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南京医科大学学报（自然科学版） 2015年第5期35卷 615-621页

作者：柴浩熊新魁孙道一单文刚浦立勇俞悦成峰南京医科大学第一附属医院肝脏移植中心江苏南京210029

目的 :检测M2-型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,pkm2)在胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)组织中的表达情况,探讨pkm2下调对胆管癌细胞迁移、侵袭及增殖的影响。方法:实时定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)和免疫组织化学(immunohistoche... 详细信息

目的 :检测M2-型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,pkm2)在胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)组织中的表达情况,探讨pkm2下调对胆管癌细胞迁移、侵袭及增殖的影响。方法:实时定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)和免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色分别检测胆管癌及对应癌旁组织标本中pkm2的m RNA和蛋白表达水平。利用慢病毒表达载体系统在胆管癌细胞株Hu CCT-1、HCCC-9810中下调pkm2,分别用划痕实验、Transwell细胞侵袭实验和CCK-8比色法检测细胞迁移、侵袭及增殖能力。结果:胆管癌组织中pkm2的m RNA和蛋白表达水平明显高于对应癌旁组织。经q RT-PCR和Western blot方法证实稳定转染pkm2 sh RNA的胆管癌细胞中pkm2的m RNA和蛋白水平较对照组均明显下降(Ppkm2-NC)和正常对照组(pkm2)相比,实验组细胞(pkm2-sh RNA)的迁移、侵袭及增殖能力明显减弱,差异有统计学意义(Ppkm2表达明显高于癌旁组织,pkm2 sh RNA能有效地降低胆管癌细胞中pkm2基因的表达,pkm2基因沉默可以抑制Hu CCT-1、HCCC-9810细胞的迁移、侵袭及增殖。

关键词： shRNA干扰 pkm2基因生物学功能

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猪pkm2基因的序列分析与组织表达及亚细胞定位

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湖南农业大学学报（自然科学版） 2019年第1期45卷 68-77页

作者：赵为民涂枫方晓敏王学敏付言峰李碧侠周李生任守文江苏省农业科学院畜牧研究所江苏南京210014 农业部种养结合重点实验室江苏南京210014 江苏省农业种质资源保护与利用平台江苏南京210014

运用RT–PCR技术克隆猪pkm2基因的编码区序列,对该序列进行生物信息学分析,研究pkm2基因的组织表达及亚细胞定位。结果显示:猪pkm2基因CDS全长1 596 bp,编码531个氨基酸;预测其蛋白相对分子质量为5.79×104,等电点为7.96,含有多个磷酸... 详细信息

运用RT–PCR技术克隆猪pkm2基因的编码区序列,对该序列进行生物信息学分析,研究pkm2基因的组织表达及亚细胞定位。结果显示:猪pkm2基因CDS全长1 596 bp,编码531个氨基酸;预测其蛋白相对分子质量为5.79×104,等电点为7.96,含有多个磷酸化位点,为稳定蛋白;pkm2蛋白含有丙酮酸激酶家族的barreldomain和alpha/beta domain 2个结构域,其蛋白二级结构中α–螺旋和无规则卷曲占主要类型;猪pkm2蛋白序列在物种间非常保守,系统进化树分析表明,该蛋白与兔的亲缘关系最近;组织表达显示,猪pkm2基因在肾、小肠中相对高表达,而在肝脏与肌肉中相对低表达;亚细胞定位显示,pkm2蛋白在猪3D4/21和PK15细胞中表达于细胞质,而不表达于细胞核。

关键词：猪 pkm2基因序列分析组织表达亚细胞定位

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猪pkm2基因在肺炎支原体感染3D4/21细胞后的互作蛋白质鉴定与分析

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江苏农业学报 2019年第6期35卷 1381-1389页

作者：赵为民涂枫王丽任守文付言峰李碧侠徐小波陈哲方晓敏江苏省农业科学院畜牧研究所/江苏省农业种质资源保护与利用平台江苏南京210014 农业部种养结合重点实验室江苏南京210014

通过构建含有HA标签的pkm2过表达质粒转染3D4/21细胞,利用免疫共沉淀(Co-IP)与液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术分析与鉴定猪pkm2基因在肺炎支原体感染猪肺泡巨噬细胞3D4/21后的互作蛋白质,并对这些互作蛋白质进行GO与KEGG通路分析。结... 详细信息

通过构建含有HA标签的pkm2过表达质粒转染3D4/21细胞,利用免疫共沉淀(Co-IP)与液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术分析与鉴定猪pkm2基因在肺炎支原体感染猪肺泡巨噬细胞3D4/21后的互作蛋白质,并对这些互作蛋白质进行GO与KEGG通路分析。结果显示肺炎支原体感染3D4/21细胞后,pkm2在mRNA水平和蛋白质水平上表达上调,其表达水平呈现剂量与时间依懒性。免疫共沉淀反应结果显示IP与IgG组共鉴定到72个蛋白质,这2组鉴定到的蛋白质数分别为60和19,其中7个蛋白质在2组中同时鉴定到。GO分析结果表明IP组的互作蛋白质主要参与了NAD代谢过程、NADH代谢过程、肌原纤维组装、NADH再生和葡萄糖代谢丙酮酸等生物过程,其中大多数与能量代谢有关。KEGG pathway分析结果表明互作蛋白质参与了致病性大肠杆菌感染、军团杆菌病、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢和癌症中的中枢碳代谢等通路,这些通路与细菌感染和能量代谢有关。

关键词：猪 pkm2基因肺炎支原体互作蛋白质免疫共沉淀

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pkm2和PGM1基因调控静原鸡肌苷酸特异性沉积的功能研究

PKM2和PGM1基因调控静原鸡肌苷酸特异性沉积的功能研究

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作者：赵薇宁夏大学

学位级别：硕士

静原鸡作为《中国畜禽遗传资源目录》所列的优良地方鸡品种,其产肉量和肉质风味已成为其关注的焦点。肌苷一磷酸(Inosine monophosphate,IMP)作为嘌呤代谢的中间产物,天然存在于畜禽肌肉中,对肌肉的鲜味起着关键作用。本研究以180日龄... 详细信息

静原鸡作为《中国畜禽遗传资源目录》所列的优良地方鸡品种,其产肉量和肉质风味已成为其关注的焦点。肌苷一磷酸(Inosine monophosphate,IMP)作为嘌呤代谢的中间产物,天然存在于畜禽肌肉中,对肌肉的鲜味起着关键作用。本研究以180日龄静原鸡胸肌与腿肌为研究对象,利用课题组前期代谢组学和蛋白质组学测序数据为基础,联合分析筛选出影响静原鸡IMP特异性沉积的差异表达蛋白质和差异表达代谢物,并通过与IMP相关性分析,筛选出在肌肉组织中富集表达且差异显著的调控肉质风味的差异表达蛋白质pkm2和PGM1;构建组织表达谱及pkm2和PGM1过表达载体,并对pkm2和PGM1基因进行生物信息学分析;以静原鸡成肌细胞为体外模型,通过检测其上下游基因表达量,IMP合成途径关键基因表达水平、细胞增殖与凋亡、细胞分化,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测成肌细胞中腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)、次黄嘌呤(Hypoxanthine,HX)、IMP和尿酸(Uric acid,UA)含量。主要研究结果如下:(1)对静原鸡胸肌与腿肌进行蛋白质组学和代谢组学联合分析,发现差异表达蛋白和差异表达代谢物共同涉及了 14个代谢通路,其中嘌呤代谢通路富集的差异蛋白有AK1、AMPD1、pkm2 和 PGM1,代谢物有 Hypoxanthine、Guanosine、L-Glutamine、AICAR、AMP 和 Adenylsuccinic acid。(2)构建pkm2和PGM1基因过表达载体pcDNA3.1-pkm2和pcDNA3.1-PGM1并进行双酶切和菌液PCR验证,表明基因片段和载体重组准确,可用于后续研究。同时生物信息学分析发现,pkm2和PGM1基因分别编码530个和562个氨基酸,pkm2和PGM1编码蛋白分别有57个和77个磷酸化位点。此外,二级和三级结构进行预测发现,其蛋白结构和功能稳定。(3)通过免疫荧光法鉴定静原鸡成肌细胞纯度达90%以上;对pkm2的基因功能验证发现,pkm2促进了嘌呤代谢通路上下游基因和IMP从头合成途径关键基因表达水平,抑制了细胞分化标志基因和补救合成途径关键基因表达水平;同时,促进了成肌细胞的增殖而抑制了细胞凋亡进程;通过ELISA检测发现pkm2的高表达使ATP含量和UA含量上升,相反IMP含量和HX含量呈显著下降趋势。(4)对PGM1进行基因功能验证发现,PGM1抑制嘌呤代谢通路上下游基因和分化标志基因的表达;同时,PGM1促进IMP从头合成途径关键基因的表达,抑制补救合成途径基因的表达;促进成肌细胞的增殖而抑制细胞凋亡进程;ELISA检测发现PGM1的高表达使ATP含量和IMP含量均呈显著下降趋势,而HX和UA含量均呈显著上升趋势。综上所述,本研究初步探究了pkm2和PGM1调控静原鸡IMP特异性沉积的作用机理,对嘌呤代谢通路中pkm2和PGM1调控IMP合成途径相关基因进而影响成肌细胞的增殖、分化、凋亡以及相关代谢物进行深入研究,为静原鸡优异性状的开发与利用提供了参考资料。

关键词：静原鸡肌苷酸 pkm2基因 PGM1基因肉质风味

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