水热爆炸热泉区的3个热土样点内蕴含着丰富的含有pks和nrps嗜热原核微生物资源,这些类群是潜在的次级代谢产物的资源库。首次发现了热泉中Thermus类群中含有pks基因,且具有抑菌活性。本研究的开展可以帮助挖掘我国高温热泉内嗜热微生物资源及其次级代谢产物。

关键词：云南水热爆炸热泉微生物多样性 pks和nrps 抗菌活性

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