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硒代蛋氨酸调节小鼠C2C12细胞蛋白质合成的作用及信号途径

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硒代蛋氨酸调节小鼠C2C12细胞蛋白质合成的作用及信号途径

作者：李雪莹东北农业大学

学位级别：硕士

氨基酸不仅是蛋白质合成的底物,也是一类外源物信号分子,可以激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)及下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin,m TOR)信号途径,从而促进蛋白质合成。硒代蛋... 详细信息

氨基酸不仅是蛋白质合成的底物,也是一类外源物信号分子,可以激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)及下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin,m TOR)信号途径,从而促进蛋白质合成。硒代蛋氨酸(Selenomethionine,Se-Met)是一种蛋白质中含硒的氨基酸,可以作为一种低毒性、低污染、高利用率的饲料添加剂。膜联蛋白Annexin A2是一种Ca依赖性磷脂结合蛋白(Ca-dependent phospholipid binding proteins)。实验室前期研究发现,Annexin A2可接受来自氨基酸的信号刺激,并激活下游PI3K-AKT-m TOR信号途径。蛋白激酶C(protein kinase C,pkc)作为一种广泛分布于人体组织细胞中的激酶,可以激活膜联蛋白Annexin A2磷酸化。尚不清楚Se-Met是否能够调节pkc-Annexin A2信号通路,从而激活PI3K-AKT-m TOR信号途径和促进蛋白质合成。本研究拟揭示Se-Met调节小鼠成肌细胞C2C12蛋白质合成的作用及对以上相关信号通路的调节机理。本研究以体外培养的小鼠成肌细胞C2C12为研究对象。体外培养C2C12细胞,向培养液中分别添加0、25、50、75、100μM的Se-Met,Western blotting检测发现,随着Se-Met浓度的逐渐增加,Cyclin D1蛋白表达水平不断增加,在50μM处理时达到峰值,随后其表达量下降。MTT实验检测490 nm处吸光值发现,在50μM处理时吸光值达到峰值。这些结果表明Se-Met以剂量依赖性形式影响C2C12细胞增殖及细胞周期;Western blotting检测相关蛋白表达变化,发现随着Se-Met浓度的升高,m TOR磷酸化和嘌呤霉素标记的细胞总结构蛋白表达量逐渐增加,在50μM处理时达到峰值,随后蛋白表达含量逐渐降低。这些结果表明,Se-Met能够剂量依赖性的调节C2C12细胞的蛋白质合成。为揭示Se-Met调节C2C12蛋白质合成的信号通路,添加PI3K抑制剂-LY 294002抑制PI3K信号通路。Western blotting检测发现,PI3K抑制消除了Se-Met对m TOR磷酸化和细胞内总结构蛋白水平的刺激作用,表明Se-Met激活m TOR和促进蛋白合成需要PI3K的激活。向培养液中添加Se-Met同时细胞转染Annexin A2 si RNA或过表达Annexin A2、结果发现Annexin A2正向调节Se-Met对PI3K和m TOR磷酸化以及细胞总结构蛋白水平的上调作用。实验室前期质谱结果提示Annexin A2可能结合pkcα。本实验进一步研究了pkcα位于Annexin A2上游并且参与介导Se-Met调节Annexin A2表达和激活的信号通路。Co-IP(Co-Immunoprecipitation)实验证明pkcα结合Annexin A2,添加Se-Met可使二者之间结合作用更加强烈。向培养液中添加Se-Met同时细胞转染pkcαsi RNA,结果发现pkcα敲低显著抑制Se-Met对Annexin A2、PI3K和m TOR的磷酸化作用以及对细胞总结构蛋白水平的上调作用。si RNA转染实验表明pkcα介导Se-Met调节Annexin A2表达和磷酸化激活,提示pkcα可能是Annexin A2的上游激酶。这些数据表明,Se-Met通过pkcα调节Annexin A2磷酸化及其下游途径。综上所述,Se-Met能够剂量依赖性地调节C2C12细胞中Cyclin D1表达、m TOR磷酸化和总结构蛋白合成量。Se-Met通过pkcα-Annexin A2-PI3K信号通路调节以上信号途径,从而影响细胞增殖以及蛋白合成。本研究成果将为Se-Met作为饲料添加剂用于提高畜禽肌肉蛋白质产量提供理论与实验依据。

关键词：硒代蛋氨酸 PI3K Annexin A2 pkcα 蛋白合成细胞增殖

肝PC对张氏肝细胞酒精损伤的保护作用与Caveolin-1的关系

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肝PC对张氏肝细胞酒精损伤的保护作用与Caveolin-1的关系

作者：张媛辽宁师范大学

学位级别：硕士

众所周知,磷脂是构成生物膜的主要成分,摄取磷脂酰胆碱(PC)可改善膜磷脂组分,增加膜流动性和膜酶活性,提高细胞的抗氧化能力。Caveolin-1 (窖蛋白-1, Cav-1)是膜脂筏Caveolae(胞膜窖)的标记蛋白。近年发现,磷脂能够促进Caveolin-1小泡... 详细信息

众所周知,磷脂是构成生物膜的主要成分,摄取磷脂酰胆碱(PC)可改善膜磷脂组分,增加膜流动性和膜酶活性,提高细胞的抗氧化能力。Caveolin-1 (窖蛋白-1, Cav-1)是膜脂筏Caveolae(胞膜窖)的标记蛋白。近年发现,磷脂能够促进Caveolin-1小泡的形成及转运,对Caveolae结构的形成和稳定及细胞膜组装具有重要作用。本室前期工作表明,肝脏磷脂酰胆碱(肝PC)含有丰富的烯醚键,能够抵抗脂质过氧化,对小鼠急性酒精肝损伤具有明显的保护作用;同时发现,肝PC能够促进小鼠肝脏中Cav-1蛋白表达,但作用机制尚不完全清楚。本文以张氏肝细胞为对象,利用siRNA技术筛选出稳定传代的Cav-1低表达细胞株(Cav-1KD),建立酒精性肝细胞损伤模型;利用MTT、电导法和薄板层析(TLC)等技术检测酒精损伤的Cav-1KD细胞膜特性及磷脂成份变化的影响;利用Western blot技术确定肝PC预保护的酒精肝损伤细胞中氧化应激途径相关蛋白表达的变化,进一步探讨肝PC对肝细胞酒精性损伤的保护作用与Cav-1的关系,旨在了解由Cav-1蛋白在肝脏损伤修复中的作用和信号转导机制。结果如下: 1.酒精作用导致细胞中超氧化物歧化酶(SOD)水平明显降低(Ppkcα蛋白表达。结论:肝PC对张氏肝细胞酒精性损伤的保护作用与Cav-1密切相关。Cav-1表达下调导致张氏肝细胞对酒精作用的敏感性增高。肝PC可以通过改变膜磷脂成分,促进Cav-1介导的pkcα信号通路的激活,提高肝细胞膜的抗氧化能力,对抗酒精性损伤。

关键词：肝PC Caveolin-1 pkcα 酒精肝损伤保护

蛋白激酶B与蛋白激酶C在人骨性关节炎软骨组织中的表达研究

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蛋白激酶B与蛋白激酶C在人骨性关节炎软骨组织中的表达研究

作者：陈青植福建医科大学

学位级别：硕士

目的:观察并研究PKB/Akt和pkc在人膝骨性关节炎(osteoarthritis,OA)关节软骨中的表达及其与软骨细胞凋亡的相关性,探讨PKB/Akt和pkc信号分子在OA发病中的作用,为从分子水平治疗OA提供新靶点。方法:选取38例因膝骨性关节炎行膝关节置换... 详细信息

目的:观察并研究PKB/Akt和pkc在人膝骨性关节炎(osteoarthritis,OA)关节软骨中的表达及其与软骨细胞凋亡的相关性,探讨PKB/Akt和pkc信号分子在OA发病中的作用,为从分子水平治疗OA提供新靶点。方法:选取38例因膝骨性关节炎行膝关节置换的患者为实验组,以11例因意外受伤行髁上截肢手术的患者为对照组,两组均从股骨内髁负重区取软骨组织。常规HE染色和番红-O染色观察组织学形态;免疫荧光法和免疫组化法观察PKB/Akt和pkc在软骨细组织的分布;TUNEL法检测软骨细胞的凋亡状况;免疫组化法和WesternBlotting法观察关节软骨PKB/Akt、p-Akt和pkc的表达。用Image-Pro Plus 6.0和Gel pro 4.5专业图像分析软件进行定量分析。采用随机两样本t检验、配对两样本t检验、Pearson相关性检验进行统计分析。结果:①组织形态学观察:正常关节软骨组织厚度正常,浅表层表面光滑、平整,软骨细胞排列整齐,潮线完整,无细胞外基质丢失;OA关节软骨组织厚度变薄,浅表层粗糙、破溃或消失,软骨细胞排列紊乱,潮线断裂,细胞外基质严重丢失。②软骨细胞凋亡计数结果:OA软骨组织中软骨细胞的凋亡率高于正常(t=6.551,Ppkcα的表达:PKB/Akt在正常软骨组织中的表达高于在OA(t=9.848,Ppkcα在正常软骨组织中的表达低于OA(t=6.401,Ppkcα的分布:无论在正常还是在OA关节软骨组织中,PKB/Akt和pkcα主要分布在过渡层和放射层,过渡层PKB/Akt和pkcα的表达均高于放射层,其差异具有显著性,统计学数据依次为:PKB/Akt t=44.296,Ppkcαt=5.343,Ppkcαt=9.289,Ppkcα主要分布在软骨细胞的细胞浆内。结论:软骨细胞PKB/Akt表达减少,pkcα表达增加是OA软骨细胞凋亡增强的分子基础。PKB/Akt和pkcα具有临床预防和治疗OA的新靶点的潜能。

关键词：骨性关节炎软骨组织软骨细胞凋亡 PKB/Akt pkcα

PLCE1与NF-κB信号通路在哈萨克族食管癌中的相关性研究

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PLCE1与NF-κB信号通路在哈萨克族食管癌中的相关性研究

作者：庞雪莲石河子大学

学位级别：硕士

目的：检测新疆哈萨克族食管鳞癌（esophageal squamous carcinoma，ESCC）及癌旁正常组织中PLCE1、pkcα蛋白及NF-κB相关蛋白IKKβ、IKBα、p50及p65表达情况，分析其与新疆哈萨克族ESCC临床病理特征之间的关系及三者之间的相关性。 ... 详细信息

目的：检测新疆哈萨克族食管鳞癌（esophageal squamous carcinoma，ESCC）及癌旁正常组织中PLCE1、pkcα蛋白及NF-κB相关蛋白IKKβ、IKBα、p50及p65表达情况，分析其与新疆哈萨克族ESCC临床病理特征之间的关系及三者之间的相关性。方法：采用病例-对照研究的方法，选择新疆哈萨克族ESCC组织(病例组)90例和癌旁正常组织(对照组)48例，运用免疫组化Envision法和SP法检测ESCC组织中PLCE1、pkcα蛋白及NF-κB相关蛋白表达，采用χ2检验分析其在ESCC组织与癌旁正常组织中的表达是否有差异，采用χ2检验分析各蛋白表达与临床病理特征之间的关系，采用Spearman等级相关进一步分析三者之间的相关性，数据处理应用SPSS13.0软件。结果：PLCE1、pkcα、IKKβ、IKBα、p50及p65蛋白在ESCC组织中高表达率均高于癌旁正常组织，其在ESCC组织中的高表达率分别为78.96%（71/90）、45.6%(41/90）、53.3%（48/90）、40%（36/90）、81.1%（73/90）及56.7%（51/90），均高于癌旁正常组织的高表达率其分别为35.4%（17/48）、8.3%（4/48）、22.9%（11/48）、16.7%（8/48）、47.9%（23/48）及37.5%（18/48），均P＜0.05。PLCE1蛋白在ESCC有淋巴结转移90.2%（46/51）及TNM早期93.3%（28/30）、pkcα蛋白在ESCC中低分化54.7%（35/64）、IKKβ在ESCC TNM早期66.7%（40/60）与IKBα蛋白均与56.7%（17/30）、p50蛋白在ESCC有淋巴结转移88.2%（45/51）、p65蛋白在ESCC浸润深度较深70.5%（31/44）均高表达率均较高，均Ppkcα、IKKβ及p50蛋白表达呈正相关关系（pkcα：r=0.259，P=0.017;IKKβ：r=0.246，P=0.025;p50：r=0.244，P=0.024）;高表达pkcα、IKKβ及p50蛋白的食管癌组织中PLCE1蛋白的免疫组化平均评分记为（immunoreactivity score, IS）分别为（8.258±3.066，7.250±3.396，8.667±3.038）高于三者低表达PLCE1蛋白的IS（6.613±3.584，5.750±3.317，6.407±3.479）均P＜0.05。结论：（1）PLCE1、pkcα蛋白及NF-κB相关的IKKβ、IKBα、p50及p65蛋白在新疆哈族食管癌组织中高表达可能提示不良预后。（2）PLCE1与pkcα蛋白及NF-κB信号通路可能协同促进了食管癌的进展。（3）PLCE1—pkcα—NF-κB信号通路在新疆哈萨克族食管癌组织中激活，可能成为食管癌的治疗和预防分子靶标。

关键词： ESCC PLCE1 pkcα NF-κB 免疫组化病例-对照研究

N-甲基-D-天冬氨酸对视网膜视杆双极细胞的损伤作用及其机制

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N-甲基-D-天冬氨酸对视网膜视杆双极细胞的损伤作用及其机制

作者：沈雨濛武汉大学

学位级别：硕士

第一部分NMDA诱导急性青光眼模型中视网膜视杆双极细胞损伤的特征目的:研究N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）诱导小鼠急性非高眼压性青光眼模型中视网膜视杆双极细胞损伤的特征。方法:随机选取3周龄的C57BL/6J小鼠,均以... 详细信息

第一部分NMDA诱导急性青光眼模型中视网膜视杆双极细胞损伤的特征目的:研究N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）诱导小鼠急性非高眼压性青光眼模型中视网膜视杆双极细胞损伤的特征。方法:随机选取3周龄的C57BL/6J小鼠,均以右眼为实验组、左眼为对照组,玻璃体腔内分别注射浓度为10mM的NMDA,建立视网膜兴奋损伤动物模型。在整体动物水平通过视网膜电图（electroretinogram,ERG）、在组织学水平通过视网膜冰冻切片免疫荧光染色、在细胞水平通过膜片钳技术,研究NMDA对小鼠视网膜视杆双极细胞损伤的特点。结果:玻璃体腔注射NMDA24小时后,RGC数量明显减少,视杆双极细胞胞体数量及其位于内丛状层（inner plexiform layer,IPL）的树突数量急剧减少。ERG显示a波和b波的潜伏期变化不大,但b波振幅明显下降。膜片钳给药结果表明,经过NMDA处理后的小鼠视网膜视杆双极细胞,其去极化电流被完全抑制。结论:玻璃体腔内注射NMDA可诱导RGCs的显著减少和视网膜视杆双极细胞的功能损害,与急性青光眼病理损害具有相似性,是一种新的青光眼的病理特征。第二部分NMDA诱导小鼠视网膜视杆双极细胞损伤的机制研究目的:探究NMDA诱导小鼠视网膜视杆双极细胞的损伤机制方法:随机选取3周龄的C57BL/6J小鼠,将其分为三组,均以右眼为实验组、左眼为对照组,在玻璃体腔注射10mM NMDA、NMDA（10mM）+KN93（1 nM）和NMDA（10mM）+MG132（20μg/ml）后,在组织学水平通过视网膜冰冻切片免疫荧光染色,在细胞水平通过膜片钳技术,研究KN93和MG132在NMDA损伤RBC中所起的作用。用ONX0912（200nM,30mg/kg）对小鼠进行灌胃5d后,在第4天时给小鼠右眼玻璃体腔注10 mM NMDA 3 μl,之后取视网膜进行免疫荧光染色。通过在膜片钳下取出的单细胞进行聚合酶链式反应检测单个视杆双极细胞中pkc、TRPM1、Go等G蛋白信号通路相关指标的mRNA水平。分别用前房灌注和视神经钳夹两种方法造模,在相应时间取视网膜进行免疫荧光染色,观察视网膜中RBC的情况。结果:NMDA在诱导视网膜RGCs急性凋亡的同时,视杆型双极细胞内出现功能性pkcα表达量减少的现象;CaMK Ⅱ抑制剂KN93可翻转NMDA对RBC的损伤作用,蛋白酶体抑制剂MG132和ONX0912也有同样的作用。单细胞rt-PCR 检测 NMDA 实验组中 pkc、TRPM1、Gβ3、RGS7、Gβ5 的 mRNA 含量较正常组含量降低,mGluR6、Gαo、GPR179、RGS11、GDIA、GDIB、GDIG的mRNA含量较正常组含量升高,差异均具统计学意义。在前房灌注和视神经钳夹这两种青光眼模型中,也观察到了 RBC的损伤现象。结论:玻璃体腔内注射NMDA在诱导急性RGCs凋亡,并且这种损伤是通过升高或者下调G蛋白信号通路上的相关蛋白和微调蛋白实现的,可通过细胞内CaMK Ⅱ和蛋白酶体影响视杆型双极细胞的生理功能。RBC在不同的青光眼模型中的损伤现象具有一定的普遍性。

关键词：青光眼动物模型视杆双极细胞 NMDA 兴奋毒性双极细胞 pkcα 膜片钳 CaMK Ⅱ 蛋白酶体抑制剂前房灌注视神经钳夹

硫化氢通过下调MMP-11和MMP-16改善高甲状腺素诱导的大鼠心肌纤维化

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中国老年学杂志 2017年第20期37卷 4985-4987页

作者：刘盛权李琳龙俊蓉谭文婷唐芬刘茂军梁彪李子宁褚春杨军南华大学附属第一医院心内科湖南衡阳421001 南华大学附属第二医院药剂科

目的观察硫化氢(H2S)对甲状腺激素诱导的甲状腺功能亢进大鼠心肌纤维化的影响。方法通过左旋甲状腺素溶液(L-Thy,250μg/ml)腹腔注射(10 ml·kg-1·d-1)4 w,建立甲状腺功能亢进大鼠模型。以硫氢化钠(Na HS)作为外源性H2S供体,随机将40... 详细信息

目的观察硫化氢(H2S)对甲状腺激素诱导的甲状腺功能亢进大鼠心肌纤维化的影响。方法通过左旋甲状腺素溶液(L-Thy,250μg/ml)腹腔注射(10 ml·kg-1·d-1)4 w,建立甲状腺功能亢进大鼠模型。以硫氢化钠(Na HS)作为外源性H2S供体,随机将40只SD雄性大鼠等分为对照组(Control组)、模型组(L-Thy组)、H2S干预组(L-Thy+H2S组)和H2S对照组(H2S组),4 w后处死大鼠,取左室心肌组织行Masson染色观察心肌纤维化,测量胶原容积分数(CVF),Western印迹检测MMP-11、MMP-16、pkcα靶蛋白的表达。结果与Control组相比,L-Thy组心肌胶原纤维堆积明显增加,CVF增高(P0.05);与Control组相比,L-Thy组MMP-11、MMP-16表达有显著差异(P0.05)。各组之间pkcα蛋白表达没有明显差异(P>0.05)。结论 H2S可改善甲状腺激素诱导的甲状腺功能亢进大鼠心肌纤维化,其机制可能与下调MMP-11、MMP-16表达有关,但与pkcα通路无关。

关键词：甲状腺功能亢进心肌纤维化 H2S MMP-11、MMP-16 pkcα

氧化应激在阿霉素导致大鼠主动脉损伤中的作用机制研究

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氧化应激在阿霉素导致大鼠主动脉损伤中的作用机制研究

作者：谢童山西医科大学

学位级别：硕士

目的:1.研究阿霉素(doxorubicin,DOX)对大鼠主动脉血管平滑肌细胞的损伤作用及机制;2.研究氧化应激在DOX慢性给药损伤大鼠主动脉作用中的机制。方法:1.第一部分:将大鼠主动脉血管平滑肌细胞分成四组,生理盐水对照组(control组)、DOX 1/3... 详细信息

目的:1.研究阿霉素(doxorubicin,DOX)对大鼠主动脉血管平滑肌细胞的损伤作用及机制;2.研究氧化应激在DOX慢性给药损伤大鼠主动脉作用中的机制。方法:1.第一部分:将大鼠主动脉血管平滑肌细胞分成四组,生理盐水对照组(control组)、DOX 1/3 IC组(0.33μM DOX组)、DOX IC组(1μM DOX组)和DOX 4/3 IC组(1.33μM DOX组)。给药24 h后,收集细胞,检测细胞内NO、ROS、CAT和ATP含量的变化;Western Blot检测大鼠主动脉血管平滑肌细胞中总pkc、pkcα、pkcβ1、pkcβ2、p22、NOX2、eNOS、iNOS、TXNIP和pkcδ等蛋白的表达水平。2.第二部分:8周龄清洁级SD♂大鼠,体质量(300±15)g,测量血压后随机分成7组,生理盐水对照组(control):n=16,腹腔注射生理盐水1.25 mL/kg,每3天给药1次,共6次;阿霉素组(DOX组):n=16,DOX用生理盐水配成2 mg/mL溶液,按2.5 mg/kg即1.25 mL/kg剂量腹腔注射DOX,每3天给药1次,共6次;阿霉素与NADPH氧化酶抑制剂apocynin合用组(DOX+APO组):n=16,按2.5 mg/kg剂量腹腔注射DOX,每3天给药1次,共6次,按50 mg/kg剂量灌胃APO(用混合溶剂配成5 mg/mL的APO溶液),每3天灌胃2次,DOX给药当天不灌胃APO,共12次;单独NADPH氧化酶抑制剂apocynin组(APO组):n=16,按50 mg/kg剂量灌胃APO,每3天灌胃2次,在DOX组给药的同天不灌胃APO,共12次;溶剂对照组(solvent control组):n=16,按10 mL/kg剂量灌胃溶解APO的混合溶剂即10%丙二醇+2%无水乙醇+88%生理盐水,每3天灌胃2次,在DOX组给药的同天不进行灌胃,共12次;阿霉素与活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸(acetylcysteine,NAC)合用组(DOX+NAC组):n=16,按2.5 mg/kg剂量腹腔注射DOX,每3天给药1次,共6次,按100 mg/kg剂量灌胃NAC(用生理盐水配成25 mg/mL的NAC溶液),每3天灌胃2次,DOX给药当天不灌胃NAC,共12次;单独活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸组(NAC组):n=16,按100 mg/kg剂量灌胃NAC,每3天灌胃2次,在DOX组给药的同天不灌胃NAC,共12次;每次给药前将大鼠称重,根据体重调整剂量,末次给药结束后测量各组大鼠尾动脉收缩压、舒张压、平均血压以及心率,结束后按0.3 mL/100 g体重腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主动脉采血留取血样,检测血清中活性氧(ROS)、血管紧张素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、糖皮质激素、去甲肾上腺素(NA)及三磷酸腺苷(ATP)的含量;留取去除结缔组织的大鼠主动脉进行血管反应性实验,利用恒温灌流系统检测各组大鼠主动脉对KCl、PE和ACh的血管反应性;利用HE染色、Masson染色和透射电镜观察各组大鼠主动脉组织形态学的变化;采用Western Blot分析各组大鼠主动脉组织中总pkc、AT、pkcα、NOX2、p22、iNOS、eNOS和pkcδ等蛋白表达水平。结果:***能浓度和时间依赖性地降低大鼠主动脉血管平滑肌细胞的存活率,引起细胞内NO和ROS含量升高,抗氧化酶CAT活性降低,发生氧化应激损伤线粒体,导致ATP水平降低。***处理大鼠主动脉血管平滑肌细胞后,细胞内pkcα、pkcβ1、pkcβ2、p22、eNOS、iNOS和TXNIP等蛋白表达增多。***处理大鼠主动脉血管平滑肌细胞后,细胞内NOX2表达未发生明显改变,但总pkc表达水平下调,且不同剂量DOX对pkcδ表达水平有不同的影响。***慢性给药能降低大鼠舒张压,对收缩压、平均血压及心率无明显影响。***慢性给药使大鼠主动脉血管对KCl和PE的收缩反应性增高,对ACh的内皮依赖性舒张反应性降低,NADPH氧化酶抑制剂APO和活性氧抑制剂NAC干预可改善DOX给药引起的血管反应性功能障碍。***慢性给药能引起大鼠血清中Ang-Ⅱ、ROS、NO和MDA含量升高,SOD和CAT酶活力降低,导致机体发生氧化应激反应。而NADPH氧化酶抑制剂APO和活性氧抑制剂NAC干预在一定程度上能够降低Ang-Ⅱ、ROS、NO和MDA含量,部分恢复SOD和CAT酶活力。***慢性给药引起大鼠血清中糖皮质激素含量降低,对NA含量无影响,而NADPH氧化酶抑制剂APO和活性氧抑制剂NAC干预进一步降低了大鼠血清中糖皮质激素含量,对

关键词：阿霉素主动脉血管 pkcα NADPH氧化酶 NO 氧化应激

pkca/RORa介导DADS拮抗MGC803细胞Wnt/β-catenin通路

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PKCa/RORa介导DADS拮抗MGC803细胞Wnt/β-catenin通路

作者：李娟南华大学

学位级别：硕士

目的：在前期工作的基础上，进一步研究DADS对人胃癌MGC803细胞RORα磷酸化作用及机制以及pkcα/RORα介导DADS对Wnt/β-catenin通路的影响，观察DADS与RORα体内抑制MGC803细胞的效果，揭示RORα作为DADS靶点的分子机制，为胃癌的防治... 详细信息

目的：在前期工作的基础上，进一步研究DADS对人胃癌MGC803细胞RORα磷酸化作用及机制以及pkcα/RORα介导DADS对Wnt/β-catenin通路的影响，观察DADS与RORα体内抑制MGC803细胞的效果，揭示RORα作为DADS靶点的分子机制，为胃癌的防治提供理论基础。方法：体外培养人胃癌MGC803细胞，分别用DADS，pkcα激动剂TPA, pkcα抑制剂Go6976处理MGC803细胞，Western blot检测各组MGC803细胞RORα，p-RORα，pkcα，p-pkcα表达以及Wnt/β-catenin通路相关分子Axin、c-Jun、Cyclin D1、c-Myc、β-catenin、p-β-catenin表达，免疫荧光检测RORα，p-RORα，pkcα，p-pkcα蛋白的定位与表达。采用免疫共沉淀检测RORα与pkcα结合情况。分为MGC803、MGC803+DADS、RORα高表达、RORα高表达+DADS、RORα低表达、RORα高表达+DADS六组，建立MGC803细胞裸鼠移植瘤模型，定期观察各组裸鼠成瘤变化和计算抑瘤率，将移植瘤进行HE染色，用免疫组化检测Axin、c-Jun、Cyclin1D、c-Myc的表达。结果：Western blot显示，DADS与TPA处理组较未处理组RORα，p-RORα，pkcα，p-pkcα表达均明显上调（Ppkcα与RORα的结合。免疫荧光检测发现DADS及TPA处理的RORα，p-RORα，pkcα，p-pkcα核内染色均多于药物未处理组，Go6976处理组的核内染色少于较药物未处理组，而在DADS再处理Go6976组的核内染色有所增多。Western blot显示，TPA与DADS可显著降低Wnt/β-catenin通路相关基因Axin、c-Jun、CyclinD1、c-Myc蛋白表达（Ppkcα引起RORα磷酸化。3. DADS可通过pkcα/RORα介导抑制Wnt/β-catenin通路。4. DADS与RORα体内可明显抑制MGC803细胞的致瘤能力。

关键词：二烯丙基二硫人胃癌MGC803细胞维甲酸相关孤核受体α pkcα Wnt/β-catenin通路

槲皮素对断奶仔猪肠道机械屏障功能损伤的保护作用及机理探究

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槲皮素对断奶仔猪肠道机械屏障功能损伤的保护作用及机理探究

作者：陈秋雨仲恺农业工程学院

学位级别：硕士

断奶期是养猪生产过程中最关键的阶段,该阶段的健康状况将直接影响生猪的整个生长过程和养猪业的经济效益。然而早期断奶容易导致仔猪肠道屏障功能受损,进而导致生长性能下降和腹泻率提高。近年来的研究发现,槲皮素具有提高生长性能、... 详细信息

断奶期是养猪生产过程中最关键的阶段,该阶段的健康状况将直接影响生猪的整个生长过程和养猪业的经济效益。然而早期断奶容易导致仔猪肠道屏障功能受损,进而导致生长性能下降和腹泻率提高。近年来的研究发现,槲皮素具有提高生长性能、降低腹泻率的作用。本文旨在研究槲皮素对断奶仔猪肠上皮屏障功能损伤中的修复作用,并解析其发挥作用的信号通路。通过动物试验利用腹腔注射(LPS)诱导建立断奶仔猪的肠道屏障功能损伤模型,并通过日粮添加槲皮素研究其对断奶仔猪肠道上皮屏障功能的保护作用以及对pkcα/MLCK信号通路的影响;在此基础上通过TNF-α诱导IPEC-J2细胞建立肠上皮细胞屏障损伤模型,研究槲皮素保护肠上皮屏障的作用机制,并利用通路阻断剂及激动剂,抑制或激动pkcα激酶或MLCK激酶,检测两者对应的通路蛋白的表达变化以及对肠上皮紧密连接结构的影响,探究两者之间的协同作用,阐明槲皮素通过pkcα/MLCK/MLC信号通路来介导紧密连接结构,从而保护肠道上皮屏障功能。为利用槲皮素来保护仔猪肠道健康的研究提供理论依据,为营养调控仔猪断奶应激开辟一条新思路。主要研究结果如下:1.槲皮素对免疫应激仔猪肠道屏障功能的影响本试验选取体重相近、胎次相同的21日龄健康“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪48头,随机分为6组,每组8栏,每栏1头猪,即对照组(饲喂基础日粮)、0.02%槲皮素组(基础日粮中添加200 mg/kg槲皮素)、0.04%槲皮素组(基础日粮中添加400 mg/kg槲皮素)、LPS组(饲喂基础日粮,腹腔注射LPS)、LPS+0.02%槲皮素组(基础日粮中添加200 mg/kg槲皮素,注射LPS)和LPS+0.04%槲皮素组(基础日粮中添加400 mg/kg槲皮素,注射LPS)。试验为期19天。在试验的第19天清晨,给LPS组仔猪腹腔注射100μg/kg BW的LPS,对照组和槲皮素组则注射等量的生理盐水,4 h后屠宰,取样后检测。试验结果表明,1)LPS刺激显著降低了空肠绒毛高度和绒毛高度与隐窝深度的比值以及回肠的绒毛高度与隐窝深度的比值(Ppkcα/MLCK信号通路的影响在上述实验的基础上,分析日粮添加槲皮素对免疫应激仔猪肠道pkc酶活性及pkcα/MLCK信号通路相关蛋白(pkcα、p-pkc、MLCK和p-MLC)表达丰度的影响。试验结果表明:1)LPS刺激显著提高了空肠和回肠组织中的pkc蛋白激酶活性(Ppkc蛋白激酶活性(Ppkcα蛋白表达及其磷酸化水平、MLCK蛋白表达和MLC蛋白磷酸化水平(Ppkcα蛋白表达及其磷酸化水平、MLCK蛋白表达和MLC蛋白磷酸化水平(Ppkcα和MLCK蛋白激酶的相关信号通路,而日粮添加槲皮素则成功抑制了pkcα和MLCK蛋白激酶的激活,由此可见,槲皮素可能通过抑制pkcα/MLCK信号通路来调控紧密连接蛋白。***α/MLCK信号通路在槲皮素缓解肠道屏障功能损伤中的作用本试验采用Transwell细胞培养体系,利用新生仔猪空肠上皮细胞IPEC-J2具有的猪小肠上皮细胞特性来构建单层细胞模拟仔猪肠道屏障模型,采用TNF-α作为诱导剂,构建猪的肠道上皮细胞IPEC-J2屏障功能损伤模型。试验首先通过槲皮素30μmol/L预处理24 h,TNF-α50μg/m L损伤处理12 h后收集样品后检测,研究

关键词：槲皮素断奶仔猪 IPEC-J2 pkcα MLCK